Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Bu protokol, villöz sitrotrofoblast hücrelerinin ardışık enzimatik sindirimlerle termde plasentalardan nasıl izole edildiğini, ardından yoğunluk santrifüjlemesi, ortam gradyan izolasyonu ve immünomanyetik saflaştırmanın nasıl yapıldığını açıklar. İn vivo olarak gözlemlendiği gibi, primer kültürdeki tek çekirdekli villöz sitotrofoblast hücreleri, 72 saat sonra çok çekirdekli sinsitiyotrofoblast hücrelerine farklılaşır. Normoksi (% 8 O2) ile karşılaştırıldığında, hipoksi / reoksijenasyon (% 0.5 /% 8 O2) geçiren villöz sitotrofoblast hücreleri, preeklampsi, erken doğum ve intrauterin büyüme kısıtlaması gibi gebelik komplikasyonlarında in vivo olarak gözlenene benzer şekilde artmış oksidatif stres ve intrinsik apoptoza maruz kalır. Bu bağlamda, hipoksi/reoksijenasyon koşulları altında kültürlenen primer villöz trofoblastlar, insan plasentasında değişen mekanizmaları ve sinyal yolaklarını daha iyi anlamak ve belirli gebelik bozukluklarına karşı koruma sağlayan etkili ilaçların araştırılmasını kolaylaştırmak için benzersiz bir deneysel sistemi temsil etmektedir. İnsan villöz trofoblastları melatonin üretir ve sentezleyen enzimlerini ve reseptörlerini eksprese eder. Melatonin, koruyucu antioksidan etkileri nedeniyle preeklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlaması için bir tedavi olarak önerilmiştir. Bu yazıda açıklanan primer villöz sitrofoblast hücre modelinde, melatoninin normoksik durumdaki trofoblast hücreleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur, ancak hipoksi / reoksijenasyon ile bozulan sinsityotrofoblast hücrelerinin redoks dengesini geri yükler. Bu nedenle, primer kültürdeki insan villöz trofoblast hücreleri, hipoksi / reoksijenasyon sırasında melatoninin plasental fonksiyon üzerindeki koruyucu etkilerinin arkasındaki mekanizmaları incelemek için mükemmel bir yaklaşımdır.
Giriş
insan gebelik boyunca, mononükleer kök hücreler plasenta sitotrofoblast hücreleri, hızla çoğalır ve villöz veya extravillous sitotrofoblast hücrelerine ya farklılaşırlar. Extravillous sitotrofoblastlar istila ve rahim duvarına spiral arterleri pişmanlık. Villöz sitotrofoblastlar, diğer yandan, çok çekirdekli sinsityotrofoblastik (Sinsityum) 1 oluşturmak için çoğalmaya ayırt ve sigorta devam etmektedir. villöz trofoblast homeostazındaki bakım fetal iyilik ve sağlıklı hamilelik için esastır. Aslında, villus trofoblastlar oksijen ve besin anne-cenin alışverişi sağlar ve gebelik için gerekli hormonları üretmek. Ayrıca, sinsityotrofoblast anne kan dolaşımı ile ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Plasenta, bilgilendirilmiş hasta onam ve etik komitelerin (CHUM-St-Luc Hastanesi ve INRS-Institut Armand-Frappier onayıyla, hemen CHUM-St-Luc Hastanesi, Montreal, QC, Kanada'da gebeden gelen spontan vajinal doğum sonrası elde edildi Laval, QC, Kanada).
Villöz sitotrofoblast 1. Hücre İzolasyonu ve Saflaştırılması
- Çözümler ve medya
- Ilave Nakliye ortamı hazırlamak Dulbecco'nun Eagle Ortamı Yüksek Glikoz% 1 hacim / hacim antibiyotik (DMEM-HG) (10,000 birim / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve mağaza 4 ° C'de modifiye edilmiştir.
