Yöntem makalesi

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

11.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54218

⸱

15 Temmuz 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Bu makalede

Özet

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Özet

Mitoz organizma büyümesi ve farklılaşması için çok önemlidir. süreç son derece dinamik ve küçük bir zaman dilimi içinde uygun kromatin yoğunlaşması, mikrotübül kinetochore eki, kromozom ayrımı ve sitokinezi gerçekleştirmek için olayları sipariş gerektirir. hassas bir süreç hatalar doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere, insan hastalığı ile sonuçlanabilir. İnsan mitotik hastalık durumları araştıran geleneksel yaklaşımlar genellikle insan hastalığı okuyan zaman doğal fizyolojisini ve avantajlı gelişimsel / doku-spesifik bağlamı eksikliği hücre kültür sistemleri, güveniyor. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, bir omurgalı sisteminde kromozom dinamikleri, Zebra ile görselleştirmek için bir yol sunarak birçok engellerin üstesinden. Bu protokol detay içeren bölünen hücrelerin, dinamik görüntüler elde etmek için kullanılabilecek bir yaklaşım olacaktır: In vitro transkripsiyon, Zebra balığı yetiştiriciliği / toplama, embriyo gömme ve zaman atlamalı görüntüleme. Optimizasyon ve modifBu protokolün ications de incelenmiştir. H2A.F / Z-EGFP kullanılması ve mCherry CAAX (etiketler hücre zarı) mRNA enjekte edilmiş embriyolar, AB vahşi tip, auroraB hi1045 ve mutant zebra balığı görüntülenmiştir esco2 hi2865 mitoz (kromatin etiketler). Zebra balığı yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme bir istatistiksel mitotik kusurları ve mitotik ilerlemesi zamanlamasını ölçmek için birden fazla mitoz gözlemlemek sağlar. Buna ek olarak, yanlış (yani, congression kusurları, kromozomların missegregation, vs.) mitotik süreçleri ve yanlış kromozom sonuçları (yani, anöploidi, poliploidi, mikronuklei, vs.) tanımlayan niteliksel yönlerini gözlem görülmektedir. Bu deney, doku farklılaşması / gelişme gözlem uygulanan ve mutant zebrabalıkları ve farmakolojik maddelerin kullanımı için uygun olan edilebilir. mitoz kusurları, kanser ve gelişimsel bozukluklara olacak büyük ölçüde yol nasıl görselleştirmehastalığın patogenezinde anlayışı geliştirmek.

Giriş

Mitoz canlı bir organizmada büyümesi, farklılaşması ve rejenerasyonu için kritik bir hücresel prosesin gereklidir. Doğru hazırlanması ve interfaz DNA replikasyonu üzerine, hücre bölünmesi astarlanmalıdır. mitoz, ilk safhada, birinci faz, siklin B / CDK1 aktivasyonu ile başlatılır. Profaz kromozomlarına kromatin malzemesinin yoğunlaşma ile karakterize edilir. Nükleer zarf arıza profaz ve prometafaz arasındaki geçiş gerçekleşir. prometafaz olarak, sentrozomlar, iğ oluşumu için çekirdeklenme merkezi, kinetochore eki arama Mikrotübülleri uzatırken zıt kutuplarda göç etmeye başlar. Eki üzerine, dönüşümler mikrotübül eki-end ve gerilim kuvvetleri metafaz plakası 1 oluşturan kromozom yönlendirmek. Tüm kromozomlar doğru bağlıysa, iğ montaj kapısı, memnun olduğunu birlikte kardeş kromatidler tutan kohezinin halkaları ayrılmaktadır ve mikrotübül kardeşi çekmek için kısaltmakanafaz 2,3 sırasında zıt kutuplara kromatidler. Son aşama, telofaz, iki yeni çekirdeklerin etrafında nükleer zarfın hücre ve reform uzamasını içerir. Sitokinez iki yeni yavru hücrelere 4-6 sitoplazma ayırarak bölme işlemini tamamlar. Anahtar mitotik yollar (yani iğ montaj kontrol noktasında, sentrozom kopyalanması, kardeş kromatid uyum, vb.) Değiştirilmesi metafaz tutuklama, kromozomların missegregation ve genomik instabilite 7-10 neden olabilir. Sonuçta, yollar kontrol mitoz kusurları gelişimsel bozuklukları ve kanser, mitoz gerektiren görselleştirme ve canlı, omurgalı, çok hücreli organizma 10-16 yılında kusurlarına sebep olabilir.

