Yöntem makalesi

İnsan Kemik İliği gelen Yalıtımlı Mesangiogenic Ata Hücreleri (MPCs)

DOI:

10.3791/54225

⸱

15 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Mezodermal Progenitör Hücreleri (MPC'ler) insan kemik iliğinden (hBM) izole etmek için optimize edilmiş, yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü açıklıyoruz. MPC'ler akım sitometrisi ve nestin ekspresyonu ile karakterize edildi. Anjiyojenik potansiyellerini korurken katlanarak büyüyen MSC benzeri hücre kültürlerine yol açma yeteneğini gösterdiler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik uygulamalar için insan kemik iliği (hBM) kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreleri (MSC'ler) izole etmeyi amaçlayan bir araştırma çalışmasında, insan serumu takviyeli ortamda büyüme için özel olarak seçilmiş yeni bir hücre popülasyonu belirledik. Bu hücreler, MSC'lerden farklı morfolojik, fenotipik ve moleküler özelliklerle karakterize edilir ve biz bunlara Mezodermal Progenitör Hücreler (MPC'ler) adını verdik. MPC'ler yuvarlaktır ve kalın, yüksek oranda refrakent bir çekirdek bölgesi vardır; Plastiğe güçlü, tripsine dirençli yapışma gösterirler. MPC'lerin genişletilmemesi, bisiklete binmede yavaş olduklarını doğrudan ortaya koydu. Bu, Ki-67 olumsuzluğunun da önerdiği gibidir. Öte yandan, MPC'lerin MSC genişlemesi için tasarlanmış standart ortamda kültürlenmesi, katlanarak büyüyen MSC benzeri hücrelerden oluşan bir popülasyona yol açtı. Mezenkimal farklılaşma kapasitesi göstermenin yanı sıra, MPC'ler anjiyojenik potansiyeli korudu ve çoklu soy progenitör doğalarını doğruladı. Burada, hBM-MPC'leri akış sitometrisi (CD73, CD90, CD31 ve CD45), nestin ekspresyonu ve F-aktin organizasyonu ile izole etmek ve karakterize etmek için optimize edilmiş, yüksek oranda tekrarlanabilir bir protokolü açıklıyoruz. MPC'lerin mezenjenik ve anjiyojenik farklılaşması için protokoller de sağlanmaktadır. Burada ayrıca bu hücreler için "Mezanjiyojenik Progenitör Hücreler" olarak yeniden adlandırılan daha uygun bir isimlendirme öneriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenşimal stromal hücreler (MSC'ler) bunların çok soyundan farklılaşma kapasitesi ve büyüme faktörleri / sitokinler salgılama hem de bağışıklık sistemi 1 bir rol hemopoiesis destekleme kapasiteleri için ilgili klinik değeri vardır. MSC-temelli tedaviler, hücre üretimi ve uygulaması tanımı tıbbi ürün (CBMP) tedavileri 3 tabanlı hücrenin güvenlik ve etkinlik için özel uluslararası düzenlemeye özellikle dikkat, geniş klinik ve klinik öncesi araştırma 2 nesne olmuştur. İnsan MSC'ler örneğin fetal sığır serumu (FBS) ve sığır tripsin gibi ek ve hayvan kökenli, reaktifler içeren ortamda yoğun kültürlenir. Bu nedenle, hücre manipülasyonu ile ilişkili enfeksiyon riskleri, hastalar prion maruz gibi proteinler, peptidler ya da hayvan kökenli diğer biyomoleküllerin bağlantılı immünolojik riski ile karşı karşıya birlikte hücre hasat ve Transplan sonra devam olabilirtation 4.

sorunu aşmak için, havuzlanmış insan AB tipi serumu (Phab'lar) FBS yerine, insan kemik iliği (SM), hayvan içermeyen ortam içinde türevi MKH'lerin kültürlenmiştir. Bu koşullar altında büyüyen MSC ile birlikte bir yeni hücre popülasyonunu tespit edilmiştir. Bu hücreler morfolojik ve MKH gelen fenotipik farklı ve kendine özgü bir gen tanımlama profili yanı sıra karakteristik büyüyen / yapışma özellikleri göstermiştir. Bu muhafaza hem mesengenic ve potansiyel anjiyojenik ve bu nedenle adlandırılmıştır Mezodermal Ata Hücreleri (MPCs) 5. Daha sonra, biz saflık 6 yüksek sınıfta MPCs üretmek için seçici ve tekrarlanabilir kültür koşulları tanımlamak başardık.

