Method Article

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan In Situ ile hibridizasyon (FISH) Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarlayan dizileri gözlemlemek ve ölçmek için Caenorhabditis elegans'ın gonadında ve embriyolarında kısa bir floresan in situ hibridizasyon (FISH) prosedürü rapor ediyoruz. Telomer tekrarları ve telomerlerin alternatif uzama şablonu (TALT) olmak üzere iki farklı tekrarlayan diziyi başarıyla gözlemledik ve ölçtük.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomer, kromozomal uçları anormal füzyon ve bozulmadan koruyan bir ribonükleoprotein yapısıdır. Telomer uzunluğu, telomeraz veya telomerlerin alternatif uzatılması (ALT)1 olarak bilinen alternatif bir yol ile korunur. Son zamanlarda, C. elegans, telomer ve ALT2 çalışmaları için çok hücreli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Genomdaki tekrarlayan dizilerin görselleştirilmesi, telomerlerin biyolojisini anlamada kritik öneme sahiptir. Telomer uzunluğu, telomer kısıtlama fragmanı testi veya kantitatif PCR ile ölçülebilirken, bu yöntemler yalnızca ortalama telomer uzunluğunu sağlar. Aksine, floresan in situ hibridizasyon (FISH), hücrelerdeki bireysel telomerlerin bilgisini sağlayabilir. Burada, floresan in situ hibridizasyon ile C. elegans'ın telomer uzunluğunu belirlemek için yöntemin protokollerini ve temsili sonuçlarını sunuyoruz. Bu yöntem, morfolojide gözle görülür bir hasara neden olmayan basit ama güçlü bir yerinde prosedür sağlar. Floresan etiketli peptit nükleik asit (PNA) ve digoksigenin-dUTP işaretli prob kullanarak, iki farklı tekrarlayan diziyi görselleştirebildik: telomer tekrarları ve C. elegans embriyolarında ve gonadlarında ALT (TALT) şablonu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomer olarak anormal füzyon ve bozulma kromozomal uçları korur. Memeli telomer G bakımından zengin heksamerik tekrarlar, TTAGGG ve shelterin kompleksleri oluşur. nematodun telomer tekrar dizisi memelilerde (TTAGGC) benzer olan. Çoğu ökaryotlar kendi kromozom uçları telomer tekrarlar eklemek için telomeraz kullanmaktadır. Ancak, 10 - kanser hücrelerinin% 15 Telomerlerin (ALT) 3 Alternatif uzatma olarak bilinen telomeraz bağımsız bir mekanizma kullanmaktadır. Daha önce, telomer tekrarlar ve tAlt olarak adlandırılan ilişkili diziler, kritik sterilite 2 hayatta telomeraz mutant soylarının telomerlerin amplifiye bildirmiştir.

Telomer uzunluğu kantitatif PCR veya toplam telomerlerin 4,5,6,7 ortalama uzunluğu içerir Southern blot ile ölçülmüştür. Tüm genom dizileme verileri telomer tekrarın Oku sayısı da toplam telomer içeriğinin 8 bir göstergesidir. Sin rağmengle telomer uzunluğunun Analizi (STELA) tek bir telomer uzunluğu, bu telomerlerin 9 mekansal bilgi sağlayamaz sağlayabilir. POT-1 :: MCherry muhabiri protein in vivo telomerlerin mekansal bilgi sağlarken POT-1 proteini 10 bağlayıcı tek iplikli telomer olduğu gibi, bu çift sarmallı telomer uzunluklarını temsil edemez.

Yukarıda bahsedilen yöntemler dizilerin ortalama bilgi sağlar birlikte, in situ hibridizasyon (FISH) floresan kromozomal ölçekte miktarı ve ilgi duyulan tek tek dizilerin uzamsal desen gözlemlenebilir. Bunun yerine DNA saflaştırma, doku ya da hücre FISH nativ uzamsal bilgiler korumak için sabitlenir. Böylece, BALIK gibi telomer tekrarlar gibi bireysel tekrar dizilerinin, gözlem için bir nicel ve nitel bir araçtır.