Zebra balığı embriyolar nedeniyle şeffaf dokusu, mikroenjeksiyon kolaylığı ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme için büyük bir model organizma olarak hizmet vermektedir. zebrafish kullanarak, bu yazının genel amacı olancanlı 5D mitoz 17 (Şekil 1C) (X, Y, Z, saat ve dalga boyu) görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Farklı mitotik yollardaki kusurlu mutant zebrafish kullanılması bu tür arızalardan sonucu göstermektedir. Bu protokol için, Aurora B ve Esco2 mutantlar bu hataları göstermek için seçildi. Aurora B mili oluşumu ve mikrotübül bağlanma yer kromozom yolcu kompleksi (TBM) bir parçası olan bir kinazdır. Ayrıca, sitokinez 18,19 bölünme karık oluşumu için gereklidir. Zebra balığı, Aurora B eksikliği karık indüksiyon, sitokinez, ve kromozom ayrımı 20 hatalarına yol açar. Esco2, diğer taraftan, kardeş kromatid uyum 21,22 için gerekli olan bir asetiltransferaz olduğu. Böylece, metafaz-anafaz geçiş 23 de uygun kromozom ayrımı sağlamak için cohesin stabilize halkanın SMC3 kısmında cohesin acetylates. zebrabalıkları Esco2 kaybı ch yol açarromosome missegregation, erken kardeş kromatid ayrılması, genomik istikrarsızlık ve p53-bağımlı ve bağımsız apoptoz 24,25. Nedeniyle durumunu, auroraB hi1045 ve esco2 hi2865 mutant zebra balığı bu tekniği 25-27 göstermek için kullanılacaktır (bundan sonra aurB a / a ve esco2 a / a, sırasıyla şu şekilde adlandırılır).

Floresan etiketli hücre makine ile Kaplin konfokal mikroskopi mitoz 25,28,29 sırasında kromatin ve hücre zarı dinamiklerini görselleştirmek için araştırmacıların sağladı. Floresan etiketli histon tarihsel kromatin görselleştirmek için kullanılmıştır. Histonlar kromozom 30 oluşturan nükleozom yapısının sorumlu olan dört farklı çiftlerin (H2A, H2B, H3 ve H4) oluşan çekirdek proteinleridir. H2B tartışmasız floresan proteinleri en çok kullanılan histon ikenFare ve hücre kültürü, Histon 2A kullanımı Aile Z'nin (H2A.F / Z) zebrabalıkları 31,32 kullanılmak için de kanıtlamıştır. Konkanavalin A ve kasein kinaz 1-y, örneğin, hücre zarı lokalize ve daha önce deniz kestanesi ve Drosophila 33,34 hücre zarı görselleştirme etkili gösterilmiştir. Diğer çalışmalar CAAX floresan etiketli protein, hücre zarı etiketler göstermiştir ve Zebra balığı 31 başarılı oldu var. CAAX gibi farnesyltransferases ve Geranilgeraniltransferazlar gibi post-translasyonel modifiye enzimler tarafından tanınan bir motiftir. Bu enzimler tarafından değişiklikler proteinleri, hücre zarı 35 etiketleme, zara bağlı hale neden olur.