Biz daha MPCs morfolojik ve biyolojik özellikleri incelenmiştir. PPM'ler bisiklet, olumlu-Nestin yavaş gösterdi, Ki-67-negatif ve uzun telomerlerin 5 ile karakterize kromozomlar ile. Onlar plur dileipotency ilişkili transkripsiyon faktörleri Ekim-4 ve Nanog ziyade MSC ana düzenleyicileri Runx2 ve SOX9 7. mezenkimal belirteçler CD73, CD90, CD166 eksik ise fenotipik, PPM'ler MSC daha düşük seviyede endoglin (CD105) olarak ifade edilmiştir. PPM'lerin de özellikle podosome benzeri yapılar 8 ayakta yapışma PECAM (CD31) tutarlı ekspresyonu ile karakterize edilen molekül, integrinler αL (CD11a) Branşman (CD11b) αX (CD11c) ve integrin β2 (CD18) farklı bir modelini göstermektedir . Standart MSC genişleme medyada, PPM'ler derhal 9 sinyalizasyon Wnt5 / Calmodulin hücre aktivasyonunu içeren bir ara aşamasında MKH ayrışmıştır. Murin hücre dışı matris (ECM) proteini 3D kültürlerinde sferoidler filiz kabiliyetleri ile gösterildiği gibi MPCs da anjiyojenik özellikleri muhafaza. anjiyojenik potansiyeli hızla mesengenic soy boyunca MPC farklılaşma sonra kayboldu.

Burada yanlısı mevcutprotokollere‖ izole etmek ve HBM kan numunelerinden yüksek ölçüde saflaştırılmış MPCs karakterize etmek için optimize edilmiştir. MPC mesengenic ve anjiyojenik farklılaşması için tekrarlanabilir protokoller de tarif edilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: yazılı onayı sonrasında HBM örnekleri kalça protezi için ortopedik cerrahi sırasında elde edilmiştir. Hemen heparin 500 UI içeren 20 ml şırınga oyma femur boynu osteotomisinden sonra ve femoral önce, taze BM aspire etmek için kullanılmıştır. Protokol bir dengeleme kaynağına geniş bir uygulama kabul edilir.

İnsan Kemik İliği Mononükleer Hücreleri 1. İzolasyon (HBM-ÇUŞ)

  1. Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (D-PBS) uygulanarak, 50 ml taze BM 10 ml ve çevirerek karıştırın - 5 seyreltilir. Aynı şekilde, iki yeni 50 ml konik tüpler 25 ml dağıtmak her tüpe D-PBS 25 ml ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
  2. borular çözeltisi mineral kemik parçalarının ayrılması ve yağ, oda sıcaklığında 10 dakika için beklemeye bırakın.
  3. Dikkatle mineral kemik parçası pelet bozmadan 70 mikron filtreler aracılığıyla steril bir Pasteur pipeti ve filtre hücre süspansiyonu ile yüzen yağ çıkarmak.
  4. , aralıklı yoğunluk gradyan santrifüj için ortam, 15 ml (1.077 gr / ml) ile dört adet 50 ml tüpler ayarlayın. Bu ortam, oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
  5. yoğunluk gradyan ortamının üstüne seyreltilmiş BM 25 ml - Yavaşça 20 yatıyordu. Karıştırma katmanları önlemek için tüp duvarları üzerinde hücre süspansiyonu damlama izin dikkatle bu işlemi gerçekleştirmek.
  6. Fren devre dışı, oda sıcaklığında, 30 dakika boyunca 400 x g'de yoğunluk gradyan santrifüjleme yapın.
  7. Steril bir Pasteur pipeti kullanarak iki faz arasında yer alan hücrelerin beyazımsı halka toplayın ve taze bir 50 ml tüp aktarın.
  8. taze kültür ortamı hücreleri yıkayın: fenol kırmızısı içermeyen, düşük glukoz (1,000 mg / L), Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) havuzlanmış insan AB tipi serumu (Phab'lar), 2 mM L-glutamin ve antibiyotikler (DMEM /% 10 Phab'lar). 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  9. taze DMEM 10 ml /% 10 Phab'ları - Süpernatant aspire ve 5 pelet yeniden askıya.
  10. Hücre sayımı devam edin.Tripan 1 seyreltme: 1 ile beyaz kan hücrelerinin sayısını belirler. hemasitometre Bu uygulayın ve bir faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek. hücre sayısı küçük ve mükemmel yuvarlak eritrosit ve mavi boyalı ölü hücreleri hariç.
    NOT: Oldukça MPC kurtarma onların performansı için ekran Phab'ları toplu tavsiye edilir. Farklı kökenli en sera MSC-benzeri hücrelerin daha yüksek oranları ile MPC kültürleri ile sonuçlanırken, ABD kaynaklarından Phab'lar iyi sonuçlar vermiştir.