Bu protokol, hem Telo eş zamanlı saptanması için etkili bir yöntem sağlarsadece ve diğer tekrarlar daha önce açıklanan yöntemlerden 11,12 den iyileştirmeler dayalı. C. elegans larvaları veya yetişkin yüksek farklılaşmış hücreler ile çok hücreli organizma bulunmaktadır. hücrelerin heterojen telomer noktalar sayıda kantitatif analizi engellemektedir. analiz hücrelerin sayısını arttırmak için, embriyolar izole ve FISH için polilisin ile kaplanmış dilimlerin üzerine yayılırlar. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda, bağışıklık ile kombine edilebilir.

protokol çalışan bir kanıtı olarak, biz gözlemlemek ve iki farklı tekrarlayan dizileri ölçmek mümkün olduğunu göstermektedir. TALT1 karşı DNA probu basit PCR digoksijenin-dUTP birleşmeyle ile üretilmiştir. Daha sonra, bu TALT1 probu ve floresan işaretli telomer PNA probu aynı zamanda hibridize edildi. Daha sonra, digoksigenin kanonik immünofloresan yöntem ile tespit edilmiştir. Biz burada TALT1 TRT-1'de telomer ile kolokalize temsili görüntüler sunmak kurtulanlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR ile, Digoksigenin-dUTP ile 1. etiketleme probları

  1. Daha önce tarif edildiği gibi 13 10x dNTP karışımı digoksijenin-dUTP ihtiva eden PCR etiketlenmesi.
  2. üreticinin talimatlarına uygun olarak yan kolon kromatografisi ile PCR ürünü saflaştırılır.
    1. Prob daha kısa 200 bp takdirde, reaksiyon karışımından yan sütun kromatografisi yerine spin kolon saflaştırılması serbest digoksijenin-dUTP çıkarın.

2. Hazırlama Polilisin Kaplı Slaytlar

Not: Tüm işlem yaklaşık 2 saat sürer. adımların çoğu kurutma adımı hariç, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

  1. slaytlar temizlik
    1. plastik bir kap slaytlar yerleştirin ve kısaca damıtılmış su (DW) ile slaytlar durulayın. suyu çıkarmak ve DW% 1 cam temizleyici içeren kabı doldurun.
    2. Oda sıcaklığında 50 rpm'de (RT) 15 dakika boyunca slaytlar çalkalayın. DW 3 slaytlar yıkayınOda sıcaklığında her biri 5 dakika için süre.
    3. çalkalama ile 15 dakika boyunca% 70 etanol ile slaytlar yıkayın. % 70 etanol atın ve 15 dakika için 65 ° C kuru blok ve kuru hava slaytlar yerleştirin.
  2. Çok iyi cam slaytların polilisin kaplama
    Not: boyama işlemi boyunca örnek yapışma sağlar çünkü slayt cam Polilisin kaplama, önemli bir adımdır. Kötü kaplanmış slayt örnek kaybına neden olacaktır.
    1. % 0.01 polilisin stok solüsyonu seyreltik (a / h), distile su içinde. seyreltilmiş,% 0.01 20 ul temiz bir cam slayt oyuklarına (ağırlık / hacim) polilisin ekleyin.
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca cam slayt inkübe edin.
    3. 1 saat için 65 ° C kuru blok ve kuru hava slaytlar yerleştirin.
    4. tozsuz kutuya polilisin slaytlar saklayın.

Slayt Camına Worms 3. Sabitleme (Şekil 1)