Nedeniyle zebrabalıkları önceki kullanım, bu protokol kromatin ve hücre zarı etiketlemek için H2A.F / Z ve CAAX kullanmayı seçti. Bu yöntemin uygulanması bireysel kromozom gözlemlemek için araştırmacı bireysel hücre düzeyinde mitoz izlemesini sağlayacakdinamikler, hem de aynı anda doku farklılaşması ve geliştirme etkileyebilecek birden fazla hücre bölünmeleri izlemek. Bu makale, bireysel hücre seviyesinde mitoz sırasında kromozom ayrımı dinamiklerini görüntüleme üzerinde durulacak. Bu yazının içinde, çeşitli mitoz bölünmeler gözlemlemek bölünme zamanı hesaplamak ve mitotik fenotipleri deşifre yeteneği resimli ve tartışılacaktır. Bu parametreler kullanılarak, fizyolojik ilgili veriler toplanabilir ve mitoz arızalardan etkilenen birçok hastalık durumlarıyla başvurdu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. in vitro transkripsiyon

  1. Enzim 31 sindirmek Notl kısıtlama pCS2-H2A.F / Z-EGFP ve / veya pCS2 mCherry-CAAX vektörleri Linearize. Vitro transkripsiyon kitinde bir RNA kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak, her şablonun 5 'başlıklı mRNA ürünleri oluşturur.
  2. Bir saflaştırma kiti kullanılarak şapkalı mRNA arındırın. üreticinin talimatlarına uyun. RNaz ücretsiz H2O ile Zehir
  3. bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de absorbans ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (OD 260 x seyreltme x 40 ug / ml).
  4. Her biri H2A.F / Z-EGFP ve mCherry CAAX RNase içermeyen H2O için ul / 100 ng RNA seyreltin RNA konsantrasyonu çok düşükse, flüoresan azalması veya mevcut olacaktır. Parlak örnekler fototoksisite ve photobleaching kaygıları azalacaktır. Diğer taraftan, çok RNA toksik ve / veya hedef etkilere kapalı yol açabilir.
    Not: Kalan Mağaza-80 ° C dondurucu içinde saflaştırılmış mRNA.

2. Zebra balığı Islahı, Embriyo Toplama ve mRNA Enjeksiyon 36-38

  1. iki bölgeye tankı ayırmak ve Zebra balığı tesiste kullanılan yetiştiricilik sistemi su ile her üretim tankı doldurmak için bir engel ile üreme tankları birleştirin.
  2. ıslah gece önce, zamansız ıslah önlemek diğer tarafta bariyer bir tarafında ve iki kadın balık iki erkek balık yerleştirmek için.
  3. Sonraki gün, buz üzerinde, daha önce hazırlanan mRNA'nın karışımı çözülme. tatlı su sistemi su ile üreme tanklarında su yerine ve engellerin ortadan kaldırılması. bariyerler çekti hemen sonra, 28.5 ° C bir enjeksiyon kalıp sıcak ve mikroenjeksiyon için ekipman kurmak.
    Not: enjeksiyon kalıpları hakkında bilgi için, Gerlach 36 bakınız.
  4. Bir çay süzgeci kullanılarak 15 dakika ve E ile temiz 100 x 15 mm Petri kabı içine yumurta durulama - yumurta her 10 topla3 Mavi (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 -5% metilen mavisi). E3 Mavi mantar büyümesini önlemek ve larva balık düzgün gelişimini sağlamak için kullanılır. Çiftleşme ve embriyo koleksiyonu hakkında daha fazla bilgi için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 bakın.
  5. Yerleştir tek hücreli bir ısıtılmış enjeksiyon kalıp embriyolar düzenleyerek embriyolar (Şekil 1A), istenen miktarda yumurta sarısı içine RNA enjekte edilir. Doğal embriyonik ölüm ve deney için gerekli% 15 daha fazla embriyoların üzerinde embriyonik enjeksiyonları yaparak döllenmemiş embriyolar için hesap. Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon Ek detaylar için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 başvurun.
    NOT: mRNA İlk kullanımda, önce 5D görüntüleme gerçekleştirmek için (en fazla 5 dpf'e hiçbir brüt gelişimsel kusurlar olarak tanımlanır) floresan ve canlılığı için en uygun dozu belirlemek için bir doz-eğrisi analizi gerçekleştirmek. 150-200 ng / mlembriyoların içine enjekte bu nedenle nihai konsantrasyon için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, genellikle uygun konsantrasyondur.
  6. Dikkatle değiştirilmiş 9 "cam Pasteur pipeti kullanarak kalıp enjekte embriyolar ayıklayın. Pipet değiştirmek için, bir top kıvamına gelinceye kadar bir Bunsen beki kullanarak sonuna eritin.
  7. Bir 28.5 ° C inkübatör 100 x 15 mm Petri E3 Mavi çanak ve evde enjekte edilen embriyolar yerleştirin.
  8. enjeksiyon sonrası altı saat, plakalardan herhangi bir ölü ya da döllenmemiş embriyolar kaldırmak ve temiz E3 Blue ekleyin. 28.5 ° C'de Ev embriyolar.

