Method Article

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan In Situ ile hibridizasyon (FISH) Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/54224

⸱

August 4th, 2016

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarlayan dizileri gözlemlemek ve ölçmek için Caenorhabditis elegans'ın gonadında ve embriyolarında kısa bir floresan in situ hibridizasyon (FISH) prosedürü rapor ediyoruz. Telomer tekrarları ve telomerlerin alternatif uzama şablonu (TALT) olmak üzere iki farklı tekrarlayan diziyi başarıyla gözlemledik ve ölçtük.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomer, kromozomal uçları anormal füzyon ve bozulmadan koruyan bir ribonükleoprotein yapısıdır. Telomer uzunluğu, telomeraz veya telomerlerin alternatif uzatılması (ALT)1 olarak bilinen alternatif bir yol ile korunur. Son zamanlarda, C. elegans, telomer ve ALT2 çalışmaları için çok hücreli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Genomdaki tekrarlayan dizilerin görselleştirilmesi, telomerlerin biyolojisini anlamada kritik öneme sahiptir. Telomer uzunluğu, telomer kısıtlama fragmanı testi veya kantitatif PCR ile ölçülebilirken, bu yöntemler yalnızca ortalama telomer uzunluğunu sağlar. Aksine, floresan in situ hibridizasyon (FISH), hücrelerdeki bireysel telomerlerin bilgisini sağlayabilir. Burada, floresan in situ hibridizasyon ile C. elegans'ın telomer uzunluğunu belirlemek için yöntemin protokollerini ve temsili sonuçlarını sunuyoruz. Bu yöntem, morfolojide gözle görülür bir hasara neden olmayan basit ama güçlü bir yerinde prosedür sağlar. Floresan etiketli peptit nükleik asit (PNA) ve digoksigenin-dUTP işaretli prob kullanarak, iki farklı tekrarlayan diziyi görselleştirebildik: telomer tekrarları ve C. elegans embriyolarında ve gonadlarında ALT (TALT) şablonu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomer olarak anormal füzyon ve bozulma kromozomal uçları korur. Memeli telomer G bakımından zengin heksamerik tekrarlar, TTAGGG ve shelterin kompleksleri oluşur. nematodun telomer tekrar dizisi memelilerde (TTAGGC) benzer olan. Çoğu ökaryotlar kendi kromozom uçları telomer tekrarlar eklemek için telomeraz kullanmaktadır. Ancak, 10 - kanser hücrelerinin% 15 Telomerlerin (ALT) 3 Alternatif uzatma olarak bilinen telomeraz bağımsız bir mekanizma kullanmaktadır. Daha önce, telomer tekrarlar ve tAlt olarak adlandırılan ilişkili diziler, kritik sterilite 2 hayatta telomeraz mutant soylarının telomerlerin amplifiye bildirmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR ile, Digoksigenin-dUTP ile 1. etiketleme probları

  1. Daha önce tarif edildiği gibi 13 10x dNTP karışımı digoksijenin-dUTP ihtiva eden PCR etiketlenmesi.
  2. üreticinin talimatlarına uygun olarak yan kolon kromatografisi ile PCR ürünü saflaştırılır.
    1. Prob daha kısa 200 bp takdirde, reaksiyon karışımından yan sütun kromatografisi yerine spin kolon saflaştırılması serbest digoksijenin-dUTP çıkarın.

2. Hazırlama Polilisin Kaplı Slaytlar

Not: Tüm işlem yaklaşık 2 saat sürer. adımların çoğu kurutma adımı hariç, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