  1. FISH için hazırlanıyor embriyolar
    Not: Hasat solucanlar tüm t önceO bakteriyel gıda mikroskop altında büyüme ortamı izleyerek tüketilmektedir. Açlık erişkin solucanlar yumurta üretimini azaltır ve yumurta taramayı artırır. Ayrıntılı yöntemler, 14,15 tarif edilmiştir.
    1. Standart yöntemlere 14 göre 50 mm Petri-çanak solucanlar büyütün.
    2. tüm bakteriyel gıda tüketilen sonra spatula ile çeyrek agar ortamı kesti. bulaşmasını önlemek için kesmeden önce spatula sterilize edin.
    3. 100 mm nematod büyüme ortamı (NGM) plaka üzerinde agar tüm parçası koyun. Taze bakteriyel gıda ulaşmak için solucanlar için baş aşağı agar parça çevirin.
    4. 48 saat 72 sonra M9 tamponu ile solucanlar toplamak. NGM plaka üzerinde M9 tampon 5 ml - 3 ekleyin. NGM yüzeyinde Pipet M9 tampon solucanlar yıkayın.
    5. solucanlar sıvıyı toplamak ve 15 ml'lik bir tüpe ilave edin.
      Not:% 30 sukroz çözeltisi içinde hasat santrifüj solucanlar sonra agar bir pislik değilse. kalıntı pellet haline iken, solucanlar üzerinde yüzeryüzey.
    6. 15 ml hacmi telafi etmek M9 tampon ekleyin. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile solucanlar pelet ve M9 tampon en çıkarmak. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın.
      Not: Solucanlar hala santrifüj sonra yüzen ise, santrifüj fren seviyesi = 1 değerine ayarlayın.
    7. Aspire M9 tampon. solucanlar ağartma çözüm ekleyin. solucanlar 0.5 ml başına 5 M KOH 6,5 DW ml, hipoklorit 2 mi, 1 ml ilave edilir.
    8. 50 rpm'de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalanarak solucanlar inkübe edin. 15 saniye vorteks solucanlar mekanik solucanlar kesme ve yumurta ortaya çıkarmak.
    9. beyazlatma sırasında bir diseksiyon mikroskobu altında tüp gözlemleyin. solucanlar yarıda kesilir ve yumurta serbest olduğundan emin olun. Yetişkin vücudunda en çözülür, 15 ml hacim oluşturan M9 tampon eklemek.
    10. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Aspire M9 en ve 15 ml hacmi telafi etmek için taze M9 tampon ekleyin. Tekrarlayın yıkama adımı 3 kez.
      Not:Onlar ağartma sürecini engelleyen olarak, solucanlar aşırı miktarda kullanmaktan kaçının. az 8 dk yıkama kadar toplam reaksiyon süresini tutun. Aşırı ağartılmış yumurta güçlü otofloresans üretir.
    11. 200 ul% 2 PFA yapmak için% 4 paraformaldehid (PFA), 200 ul kadar polisorbat-20 (PBST) ile fosfat tamponlu tuzlu su ekleyin.
      Dikkat: PFA kanserojen olduğundan, PFA kullanmadan önce koruyucu giysi, eldiven ve göz maskesi kullanınız.
    12. polilizin kaplı slayt kuyusuna üzerine% 2 PFA yumurta 40 ul ekleyin.
    13. nemli bir oda içinde slaytlar yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. slaytlar içine yerleştirilir hemen sonra nemli odasına kapatın.
      Not: Sabit olurken yumurta slayt altına yerleşmek.
  2. FISH için disseke gonadlar hazırlanması
    1. Hasat yetişkin kurtlar M9 1 ml tampon pipetleme 50 mm NGM plaka üzerinde büyütülür. Bakteriyel gıda önce hasat solucanlar tükenmiş.
    2. herhangi bir bakteri zekâ solucanlar yıkayınh M9 tampon, 2 kez.
      Not: Artık bakteri polilisin kaplı slaytlar yapışmasını disseke gonadlar ile etkileşime girebilir.
    3. 300 x g santrifüj ile solucanlar Pelet. M9 çıkarın ve mikropipet ile boş NGM plaka solucanlar aktarın.
    4. polilisin tedavi slayt bir kuyunun 2 mM levamizol içeren M9 tampon 30 ul ekleyin.
    5. 1 ml tüp M9 tampon 500 ul ekle. ağız pipet ile solucanlar aktarmak için bu tampon kullanın.
    6. M9 tampon içeren 1 ml tüp bir kılcal koyarak M9 tamponu ile ağız pipet ucu doldurun.
    7. Solucanların kafa ağız pipet girer, böylece diseksiyon mikroskobu altında, sadece yetişkin solucan ve sürükleme ağız pipet başın önünde ağız pipet ucu koydu. Solucanların baş ucu girdiğinde, solucanın tüm vücut ucu içine çekilecektir.
    8. ağız pipet kullanarak polilisin kaplı slayt solucanlar aktarın.
    9. kesmek, bir jilet kullanarakkafa veya slaytta solucanlar kuyruk ucu f. solucan kesildiğinde, gonadlar dışarı çıkacaktır. Gonadlar slaytlar sopa olacak.
      1. bir kuyuda en az 30 solucanlar hazırlayın. Daha fazla kuyu bir 30 solucanlar için kullanılabilir.
    10. Nemli odasında slayt koymak ve ağız pipet ile M9 tampon aspire.
    11. nemli odada 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 2 PFA 20 ul ekleyerek örnek sabitleyin.