3. Hazırlama ve Görüntüleme için canlı balığı Embriyolar gömülmesi (Şekil 1B)

  1. İki saat görüntüleme önce, bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak GFP enjekte embriyolar ekran. E3 Blue ile yeni bir 100 x 15 mm Petri kabındaki parlak yeşil GFP ifade embriyolar yerleştirin.
  2. agaroz E3 Blue 100 ml düşük eriyik 1 g eklenerek% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz bir stok solüsyonu kaynatılır. agaroz kullandıktan sonra, alüminyum folyo ile şişesi kapağı. stok solüsyonu bir ay kadar yararlıdır kalır.
  3. Kısım 17 x 100 mm kültür tüpü içine erimiş agar 3 mi. Kullanıma hazır olana kadar bir 42 ° C su banyosunda kültür tüpü yerleştirerek agaroz sıcak tutun. Zebra balığı embriyolar 36 anestezi için deiyonize edilmiş su içinde 15 mM Tricaine çözeltisi hazırlayın.
    Not: erken zaman noktalarında görüntüleme isteniyorsa, agar konsantrasyonu% 0,3 39 kadar düşük azaltılabilir.
  4. 15 mM Tricaine, ekranlı embriyolar, düşük erime agaroz, E3 Mavi ve diseksiyon ışık mikroskobu ile 35 mm cam lamel alt kültür çanak getirin. Dikkatle 5. cımbız ile embriyonun koryon çıkarın. üç embriyo için bunu yapın.
  5. Ayrı bir kapta dechorionated embriyolar anestezi olmak yerleştirin. lamel taban kabı kapağı genellikle bu amaç için kullanılır. Bir transfer pipeti kullanarak, üç damla (yaklaşık 150 ul)kadar veya embriyolar yeterince anestezi edilmiştir (lamel alt çanak kapağı kullanıyorsanız) 5 ml E3 mavi çanak 15mM Tricaine. % 1 erimiş agaroz tüpe 15 mM Tricaine çözeltisi - (200 ul, yaklaşık 150), ek olarak, 3-4 damla ekleyin.
  6. kesilmiş pipet 1 cm olan bir P200 pipet kullanarak; Lamel tabanlı çanak anestezi embriyolar transfer. Tricaine çözüm: herhangi bir aşırı E3 Mavi çıkarın.
  7. Embriyolar yanlışlıkla birbirine yakın kayması etmemelerini sağlamak için ayrı her damla tutarak, embriyolar üzerinde Tricaine çözümü: Düşük erime agaroz 10 ul - Yavaşça 5 ekleyin.
    Uyarı: Agaroz çok sıcak ise, embriyo zarar verecektir. 42 ° C de iyi bir sıcaklık agar korumak için.
  8. 21 G 1 ½ iğne kullanarak, yavaşça istenen konuma agaroz embriyo yönlendirin. Time-lapse görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılarak zaman possib olarak lamel yakın ilgi alanları (ROI) bölgesini yönlendirmekle.
    Not: Genel amaçlar için, kuyruk bölgesi nedeniyle nispeten ince doku (Şekil 1A) için oryantasyon ve netlik kolaylığı sağlar. Bu sarısı ve fin kat çevreleyen epitel tabakası gibi diğer dokuların, 28,29 kullanılabilir. Bu dokular, ancak bu bölgeler yalnızca birkaç hücre tabakaları kalın, büyük netlik sunuyoruz. Bu protokolün amacı için, mümkün olduğunca çok sayıda hücre bölünmesi elde etmek için kuyruk bölgesi görüntü için faydalıdır.
  9. agar kısmi katılaşması için bir kaç dakika bekleyin. onun katılaşma test etmek için agar küçük bir parça parçalayın iğne kullanın. agar bir parça damla uzağa çekilebilir, bir sonraki adıma geçin.
  10. düşük erime agar gömülü embriyolar üzerinde bir kubbe oluşturan tüm lamel örtün. Ağar konfokal görüntüleme (Şekil 1A) için çanak geçmeden önce katılaşmaya izin verin.
  11. Agar katılaşma süreci (yaklaşık 10 dakika sürer) sırasında, 3 ml o hazırlamak(Yaklaşık 250 ul) 15 mM Tricaine beş damla F E3 Blue çözeltisi görüntüleme sırasında gömülü embriyolar üzerinde yerleştirilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar 40,41 4. 5D Konfokal Görüntüleme