HBM-ÇUŞ'ların gelen MPCs 2. izolasyonu

  1. Eden taze DMEM /% 10 Phab'lar 15 ml hidrofobik, T-75 balonları ayarlama ve pH ve sıcaklık 30 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de ön-kuluçkalama ile denge sağlar.
  2. Tohum 4 - şişesi başına 6 x 10 7 HBM-uluslu şirketlerin ve 48 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Aspire edin ve kaplardan olan ve yapışmayan hücreler atılır. eden taze DMEM /% 10 Phab'lar 15 ml ilave edilir ve 37 ° C'de inkübe% 5 CO 2. ORTA her 48 saat değişen 8 gün - 6 kültürleri korumak.
    İSTEĞE BAĞLI: MPC veriminin arttırılması için, 2.3 yapışmayan hücreler yeni bir kültür şişesi içinde yeniden kaplanmış ve primer kültürlerin için tarif edildiği gibi korunabilir.
  4. Aspire ve şişeler orta atmak taze DMEM ile yıkayın ve çözüm ayırma hayvan serbest proteaz 2 ml ekleyin. 15 dakika boyunca (uzun kuluçka kaçının) - 5 37 ° C'de inkübe edin.
  5. 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu ve santrifüj taze DMEM /% 10 Phab'lar 10 ml ilave edilir ve aspire
  6. Aspire ve supernatant atın ve 1 pelet yeniden askıya - taze DMEM 2 ml /% 10 Phab'ları. Adım 1.10 açıklandığı gibi hücre sayısında geçin.
    NOT: ayıraç ayırma olarak tripsin / EDTA kullanmayın. PPM'lerin dirençli tripsin. kültürlerin morfolojik tarama hücre hasat öncesi, yüksek iğ şeklinde MSC-benzeri hücrelerin varlığını değerlendirmek için tavsiye edilir. MSC benzeri hücrelerin durumda önemli miktarda d vardıretected seçici kontamine hücreleri yok ederek hücre ürününün saflığını artırmak. Bunu yapmak için, bir şekilde tripsin emdirme 2 dakika boyunca tripsin 2 ml / EDTA,% 0.05 ilave ederek, MPC hasat öncesinde gerçekleştirilebilir. Yıkama kültürler iki kez DMEM /% 10 Phab'lar 5 ml, daha sonra yukarıdaki gibi tedavi proteaz geçin.

3. Hücre Karakterizasyonu

  1. Akış sitometrisi
    1. Yıkama çözeltisi içinde 10 5, taze müstakil hücrelerin benzer örneklerin ayarlayın: D-PBS% 0.5 (h / h) inek serumu albümini (BSA) ve% 0.02 (ağ / hac) sodyum azid ile takviye edilmiştir. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
      DİKKAT: Sodyum azid toksiktir.
    2. Yıkama çözeltisi 200 ul pelet yeniden askıya ve anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 ve floresan boyalar ( "test") ile konjuge edilmiş anti-CD31 antikor ekleyin; paralel izotip kontrolleri ( "CTRL") kurdu.
      NOT: antikorları boyama miktarları titrasyon veya edi tarafından belirlenmelidirüreticinin talimatlarına artırılabilir.
    3. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Yıkama solüsyonu 500 ul hücreleri yeniden askıya ve 7 9 10 sitometresinde renkli akış en az 5 x 10 4 olayları kazanır.
    5. nokta-araziler ile sonuçlarını analiz ve kadran ayarlamak için "CTRL" kaydedilmiş olayları kullanın.
      NOT: MPC kültür olarak kültür tanımlamak amacıyla CD73 negatif CD90 negatif CD45 + CD31 + hücrelerin yüzdesi% 95 üzerinde olmalıdır. % 98 - bazı özel uygulamalar için, örneğin, gen ekspresyon analizi, geri kesme 97 arttırılmalıdır.
  2. Nestin algılama ve F-aktin organizasyon analizi
    1. Kültür oda slaytlar levhalar taze izole edilmiş MPCs (20,000 / cm2). Hücreler,% 5 CO2 içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe etmek suretiyle uygun izin verin.
    2. yıkama solüsyonu ve fi hücreleri yıkayın% 4 x 15 dakika için oda sıcaklığında (ağırlık / hacim), para-formaldehid. sabitleştirici, yıkama solüsyonu ilave 2 dakika boyunca inkübe ve dökün kaldırmak için.
    3. iki kez yıkama tekrarlayın.
    4. D-PBS içinde geçirgenliği hücreler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.05 (h / h) Triton X-100 ile takviye edilmiştir.
    5. proteinsiz sinyal arttırıcı (oda sıcaklığında 30 dakika) ya da standart engelleme çözeltisi ile reaksiyonu durdurun (D-PBS% 3 ile desteklenmiş (w / v) BSA).
    6. çözümü engelleme / sinyal arttırıcı çıkarın.
    7. 7 ug / ml ilave anti-insan Nestin birincil antikor (a / h) ile nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Buna paralel olarak, değil özel floresan sinyalleri değerlendirmek için izotipik kontrol antikorları kullanın.
    8. D-PBS ekleyerek slaytlar yıkayın, 2 dakika bekletin ve dökün. İki kez tekrarlayın.
    9. 2 ug / ml ilave fluoresan boya konjuge sekonder antikor (a / h) ve karanlıkta 1 saat süreyle 4 ° C'de inkübe edin.
    10. Yıkama yukarıda kayar.
    11. Floresan phalloidin (5 UI / ml) ilave, 30 m, oda sıcaklığında bırakınve karanlıkta D-PBS içinde 3 kere yıkayın.
    12. odası duvarları kaldırmak ve çekirdekler tespiti için antifade reaktif ve 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile desteklenmiş, sulu yapıştırma vasatı içerisinde montaj slaydları. 7 9 10 görüntüleme geçin.