4. Sabitleme ve Permeabilization

  1. kuru buz üzerinde bir alüminyum blok yerleştirin ve derin dondurucuda saklayın (-80 ° C). -20 ° C'de saklayın, metanol ve aseton.
  2. PFA fiksasyon adımı 3.1.15 veya 3.2.11 sonra ~ sabitleştirici 5 ul mikropipet bırakarak kullanarak fiksatif kaldırın.
  3. Örnek slaytta başka polilisin kaplı slayt koyun. çözüm aşırı ise kağıt havluyla Fiksatif çıkarın. Onlar araya sıkışmış bir kez slaytlar hareket ettirmeyin.
  4. slaytlar FreezeEn az 15 dakika süreyle alüminyum bloğunun üzerine.
    Not: Örnekler, en az 2 saklanabilir - 3 gün.
  5. slaytlar dondurulmuş edilirken, buz üzerinde soğuk metanol ve aseton içeren kavanoz koydu.
  6. slaytlar almak ve örnek dondurarak çatlamak bükün. Üst slayt atın. Hemen 5 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol içine slayt ıslatın.
  7. 5 dakika boyunca buz soğukluğunda aseton slaytlar aktarın.
  8. Kalıntı fiksatif kaldırmak için 5 dakika boyunca slaytlar PBST ile 3 kez yıkayın. Bir sonraki adıma geçin ya da 4 ° C'de% 100 etanol slaytlar saklayın.
    Not: Örnekler, en az 2 saklanabilir - 3 gün.

Sabit Hücre 5. Melezleme

  1. (PBST 10 ug / ml RNase A ihtiva eden) RNaz çözeltisi 20 ul ekle. 1 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir oda içinde slayt inkübe edin.
  2. polisorbat-20 (2x SSCT) her biri 15 dakika için 2x tuzlu su ve sodyum sitrat iki slayt yıkayın.
  3. 20 eklemelezleştirme çözeltisi ul ve 37 ° C inkübatör nemli odasına koyun. 1 saat sonra, pipetleme hibridizasyon çözeltisi çıkarın.
  4. hibridizasyon çözüm çıkarmadan önce, probu hazırlamak. Prob, çift sarmallı DNA'dır, kuru bir blok üzerinde 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtılarak probları denatüre. ısıtıldıktan sonra, buz kısaca probu serin.
  5. örnek probları içeren hibridizasyon çözeltisi 10 ul ekle. 2,000 DIG etiketli prob için, 1 bir oranda kullanım kesafeti: 200 PNA probu, 1 oranında kullanımı konsantrasyonu için. cam kapak ile örnek örtün.
  6. ısı bloğu (80 ° C) su ile ıslatılmış kağıt havlu koyun. nem ve sıcaklık korumak için ısı bloğu üzerinde plastik bir kutu kapağını takın.
  7. ısıtma bloğu sıcaklığı (80 ° C) stabil hale sonra ısıtılmış bir kağıt havlu üzerine Örnek slayt yerleştirin ve plastik kutu kapağı örnekleri kapsamaktadır. 3 dakika boyunca numune denatüre.
  8. incgece boyunca 37 ° C'de nemli bir oda içinde slaytlar Ubate.