NOT: Diğer konfokal sistemleri kullanarak 5D görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl ilgili ayrıntılar için Ariga 40 ve O'Brien 41 Bkz. Z-aralık, Z-yığının Z-derinlik, zaman aralığı, ve 5D tanımları Şekil 1C bakın.

  1. görüntüleme yazılımı açın ve 60X NA 1.4 objektife mikroskop ayarlayın. objektife daldırma yağı sürün ve mikroskop sahnede slayt tutucuya kültür çanak yerleştirin. eksen kontrolörü kullanarak, objektif lens üzerinde ilgi embriyo ortalamak ve kültür çanak karşılamak için yukarı objektif lens getirmek.
  2. Göz parça simgesine tıklayın ve mikroskop GFP filtre geçin. YG odaklanın. o lamel yakın doku üzerinde olacak OdaklamaEn iyi görüntüleme sonuçları ffer.
  3. kilidini çıkarın. (Yazılımında önceden belirlenmiş dalga boylarını) GFP ve mCherry kanalları seçmek ve normal seçeneği ortalama çizgisini ayarlayın.
  4. Kullan "Görünüm / Edinme Kontrolleri / A1 Tarama Alanı" A1 Tarama Alanı aracını açmak için komut.
  5. Taramaya başlamak. Tarama alanı mümkün olduğunca zebrafish kadar dolu, böylece eksen-denetleyici kullanarak, embriyo yerleştirin. lazer gücü, bu noktada uygun olduğu gerek yoktur. Gereksiz photobleaching önlemek için lazer gücünü azaltın.
  6. ND edinme kontrol panelini açmak için "Görünüm / Edinme Kontrolleri / ND edinimi" komutunu kullanın.
  7. Z-yığın parametrelerini ayarlamak için taramaya başlayın. Hücreler artık görünür olduğu Z-yığın hücreleri odakta olmadığı durumlarda üst sınır ve alt sınırını ayarlayın. görüntüleme alanına genişletebilir büyüme ve hücre hareketi için numune üzerinde 3 mikron alanı için izin verin. Bu pro gösterilen rakamlar Z-yığınıProtokolün embriyo kuyruk 40 mikron Z-derinlik kaplı.
  8. 2 um Z-aralık adım boyutunu ayarlamak. Ortalama olarak, hücre çapı 10 um; Bu nedenle, 2 um görüntüleme verileri beş aralıkları, her bir hücre için, analiz edilecek üretecektir.
    NOT: elde edilebilir görüntünün derinliği Z aralığına bağlıdır. Z çözünürlüğü mümkün (büyük Z-derinlik) olarak mitoz geçiren birçok hücreler olarak görüntüye için Z boyutunda genel derinlik kazanmaya kurban. Z derinliği (küçük Z-derinlik) kurban ederken ters ki, doğrudur, adım boyutunu azaltarak, Z çözünürlük, elde edilir.