MPCs 4. Mesengenic Farklılaşma

  1. Levha 2 x 10 4 / cm2 TC-muamele T75 kültür şişelerinde taze izole edilmiş MPCs ve hücreler,% 5 CO2 içinde 37 ° C de DMEM /% 10 Phab'lar gece boyunca uygun bildirin.
  2. Mezenkimal stromal hücre genişlemesi (MSC-SC ortamı) için tasarlanmış, standart düşük serum ortamı, yaklaşık 200 ul / cm2, DMEM /% 10 Phab'lar değiştirin. indüksiyon 7 ila 10 gün arasında, tipik olarak, (P1-mezenkimal) konflüansa hücreleri büyütün. 2 günde orta yenileyin.
  3. Aspire ve şişeler orta atmak taze MSC-RS ortamı ile yıkayın ve çözüm ayırma hayvan serbest proteaz 2 ml ekleyin. 37 ° C'de inkübe edin76, 5 C - 15 dakika (uzun kuluçka kaçının).
  4. 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu ve santrifüj taze MSC-SC ortamı 10 ml aspire
  5. Taze MSC-RS orta 2 ml - Süpernatant aspire ve 1 pelet yeniden askıya. Adım 1.10 açıklandığı gibi hücre sayısında geçin
  6. 5 x 10 3 hücre / cm 2-3 ekim onlara alt kültüre devam edin. (P2-MKH'lerin) izdiham hücreleri büyür.
  7. 4.5 adım ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi karakterize devam etmek için aşama 4.3 altında tarif edildiği gibi bir proteaz sindirimi ile Hasat hücreleri.
    Not: CD73 + CD90 + CD45 negatif CD31 negatif hücrelerin yüzdesi daha düşük% 95, sadece kısmi türev gösterir ve ayrıca bir kültür geçişi gerektirecektir.
  8. Levha P2-MSC'ler 2 x altı kuyucuklu TC ile tedavi edilmiş plakalarda, 10 4 / cm2 ve büyümesi de MSC-SC ortamı içinde birikene kadar.
  9. Mark "Hayır Diff" olarak iki kuyu ve MSC-RS orta yenileyin.
  10. Mark iki iyi"Osteo" ve özellikle MSC farklılaşması için tasarlanmış 200 ul / standart osteojenik ortamın cm 2 ile orta yerine kadar s.
  11. Mark iki "Adipo" olarak kuyu ve özellikle MSC farklılaşması için tasarlanmış 200 ul / standart adipogenic ortamın cm 2 ile orta yerine.
  12. Bütün ortam maddesi her 48 saat değiştirerek% 5 CO2 içinde 37 ° C'de kültürler koruyun.
    NOT: Bu son derece Test tekrarlanabilir standart piyasada mevcut ayırt medyayı kullanılması tavsiye edilir. hücre içi lipid damlacıkları birikimi adipogenic kaynaklı hücrelerde belirgin iken ayırt şartlarda 2/3 hafta sonra, kireçlenme, osteojenik kaynaklı kültürlerde görülür.
  13. Aspire kültür ortamı daha sonra D-PBS ile yıkayın atmak ve.
  14. Oda sıcaklığında 15 dakika için para-formaldehid (ağ / hac)% 4, 1 ml ekleyerek kültürleri sabitleyin.
  15. sabitleştirici, D-PBS ekleyin 2 dakika boyunca inkübe ve dökün kaldırmak için. Tekrarlama yıkamaiki kez.
  16. İki "Adipo" 200 nM Nil Kırmızı çözelti kuyular işaretli iki "Osteo" birlikte hidroksiapatit özel floresan çözüm ve bir "Hayır Diff" kuyular işaretli birlikte bir "Hayır Diff" Leke. Oda sıcaklığında 11,12, 30 dakika süreyle inkübe edilir.
  17. çözümler boyama çıkarın ve iki kez D-PBS içinde yıkayın.
  18. Ekleme, D-PBS çıkarın D-PBS% 50 (h / h) gliserin ile takviye edilmiş ve görüntüleme 7 9 10 geçin.