6. yıkar ve İmmünofloresan

  1. 37 ° C hibridizasyon yıkama solüsyonu (2X SSC,% 50 formamid) ısıtın.
  2. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında iki kez PBST içinde örnek yıkayın. cam kapak çıkarın.
  3. 30 dakika boyunca 37 ° C'de hibridizasyon yıkama çözeltisi içinde örnek yıkayın.
  4. 3 kez oda sıcaklığında PBST içinde Örnek slayt yıkayın. Not: oda sıcaklığında nemli odasında sonraki tüm adımları uygulayın.
  5. Bloke etme çözeltisinin 20 ul ekle ve nemli oda içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  6. bloke etme çözeltisi çıkarın ve FITC ile birleşik anti-digoksigenin antikor çözeltisi (1: 200) ekleyin, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de 3 saat karıştırıldı.

7. Montaj ve Gözlem

  1. 15 dakika her biri için PBST ile 2 kez örnek slayt yıkayın.
  2. DAPI ile montaj çözümü 10 ul ekle. nazikçe cam kapak ve basın koyun. herhangi bir fazla çözeltiyiBir kağıt havlu ile.
  3. montaj çözümü buharlaşmasını önlemek için, oje ile kapak cam kenarları mühür.
  4. konfokal mikroskop altında uyun. yüksek arka plan ile embriyolar hariç. 20 çekirdekleri - 4 sahip bir alan üzerinde odaklanın.
  5. 100X objektif lens ile üreticinin talimatlarına göre fotoğraf çekmek.
    Not: FITC için 488 nm lazer ile Cy3 için 555 nm lazer ile, DAPI için 405 nm lazer ile örnek Excite.

Telomer Sinyal 8. sayısallaştırılması

Not: Daha önce 16 açıklandığı gibi Kantitasyonu yapıldı. karşılaştırılacak olan tüm resimler maruz kalma süresi ve ışık kaynağı içeren aynı ortamda alınmalıdır.