  9. Görüntü lazer gücünü, HV ayarlayın ve seviyeleri ofset. Deneyler, bu protokolde gösterilmiştir için aşağıdaki lazer gücü, HV kullanabilir ve GFP kanal için sırasıyla ilgili seviyelerde belirlenen seviyeleri ofset; 5, 120 - - 2 140 ve -11 -9. MCherry kanal için, aşağıdaki lazer gücü, HV kullanın ve sırasıyla seviyeleri, ofset; 3-6, 120-140, ve -3-8. parametreleri ayarlandıktan sonra, numunenin fototoksisite ve photobleaching neden olabilir gereksiz lazer maruz kalmasını önlemek için tarama kapatın.
  10. 2x hat ortalama simgesini seçin. "Ortalama 4x hattı" büyük ölçüde tarama süresini artırırken "Hayır ortalama" bir grenli bir görüntü oluşturur. 2x hattı Ortalamanın kullanılması görüntü kalitesi ve hızlı tarama süresi sunuyor.
  11. deney için gerekli olan uygun zaman aralığı ve süreyi seçin. Vahşi tip bölümleri için, 2 saat, iki dakikalık bir zaman aralığı (Şekil 1, 2, 3A ve 3B'de kullanılan) mitotik süresinin belirlenmesi için uygundur. Daha uzun bir süre 30 dakika mili düzeneği kontrol noktasında aktive Bölümler Şekil 3C'de gösterildiği gibi floresan korumak için, dört saat süre ile, beş dakikalık aralıklarla için daha uygundur.
  12. "Dosyaya Kaydet" kutusunu işaretleyin ve edinsel ediliyor otomatik olarak dosyayı kaydetmek için dosya adı. Tüm pa Çift çeknütrisyonel parametrelerin değerlendirilerek nütrisyonel doğru ayarlanmış ve "run start" vuruluyor.
  13. iktisap tamamlandıktan sonra, üç boyutlu biçimde dosyasını görüntülemek ses eşik simgesine tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2 AB vahşi tip Zebra balığı kuyruk geniş bir alan görünümünü kullanarak birçok hücre bölünmeleri gözlemlemek yeteneği gösterir. Yedi mitotik hücreler 14 dakika süre (Film 1) 'de görüntülü. İki saat zaman Ders kapsamında, 40 mitotik olayların ele geçirildi. Ortalama olarak, 50 bölünen hücreleri AB gözlendi ve aur B a / a embriyolar (Şekil 2B) 30 bölünen hücreler. Görüntülü hücre sayısı, (Şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yöntemin kullanılması bir in vivo ve zamana bağlı bir şekilde iki yeni hücre oluşturmak için nükleer zarf arıza, mikrotübül kinetochore ekleri ile metafaz plaka oluşumunu ve kardeş kromozomlardalerde ayrımını anlaması için izin verir. Hücreler doğal fizyolojisi görüntülü çünkü zebrafish mitoz gözlemlemek yeteneği, doku floresan proteinleri kullanılabilmesi için, onlar nispeten hızlı geliştirmek ve zaman atlamalı görüntüleme sağlayan şeffaf sabit örnekleri ve hücre kültürü sistemleri üzerinden avantajlıdır el...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