5. MPC Sfero çimlenme Deneyi

  1. 3D parçacıklarının üretilmesi için bir petri çanağı kapağın iç yüzeyi üzerinde yeni izole edilmiş MPC süspansiyonu (1.5 x 10 4 hücre / damla) 20 ul damla yatmaktadır.
    NOT: taşıma damla kendi yırtılmasına yol açabilir gibi, fazla bırakmaya son derece tavsiye ediyoruz.
  2. Dikkatle D-PBS asılı buharlaşmasını damla önlemek için içeren bir Petri kabı tekrarlamak için kapağı kullanın. CO2,% 5 37 ° C'de inkübe edinbir gecede hücreler 3D küresellerde agrega için izin vermek.
  3. önceden soğutulmuş 24 oyuklu bir kültür plakasına standart ECM proteinlerinin 300 ul hacimde eklenmesiyle murin hücre dışı matris (ECM) bir protein kalın bir jel ayarlama, ve 30 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Dikkatle Petri kabı kapağı devrilebilir ve yavaşça steril bir Pasteur pipeti kullanarak parçacıklarının pick up.
  5. ECM proteini jel üzerine parçacıklarının Lay standart VEGF zengin endotelyal hücre büyüme ortamı 700 ul alikotları ekleyin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin.
  6. 24 saat sonra ve kültür 7 gün, 4X büyütme gücü 3D kültürlerin fotoğraf çekmek. Son istilacı hücre ve sfero kenarı arasındaki radyal mesafe ölçülerek görüntü analiz yazılımı uygulayan sferoidler çimlenme değerlendirin. en az 20 farklı yönleri boyunca tekrar ölçer. Ortalama mesafe ne zaman 50 mikron ya da üzerinde olumlu olarak kabul edilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen seçici kültür koşulları HBM-çok uluslu% 1.0 bir roman yapışık ve hemen hemen monomorfik hücre popülasyonu izole izin (0,5-2,0 x 10 5 6 HBM-uluslu şirketlerin - taze BM numuneleri, 10 ml) 5,6 . MPCs 5 gibi, hareketsiz, Ki-67-pozitif hücrelerin bulunduğu yuvarlak, - bu büyük (60 um çapında 40) tespit edilmiştir. Morfolojik olarak, bunlar (Şekil 1 A.1 beyaz oklar) daha yüksek bir büyütme güçte filopodia çok gösteren düz, ince çevre ile çevrelenmiş kalın çekirdek bölge ile ayırt edici bir kızarmış yumurta-şeklinde karakterize edilir. Dış hücre sınır Polar uzama genellikle (Şekil 1 A.1 siyah oklar) görülmektedir. Bu morfoloji, standart MSC kültürlerinde rapor tipik iğ şekilli mezenkimal stromal hücre görünüşünden açıkça farklıdır. Akım sitometri m iken CD31 ve CD45 ifade taze izole MPCs% 95 in üzerinde gösterdiesenchymal ilişkili markörler CD90 ve CD73 13 tespit edilemeyen (Şekil 1 A.2) idi. Biz MPCs için dört antijenlerin bu sınırlı kümesi olarak gösterge görüyoruz. MPCs daha ayırt edici özellikleri hücrelerde algılanmaz (Şekil 1 A.3'te kırmızı) bir podosome benzeri yapıların sayısını ortaya noktalı F-aktin dağıtım ve Nestin yoğun anlatım (Şekil 1 A.3'te yeşil) vardır izotipik kontrol antikoru ile lekelenmiş (veriler gösterilmemiştir).

Standart RS Kültürleme MPCs orta katlanarak büyüyen MSC-benzeri hücreler (Şekil 1 B.1) içine hızlı farklılaşma MSC genişleme sonuçları için tasarlanmış. Iki geçit sonra hücreler nihayet CD73 + CD90 + CD45 negatif CD31 neg (Şekil 1 B.2) için CD73 negatif CD90 negatif CD45 + CD31 + 'dan kendi fenotip geçiş. Bu süreç içinde, PPM'ler yeniden azotaNestin ifade Birkaç nadir hücreleri (Şekil 1 B.3) sınırlı olur ise nize stres liflerinin içine F-aktin. kesin MSC gibi fenotip içine MPC mesengenic farklılaşma farklı hücre morfolojileri ortaya iki farklı adımlar sayesinde gerçekleşir. MSC SC ortamı içinde bir hafta MPC-benzeri hücrelerin bir artık doldurma işleminden sonra halen (Şekil 2, bir P1-MSC), düz, poligonal, çok dallı hücrelerinin konfluent tabaka içinde tespit edilebilir. Başka bir kanala (Şekil 2, bir P2-MSC) iğsi MSC-benzeri hücrelerin neredeyse monomorfik kültür elde etmek için gereklidir. böylece MSC doğasını teyit en az 2 hafta boyunca seçici ortama aktarıldığında bu katlanarak büyüyen hücreler kolayca osteoblast veya adipositlere ayırt edebilirsiniz. Osteojenik kaynaklı kültürlerde, kireçlenme, ya kolorimetrik Alizarin-S leke ya da belirli bir floresan boyalar (Şekil 2 B yeşil) ile tespit edilebilir. adipojenik endüksiyon sonra hücreler(Şekil 2 B kırmızı) ya kolorimetrik Yağ Kırmızı veya floresan Nil Kırmızı leke ortaya lipid damlacığı birikimi gösterir.

MPC yazarak anjiyojenez deneyi filizlenme ile teyit edilmiştir. PPM'ler 24 saat VEGF-uyarıcı (Şekil 2 C) sonra 3D sferoidlerde gelen fare ECM protein jel istila (mikron 50) yeteneğini gösterdi. 600 mikron mesafe - Bir hafta hücreleri istila 300 tespit edildikten sonra. Tersine, işgal kapasitesi mesengenic farklılaşma (Şekil 2 D) sonra P2-MKH kayboldu.