  1. slaytlar temizlik
    1. p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce ALT kurtulan içten 'ALT Şablon' (tAlt) telomer bakım 2 dizileri lokalize çoğaltarak düşük frekansta, trt-1 (ok410), telomeraz eksikliği mutant ortaya çıkabileceği bildirildi. PNA probu kullanılarak, biz disseke gonadlar (Şekil 2A) 'de telomer görselleştirmek için başardık. Soluk telomer sinyali TRT-1 (ok410) ve ALT kurtulan hem de tespit edildi. Bulanık sinyal onlar otofloresans olmayabilir düşündüren, sadece DAPI ile üst üste edild.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolde ana avantajı, hücresel yapının morfolojisine fark zarar vermeden prosedür basitliğidir. Birkaç adım C için optimize edildi Bu protokolde elegans BALIK. Başarılı FISH için kritik adımlar probların etiketleme, embriyo ve penetrasyon tespit sayılabilir. Digoksigenin dUTP etiketleme yöntemi PCR ya da nik-çevirisi ile kolay kullanımlı etiketleme yöntemi temin etmektedir. Uzun hedef dizisi etiketlemek için, nick-çeviri tercih edilir. Bu durumda, sondalar sondaların sızmasını kolaylaştırmak için uy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutant solucan suşları, Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından nazikçe sağlandı. Bu araştırma, Kore Cumhuriyeti Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nin bir hibesi ile desteklenmiştir (hibe numarası: HI14C1277).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PNA probuPANAGENEözel sipariş
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab parçalarıRoche11207741910
Sığır serum albüminiSIGMA-ALDRICHA-7906
ParaformaldehitSIGMA-ALDRICHP-6148'deseyreltilmiş 1:200 kullanınbirkaç damla NaOH ile DW'de ısıtarak% 4 paraformaldehit hazırlayın. 0.1 hacim 10x PBS ekleyin.
VectashieldVektör LaboratuvarlarıH-1200
Hibridizasyon çözeltisi3x SSC, %50 formamid, %10 (a/h) dekstran sülfat, 50 &# 956; g/ml heparin, 100 &# 956; g/ml maya tRNA'sı , 100 &# 956; g / ml sonikasyonlu somon sperm DNA
Hibridizasyon yıkama çözeltisi2x SSC,% 50 formamid
FormamidBIONEERC-9012toksik
MetanolCarlo Erba
AsetonCarlo Erba
HeparinSIGMA-ALDRICHH3393stok çözeltisi için 10 mg / ml yapmak
Dekstran sülfatSIGMA-ALDRICH67578
10x PBS1 L DW için: 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4• 7H2O, 2,4 g KH2PO
PBST1x PBS, %0,1 ara-20
Polisorbat 20SIGMA-ALDRICHP-2287Ticari adı Tween-20'dir
Poli-L-Lizin çözeltisi (%0,1 a/h)SIGMA-ALDRICHP-8920kullanmadan önce %0,01 w/v solüsyon hazırlar
M93 g KH2< / sub>PO4< / sub>, 6 g Na2< / sub>HPO4< / sub>, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4< / sub>, H2< / sub>O ila 1 L
Ağartma çözeltisi% 20 sodyum hipoklorit, 0.5 M KOH
Antikor tamponu1x PBST, 1 mM EDTA, %0.1 BSA, %0.05 Sodyum azid (toksik)
Bloke edici çözelti%5 sığır serum albümini (BSA) içeren antikor tamponu)
illustra Microspin G-50GE healthcare27-53310-01
20x SSC1 L, 175.3 g NaCl, 88.2 g sodyum sitrat, H2O ila 1 L yapmak için, pH'ı 7.0'a ayarlayın
2x SSCT2x SSC, %0.1 ara-20
10x digoksigenin-dUTP karışımı1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR saflaştırma kolonlarıCosmo genetechCMR0112
Cam temizleyici / ULTRA CLEANDukssan saf kimyasallar8AV721
Çok kuyulu cam slaytMP biyomedikal
Nematod büyüme ortamı1 L, 3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g pepton, H2O ila 974 ml yapmak için. Şişeyi otoklavlayın ve soğutun. Etanolde 1 ml 1 M CaCl2< / sub>, 1 ml 4 mg / ml kolesterol, 1 ml 1 M MgSO4< / sub>, 25 ml 1 M KPO4< / sub> ekleyin.
levamisolSIGMA-ALDRICH196142
RazorFeatherbıçak No. 11
Rnase AEnzimomik
BSASIGMA-ALDRICHA7906
Konfokal mikrosop,ZeissLSM 510EC Plan-Neofluar 100X kullanıldı.
Nem odasıYazılımı'na batırılmış kağıt havluyla doldurulmuş plastik kutu
 Dr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502
PBST Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910 . , 96041205Objektif lens olarak DW Görüntü Analiz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
  2. Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere FISHPNA ProbesC elegansFluorescence In Situ HybridizationTelomere LengthAlternative Lengthening of TelomeresTelomere QuantificationFluorescent MicroscopyProbe HybridizationAntibody Staining

Related Articles