pCS2-H2A.F/Z-EGFP ve pCS2-mCherry-CAAX vektörleri için Kristen Kwan'a teşekkür ederiz. Chris Rodesch'e zebra balığında canlı görüntüleme konusunda bize ders verdiği için teşekkür ederiz. UAB'deki konfokal görüntülemeye ve UAB'deki Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisine yardımcı oldukları için Shawn Williams, Erik Malarkey ve Brad Yoder'e teşekkür ederiz. Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisi, UAB Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibesi (P30CA013148) ve Romatizmal Hastalık Çekirdek Merkezi (P30 AR048311) tarafından desteklenmektedir. JMP, Ulusal Nörolojik Hastalık ve İnme Enstitüsü (NIH R21 NS092105) tarafından desteklenmektedir ve Amerikan Kanser Derneği (ACS IRG-60-001-53-IRG) ve UAB Kapsamlı Kanser Merkezi'nden (P30CA013148) pilot hibeler almaktadır. S.M.P., Hücre ve Moleküler Biyoloji T32 Eğitim Bursu (5T32GM008111-28) tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
pCS2 vektörleriK. Kwan'danİlgilenilen plazmid için
NotI-HF kısıtlama enzimiNew England BioLabsR3189SPlazmidin kısıtlama sindirimi için
mMessage SP6 kitiYaşam TeknolojileriAM1340in vitro transkripsiyonu için
RNeasy Mini kitiQiagen74104mRNA'yı saflaştırmak için
100 x 15 mm Petri kaplarıFisher ScientificFB0875712Embriyoları barındırmak için
mikroenjeksiyon kalıbıev yapımıMikroenjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için
Agarose IIAmresco0815-25GEmbriyoları gömmek için
TrikainSigma-AldrichE10521-10GEmbriyoları uyuşturmak için
Sodyum KlorürSigma-AldrichS9888Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O
Potasyum KlorürSigma-AldrichP3911içinde çözülmüş Embriyo suyu (E3 Mavi) için, UltraPure H2O içinde çözülmüş
Kalsiyum Klorür DihidratSigma-AldrichC8106Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O
Magnezyum SülfatFisher ScientificM7506 içinde çözülmüşEmbriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O
Metilen Mavisi HidratSigma-AldrichMB1içinde çözülür Embriyo suyu için (E3 Mavi), UltraPure H2O
100 mm kültür tüpüFisher Scientific50-819-812Erimiş agar için
35 mm cam lamel alt kültür kabı MatTek A.Ş. P35G-0-20-C 0, 20 mm cam, embriyoları gömmek için
#5 cımbızDumont72701-DEmbriyoların dekoryonasyonu için
21 G 1 1/2 gauge iğneBecton Dickinson305167Embriyoları agarda konumlandırmak için
Diseksiyon mikroskobuNikon AZ100Embriyoları taramak ve gömmek için, herhangi bir diseksiyon kapsamı işe yarayacaktır
Konfokal mikroskopNikon A1+Hızlandırılmış görüntüleme için
Konfokal yazılımNIS Elements AR 4.13.00Görüntü alma ve işleme için
Hediye içinde çözülür

Kaynaklar

  1. Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
  2. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  3. Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
  4. Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
  5. Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
  6. Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
  7. Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
  8. Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
  9. Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041(2012).
  10. Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206(2013).
  11. Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
  12. Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
  13. Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
  14. Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
  15. Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
  16. Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
  17. Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
  18. Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
  19. Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
  20. Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518(2009).
  21. Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
  22. Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
  23. Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
  24. Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051(2011).
  25. Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
  26. Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
  27. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  28. Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
  29. Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
  30. Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
  31. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  32. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  33. Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
  34. Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
  35. Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
  36. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943(2015).
  37. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
  38. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  39. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
  40. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
  41. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
  42. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
  43. Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
  44. Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
  45. Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
  46. Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
  47. Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  48. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
  50. Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
  51. Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
  52. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  53. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  54. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  55. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  56. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Canl G r nt lemeKonfokal MikroskopiKromozom DinamikleriH2A F Z EGFPmCherry CAAXAurora B MutantEsco2 MutantZaman Atlamal G r nt leme

İlgili makaleler