figure-results-1
Şekil 1. Taze İzole MPCs Belirgin Özellikler var. DMEM /% 10 Phab'ları içinde Kültüre HBM-ÇUŞ'larına yedi gün boyunca MKH kolayca ayırt sakin MPCs (A) nüfusu (B) yol açar Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
2. MPCs orta MSC genişlemesi için tasarlanmış ticari olarak mevcut RS DMEM / Phab'ları in vitro. Değiştirme Standart MKH ve Show çimlenme Angiogenezis içine ayırt Şekil MPCs mesengenic indüksiyon tetikler. Kültür için tek bir hafta sonra bir kaç artık MPCs de MSC-SC ortamı içinde bir başka geçiş birleşik MSC-benzeri hücre popülasyonu (P2-MSC'ler, bir ölçek bar = 100 um) neden olurken, saptanabilir (P1-MSC'ler) vardır. PKalsiyum birikimi (B yeşil) ve lipid damlacığı birikimi (B kırmızı, ölçek çubukları = 200 mikron) gösterdiğine göre 2-MKH ölümcül sırasıyla, uygun uyaranların altında osteosit veya adipositler içine ayırt. MPCs P2-MSC (D, ölçek çubukları = 1,0 mm) bir farkı fare ECM proteini jel (C) sferoidler tutarlı filizlenme gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, MKH'ler çeşitli kemik/eklem, immünolojik, nörolojik, kardiyovasküler, gastrointestinal ve hematolojik bozuklukların tedavisinde olası uygulama için kapsamlı bir şekilde araştırılmış ve klinik öncesi olarak değerlendirilmiştir14,15. Multipotent MKH'lerin birçok farklı dokudan kolay ve ucuz izolasyonu, önemli immünojenisite16 eksikliği ile birlikte, bu hücrelerin hücre bazlı tedavilerde uygulanacak en ilginç hücre popülasyonlarından biri olmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, orijin dokudaki çok düşük frekans, MSC'lerin kliniklerde uygulanması için büyük bir sınırlamayı temsil eder ve bu hücrelerin infüzyon veya transplantasyondan önce in vitro olarak genişlemesini zorlar.

Genişletilmiş MSC kültürleri, MSC üretimi ve karakterizasyon protokolleri hakkında bir fikir birliğine varmayı zorlaştıran yüksek derecelerde heterojenlik ve değişkenlik17-19 ortaya çıkarmıştır. Ayrıca, son araştırmalar, kültür heterojenliğine10,20 katkıda bulunan çok çeşitli dokularda birden fazla in vivo MSC atasının varlığını öne sürdü. Aslında, belirli kültür koşullarının, kemik iliği (hBM-MNC'ler) veya yağ dokuları (stromal vasküler fraksiyon) gibi "ham" ve işlenmemiş örneklerde çeşitli yüzdelerde bulunan MSC progenitörlerinin belirli alt popülasyonlarını muhtemelen seçtiği veya basitçe teşvik ettiği öne sürülmüştür2. Bu nedenle, MKH başlatan hücre popülasyonlarındaki değişkenlik ve uygulanan çok sayıda farklı zenginleştirme/izolasyon ve kültür protokolü, uygulanabilir MKH bazlı tedavilerin tanımlanmasının önünde büyük bir engel teşkil etmektedir.

MSC kültürlerinin heterojenliğini etkileyen önemli bir faktör serum takviyesidir21. Elimizde, hBM-MNC'lerden elde edilen birincil kültürlerde FBS'nin PhABS ile değiştirilmesi, hidrofobik plastikler üzerinde yüksek yoğunluklu tohumlama ile birleştiğinde, MPC'ler5,6 adı verilen farklı biyolojik özelliklere sahip yeni, yüksek oranda yapışkan bir hücre popülasyonunun izolasyonuna yol açtı. FBS primer kültürlerine küçük yüzdelerde PhABS eklenmesinin MPC izolasyonuna da izin verdiğini gözlemledik, bu da insan serumundaMPC indükleyici ajanların varlığını düşündürdü 6. Şu anda, MPC izolasyon/karakterizasyon protokolü, neredeyse saf MPC'ler elde etmek için kullanılabilen benzersiz bir yöntemdir. Protokol dikkatli bir şekilde ayarlanmıştır ve daha sonraki uygulamalardan önce MPC preparatlarının kalite taraması için yüksek oranda tekrarlanabilir.

MPC'ler, MSC üretimi için bir kaynak olarak kullanılabilir, böylece fraksiyone edilmemiş başlangıç malzemesinin kullanımıyla ortaya çıkan değişkenlik sınırlandırılabilir. Bildirilen9 MPC mezenjenik farklılaşmasını karakterize eden çoklu adımların kesin tanımı, senkronize mezenkimal hücre genişlemesine izin verecektir. Bununla birlikte, bu son koşul, yalnızca yüksek oranda saflaştırılmış MPC popülasyonu uygulanarak gerçekleştirilebilir, bunun sonucunda burada açıklanan protokol ile elde edilen hücre ürünlerinin karakterizasyonu çok önemli sonuçlar doğurur. Bu izolasyon yönteminin, genellikle %95 civarında saflıkta MPC geri kazanımına izin verdiği bildirilmiştir. Bununla birlikte, donör/hasta değişkenliği, uygulanan farklı insan havuzlanmış serum partileriyle ilgili değişkenlik ile birlikte, seçici koşullar altında MPC'lerle birlikte izole edilen MSC benzeri hücrelerin önemli bir yüzdesine yol açabilir.