  1. tif formatında görüntü vermek.
  2. Indirin ve görüntü analiz yazılımı yükleyin.
  3. Görüntü analiz yazılımı çalıştırın ve düğmeyi katılıyorum tıklayın.
  4. Açık düğmesine tıklayın. görüntü dosyasını çift tıklatarak telomer FISH ile görüntüleri açın.
  5. tıklayın[Değiştir] - [select işleme bölge], sol-tıklayın ve sürükleyerek ilgi seçin bölgesi. Non-spesifik boyama hariç.
  6. [Optik yoğunlukları nokta] telomer sinyali ile kanalı seçin ve .txt dosyasına sonuçları kaydetmek için dosya adını girin - [tedbiri] tıklayın.
    Not: sonuçların sütun aşağıdaki sırayla şunlardır: spot Floresan, spot ve nokta alanının arka plan yoğunluğu.
  7. değerleri kopyalamak ve spot floresan gelen spot arka plan yoğunluğu çıkarın. değerleri artık istatistiksel analiz edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce ALT kurtulan içten 'ALT Şablon' (tAlt) telomer bakım 2 dizileri lokalize çoğaltarak düşük frekansta, trt-1 (ok410), telomeraz eksikliği mutant ortaya çıkabileceği bildirildi. PNA probu kullanılarak, biz disseke gonadlar (Şekil 2A) 'de telomer görselleştirmek için başardık. Soluk telomer sinyali TRT-1 (ok410) ve ALT kurtulan hem de tespit edildi. Bulanık sinyal onlar otofloresans olmayabilir düşündüren, sadece DAPI ile üst üste edild...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolde ana avantajı, hücresel yapının morfolojisine fark zarar vermeden prosedür basitliğidir. Birkaç adım C için optimize edildi Bu protokolde elegans BALIK. Başarılı FISH için kritik adımlar probların etiketleme, embriyo ve penetrasyon tespit sayılabilir. Digoksigenin dUTP etiketleme yöntemi PCR ya da nik-çevirisi ile kolay kullanımlı etiketleme yöntemi temin etmektedir. Uzun hedef dizisi etiketlemek için, nick-çeviri tercih edilir. Bu durumda, sondalar sondaların sızmasını kolaylaştırmak için uy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutant solucan suşları, Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından nazikçe sağlandı. Bu araştırma, Kore Cumhuriyeti Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nin bir hibesi ile desteklenmiştir (hibe numarası: HI14C1277).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PNA probuPANAGENEözel sipariş
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab parçalarıRoche11207741910
Sığır serum albüminiSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehitSIGMA-ALDRICHP-6148'deseyreltilmiş 1:200 kullanınbirkaç damla NaOH ile DW'de ısıtarak% 4 paraformaldehit hazırlayın. 0.1 hacim 10x PBS ekleyin.
VectashieldVektör LaboratuvarlarıH-1200
Hibridizasyon çözeltisi3x SSC, %50 formamid, %10 (a/h) dekstran sülfat, 50 &# 956; g/ml heparin, 100 &# 956; g/ml maya tRNA'sı , 100 &# 956; g / ml sonikasyonlu somon sperm DNA
Hibridizasyon yıkama çözeltisi2x SSC,% 50 formamid
FormamidBIONEERC-9012toksik
MetanolCarlo Erba
AsetonCarlo Erba
HeparinSIGMA-ALDRICHH3393stok çözeltisi için 10 mg / ml yapmak
Dekstran sülfatSIGMA-ALDRICH67578
10x PBS1 L DW için: 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4• 7H2O, 2,4 g KH2PO
PBST1x PBS, %0,1 ara-20
Polisorbat 20SIGMA-ALDRICHP-2287Ticari adı Tween-20'dir
Poli-L-Lizin çözeltisi (%0,1 a/h)SIGMA-ALDRICHP-8920kullanmadan önce %0,01 w/v solüsyon hazırlar
M93 g KH2< / sub>PO4< / sub>, 6 g Na2< / sub>HPO4< / sub>, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4< / sub>, H2< / sub>O ila 1 L
Ağartma çözeltisi% 20 sodyum hipoklorit, 0.5 M KOH
Antikor tamponu1x PBST, 1 mM EDTA, %0.1 BSA, %0.05 Sodyum azid (toksik)
Bloke edici çözelti%5 sığır serum albümini (BSA) içeren antikor tamponu)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSC1 L, 175.3 g NaCl, 88.2 g sodyum sitrat, H2O ila 1 L yapmak için, pH'ı 7.0'a ayarlayın
2x SSCT2x SSC, %0.1 ara-20
10x digoksigenin-dUTP karışımı1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR saflaştırma kolonlarıCosmo genetechCMR0112
Cam temizleyici / ULTRA CLEANDukssan saf kimyasallar8AV721
Çok kuyulu cam slaytMP biyomedikal
Nematod büyüme ortamı1 L, 3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g pepton, H2O ila 974 ml yapmak için. Şişeyi otoklavlayın ve soğutun. Etanolde 1 ml 1 M CaCl2< / sub>, 1 ml 4 mg / ml kolesterol, 1 ml 1 M MgSO4< / sub>, 25 ml 1 M KPO4< / sub> ekleyin.
levamisolSIGMA-ALDRICH196142
RazorFeatherbıçak No. 11
Rnase AEnzimomik
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Konfokal mikrosop,ZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X kullanıldı.
Nem odasıYazılımı'na batırılmış kağıt havluyla doldurulmuş plastik kutu
 Dr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502
PBST Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910 . , 96041205Objektif lens olarak DW Görüntü Analiz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189(2015).
  3. Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
  4. Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
  5. Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).
  6. Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30(2005).
  7. Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).
  8. Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
  9. Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
  10. Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
  11. Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
  12. Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
  13. Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790(1991).
  14. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  15. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019(2012).
  16. Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
  17. Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
  18. Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
  19. Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
  20. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere FISHPNA ProbesC elegansFluorescence In Situ HybridizationTelomere LengthAlternative Lengthening of TelomeresTelomere QuantificationFluorescent MicroscopyProbe HybridizationAntibody Staining

Related Articles