Bu "kontamine edici" MSC benzeri hücrelerin, kemik iliği22'de tanımlanan diğer farklı in vivo progenitörlerden mi yoksa kontrolsüz ve spontan MPC farklılaşmasından mı kaynaklanabileceği açık değildir. Her durumda, MPC ürünlerindeki MSC benzeri hücrelerin tutarlı bir yüzdesi, bu hücrelerin MSC genişlemesi için homojen başlangıç malzemesi olarak uygulanma olasılığını geçersiz kılar. Bu nedenle, burada MPC ürünlerinin saflığını artıran, tripsin sindirimine karşı MPC direncine dayanan basit ve ucuz bir yöntem önerilmiştir. MPC kültürlerinin saflaştırılmasında benzer veya daha iyi sonuçlar, CD73 ve/veya CD90 tükenmesini gerçekleştiren floresan veya manyetik hücre ayırma ile elde edilebilir, ancak işlem süresini önemli ölçüde uzatır ve maliyetleri artırır.

Ayrıca, MPC'ler, mezenjenik farklılaşma7 sırasında hızla kaybolan pluripotens ile ilişkili belirteçlerin ve Nestin'in ekspresyonunu gösterdi. Filizlenme testi, MPC'nin murin ECM protein jelini istila etme yeteneğini ortaya çıkardı. Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, MPC'lerin anjiyojenik potansiyeli koruyan daha olgunlaşmamış bir progenitör olarak kabul edilmesi gerektiğini göstermektedir. Bununla birlikte, MPC'lerin mezodermal farklılaşma potansiyeli hakkındaki ilk coşku aslında azalmaktadır. Aslında, MPC'ler üzerinde 7 yıldan fazla süren çalışmalardan sonra, mezenjenik ve anjiyojenik potansiyelkapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır 5-9, ancak mezodermal kökenli diğer hücrelere karşı farklılaşma hala eksiktir. Bu nedenle, burada MPC'ler kısaltmasını koruyarak bu hücrelerin "Mezanjiyojenik Progenitör Hücreler" olarak yeni ve daha titiz bir tanımını öneriyoruz.

Ayrıca, MSC anjiyojenik potansiyeli hakkındaki tartışmaların çoğunun, değişken yüzdelerde MPC'lerin ve MSC'lerin alt popülasyonlarından oluşan genişletilmiş kültürlerin heterojen bileşimi ile ilişkili olabileceğine inanıyoruz23.

Son olarak, MPC'ler, doku rekonstrüksiyonu için uygulanabilir CBMP'lerin uygulanması için de çok önemli bir rol oynayabilir, çünkü bu hücreler neo-vaskülarizasyonu da destekleyebilir. Aslında, rejenerasyon ile ilgili gelecekteki çalışmalar, yeni oluşan doku büyümesinin eşlik eden neo-anjiyogenez tarafından desteklenmesi gerektiğini göz önünde bulundurmalıdır. MPC'lerde mezenjenik ve anjiyojenik potansiyelin bir arada bulunması, bu ilginç hücreleri içeren yeni terapötik yaklaşımların rejenerasyon potansiyelini önemli ölçüde artırabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabet eden mali çıkarları veya başka çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, özellikle kemik iliği örnekleri ve insan osteo-ataları onun uzmanlık sağlamak için, Dr. Paolo Parchi, Cerrahi bölümü, Tıp ve Moleküler Patoloji ve Yoğun Bakım Tıbbı, Pisa Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Matrigel Bodrum Membran MatrisiBD Bioscience (San Jose, CA-ABD)354230Murin ECM proteinleri
Stok Konsantrasyonu: %100 (9-12 mg/ml)
Nihai Konsantrasyon: %100
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (D-PBS)Sigma (St. Louis, MO, ABD)D8537
70 & m FiltrelerMiltenyi Biotec (BergischGladbach, Almanya)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare (Uppsala, İsveç)17-5442-03süreksiz yoğunluk gradyan santrifüjleme ortamı
Havuzlanmış insan AB tipi serum (PhABS)LONZA (Walkersville MD-ABD)14-490ENihai Konsantrasyon: %10
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA ABD)35050-038Stabilize L-Glutamin < br / > Stok Konsantrasyonu: 100x < br / > Nihai Konsantrasyon: 2 mM
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma (St. Louis, MO, ABD)A8412Stok Konsantrasyonu:% 7.5 < br / > Nihai Konsantrasyon:% 0.5
Sodyum AzideSigma (St. Louis, MO, ABD)S8032Nihai Konsantrasyon:% 0.02
Penisilin / Streptomisin (Kalem Strep)Gibco ( Grand Island, NY, ABD)15070-063Antibiyotikler
Stok Konsantrasyonu: 5.000 UI/ml penisilin, 5.000 &# 956; g / ml Streptomisin
Nihai Konsantrasyon: 50 UI / ml penisilin, 50 & # 956; Süspansiyon kültürleri için g/ml Streptomisin
T-75 kültür şişesiGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Almanya)658 190
T-75 kültür şişesi TC ile muamele edilmişGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Almanya)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA USA)12563-011Hayvansız proteazlar ayırma solüsyonu
Stok Konsantrasyonu: 1x
Nihai Konsantrasyon: 1x
Tripsin/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA USA)15400-054Fenol kırmızı serbest < br / > Stok Konsantrasyonu:% 0.5 < br / > Nihai Konsantrasyon:% 0.25
anti-CD90 APC antikoru & nbsp; (CD90)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-095-402Final Konsantrasyon: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 antikoru (CD45)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-096-609Final Konsantrasyonu: 1:40
anti-CD73 PE antikoru (CD73)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-095-182Final Konsantrasyon: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 antikoru (CD31)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-105-260Final Konsantrasyon: 1:40
Mouse IgG1 APC antikoruMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-098-846Final Konsantrasyon: 1:40
Mouse IgG2a APC Vio770 antikoruMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-096-637Final Konsantrasyon: 1:40
Fare IgG1 PE antikoruMiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Almanya)130-098-845Nihai Konsantrasyon: 1:40
Fare IgG1 PE Vio-770 antikoruMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-098-563Nihai Konsantrasyon: 1:40
Düşük Glikoz Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium  (DMEM)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)13-1331-82Fenol kırmızısı içermeyen minimal esansiyel ortam
Stok Konsantrasyonu: 1.000 mg/L glikoz
Fetal Sığır Serumu  (FBS)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)10500Stok Konsantrasyonu: 0.2 mg / ml < br / > Nihai Konsantrasyon: 2 & mu; g / ml
4 ', 6-diamidino-2-fenilindol Invitrogen ile Altın antifade reaktifiniuzatın (Waltham, MA,  ABD)P-36931Sulu montaj ortamı + DAPI
Nihai Konsantrasyon: 1x
ParaformaldehitSigma (St. Louis, MO, ABD)P6148Fiksatif
Nihai Konsantrasyon: %4
LAB-TEK iki kuyulu odacıklı slaytlarSigma (St. Louis, MO, ABD)C6682
Anti-Nestin antikoru [klon 10C2]Abcam (Cambridge, İngiltere)ab2035Stok Konsantrasyonu: 1 mg / ml < br / > Nihai Konsantrasyon: 7 & mu; g/ml
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermoFisher (Waltham,  MA USA)A34055Stok Konsantrasyonu: 200 UI / ml < br / > Final Konsantrasyonu: 5 UI / ml
Triton X-100Euroclone (Milano, İtalya) EMR237500Final Konsantrasyonu:% 0.05
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS ortamı)ThermoFisher (Waltham,  MA AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ)12746-012
Alexa Fluor 488 anti-fare SFX kitiThermoFisher (Waltham,  MA ABD)A31619Keçi anti-fare ikincil antikoru + Sinyal arttırıcı < br / > Stok Konsantrasyonu: 2 mg / ml < br / > Nihai Konsantrasyon: 2 & mu; g/ml
Pasteur PipetKartell Labware  (Noviglio (MI), İTALYA )329
StemMACS AdipoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  MediaMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Almanya)130-091-678
Osteoimage Kemik mineralizasyon TestiLONZA (Walkersville MD-ABD)PA-1503Hidroksiapatite özgü floresan boyama çözeltisi
50 ml Polistiren konik tüpGreiner bio-one (Kremsmü nster
Avusturya)		227261
Nil KırmızısıThermoFisher (Waltham,  MA USA)N1142Lipidler için floresan boyama çözeltisi
Stok Konsantrasyonu: 100 mM
Nihai Konsantrasyon: 200 nm
GliserinSigma (St. Louis, MO, ABD)G2289Nihai Konsantrasyon: %50
Polistirene Petri kaplarıSigma (St. Louis, MO, ABD)P5606
24 oyuklu plakalar TC ile muamele edilmişGreiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Almanya)662160
Endotelyal Büyüme Ortamı, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)LONZA (Walkersville MD-ABD)CC-3162VEGF açısından zengin endotel hücre büyüme ortamı
Leica Qwin Görüntü Analisys YazılımıLeica (Wetzlar, Almanya)Görüntü analiz yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stoltz, J. F., et al. Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century. Stem Cells Int. 2015, 734731(2015).
  2. Pacini, S. Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs). Front Cell Dev Biol. 2, 50(2014).
  3. Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union. Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).
  4. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  5. Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
  6. Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
  7. Pacini, S., et al. Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs). PLoS One. 5 (3), 9861(2010).
  8. Pacini, S., et al. Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).
  9. Fazzi, R., et al. Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway. PLoS One. 6 (9), 25600(2011).
  10. Tormin, A., et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).
  11. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  12. Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes. Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).
  13. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  14. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  15. Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns. Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).
  16. Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
  17. Phinney, D. G. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).
  18. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy. J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  19. Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells. Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).
  20. Corselli, M., et al. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  21. Bieback, K., et al. Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow. Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).
  22. Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51(2014).
  23. Pacini, S., Petrini, I. Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells. Front Cell Dev Biol. 2, 20(2014).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ak SitometrisiCD31 CD45Nestin EkspresyonuF Aktin OrganizasyonuMezenjenik DiferansiyasyonAnjiyojenik DiferansiyasyonMonon kleer H cre zolasyonuYo unluk Gradyan Santrif gasyonu

İlgili makaleler