- % 10 hac / hac cenin sığır serumu (FBS), 25 mM 4- (2-hidrok....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Vajinal doğum ile elde edilen normal bir terim plasenta İzolasyon ve villöz sitotrofoblast hücrelerinin immünolojik saflaştırma 1 x 10 8 canlı hücreleri elde edildi. Plasenta, 350 g ağırlığında diskoid şekil ve şeffaf membran ile 4 cm boyunda çapı 19 cm idi. Hiçbir kotiledon malformasyon tespit edildi. Göbek kordonu Parasantral lokalizasyon ve 56 cm'lik bir uzunluğa sahipti. saflık vimentin ve sitokeratin-7 belirteçleri kullanarak flow sitometri ile değerlendirildi. Hücrel.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Memelilerde, fetal gelişim yeterli plasental fonksiyonu üzerine doğrudan bağlıdır. Sağlık bozukluklarının gelişimsel kökenleri sonraki hayatında tecelli hastalıkların nedeni erken gelişmesine ve plasenta, fetal programlama 30-32 bir mekanik role sahip olduğu geri izlenebilmektedir hipotezine dayanmaktadır. Bu besin devrini düzenleyen zararlı maruz karşı korur ve önemli endokrin fonksiyonlara sahiptir: plasenta, fetal büyüme ve gelişmenin temel aracıydı. Kliman ve arkadaşları tarafından geliştiril.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden (NSERC) (no. 262011-2009) CV'ye ve March of Dimes Sosyal ve Davranış Bilimleri Araştırma hibesi (#12-FY12-179) ile CV ve JTS'ye verilen hibelerle desteklenir; Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) ve Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS'den LSF'ye öğrenci bursları ile, Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE'den HC'ye, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) ve FRQ-Santé'den AAHT'ye ve NSERC'den JBP'ye; Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) ve Programm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kavisli Metzenbaum Makas | Shandon | 9212 | cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet) |
| Splinter Foreps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet) |
| Makas 4.5 Str Diseksiyon | Fisherbrand | 08-940 | cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet) |
| Gazlı Bez Sünger 10 cm x 10 cm | Kardinal Sağlık | ||
| Dikdörtgen Cam Pişirme Kabı | Pyrex | 1105397 | Züccaciye (2,8 L) |
| Huni Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Züccaciye (114 mm çap) |
| Saat Camı | pyrex | 9985100EMD | Züccaciye |
| Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10 | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histolojik doku fiksatif çözeltisi |
| Tripsiniz Şişeleri | Wheaton | 355395 | Züccaciye (1 adet) |
| Tek Kullanımlık Kültür Tüpleri | Kimble | 73750-13100 | Züccaciye |
| Borosilikat Cam Pastör Pipeti (22,8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Züccaciye |
| 250 ml Cam Beherler | Fisherbrand | KFS14005250 | Züccaciye |
| Kapaklı Cam Ortam Şişeleri | Fisherbrand | KFS14395250 | Züccaciye (8 adet |
| )50 ml Corex Tüp | Corning | 8422-A | (1 adet) |
| 15 ml Polistiren Santrifüj Tüpü | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polistiren Santrifüj Tüpü | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serolojik | Pipet Corning | 11415038 | |
| Hücre Süzgeci 100 & mu; m Naylon | Corning | 431752 | |
| Emici Astar | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Şişeler Üst Filtre | Corning | Gözenek: 0.22 &mikro; m / orta ve HBSS hazırlama | |
| 2 ml Kriyojenik Şişeler | Corning | 430488 | |
| Dondurma Kabı, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltik Pompa | Pharmacia İnce Kimyasallar | P3 modeli | |
| Çalkalama Su | Banyosu Fisher | Model 127 | |
| Vakum Pompası | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodyum Klorür | Fisherbrand | EC231-598-3 | Tuzlu su çözeltisi %0.9 |
| Hank' s Tamponlu Tuz Çözeltisi (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Miktar: 1 L sindirim çözeltisi için 9,25 (bir şişe) |
| Hidroksipiperazineethansülfonik Asit (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 1 L sindirim çözeltisi için 25 ml (1 M) |
| Tripsin Tip I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoksiribonükleaz Tip IV | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Kalsiyum Klorür | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnezyum Sülfat | Fırıncı | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta Yüksek Glikoz (Dmem) | Yaşam Teknolojileri | 10564-045 | |
| Penisilin / Streptomisin Sülfat Hiklon | SV30010 | ||
| Fetal Sığır Serumu | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Yoğunluk santrifüjleme ortamı gradyanı. Hacim: 36 ml |
| İzopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimetil Sülfoksit | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Manyetik Ayırıcı | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Sütunlar | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Çalışan Tampon | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Durulama Solüsyonu | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-İnsan Hla Abc Saflaştırılmış Klon W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-fare antikoru |
| Anti Fare Igg Mikroboncuklar | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Çok Kuyulu Plaka - 6 Kuyulu Kapak | Corning | 3335 | Hücre Bağlama yüzeyi |
| Çoklu Kuyu Plakası - 24 Kuyulu Kapaklı | Corning | 3337 | Hücre Bağlama yüzeyi |
| Çoklu Kuyu Plakası - 96 Kuyu Kapaklı | Corning | 3300 | Hücre Bağlama yüzeyi |
| Modüler İnkübatör Odası | Billups-Rothenberg | MIC-101 | Normorxia ve hipoksi/reoksijenasyon koşullarını aynı anda oluşturmak için iki set gereklidir |
| Tek Akış | Ölçer Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm Sıralı Filtre | Whatman | 6721-5010 | PTFE, gözenek: 1.0 ve mikro; m |
| Gaz Regülatörü | Pro Star | PRS301233 | Normoroksi ve hipoksi/reoksijenasyon koşullarını aynı anda oluşturmak için iki set gereklidir |
| Gaz Hortumu Sınıf Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 adet ~ 0,5 m |
| 17 mm Ayarlanabilir Gaz Hortumu Kelepçesi | Kravat Sargıları | THCSS-16 | |
| Normoxia Gaz Tüpü | Praxair | NI CDOXR1U-K | Boyut K (3rd trimesterin bileşimi: %5 CO2, %8 O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gaz Tüpü | Praxair | NI CDOXR1U-K | Boyut K (3rd trimesterin bileşimi: %5 CO2, %0.5 O2, Bal. N2) |
| Oksijen Mikroelektrodu Mi-730 | Mikroelektrotlar INC | 84477 | |
| Oksijen Adaptörü | Mikroelektrotlar INC | 3572 | |
| ROS Algılama Reaktifi: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| ve beta; -hCG ELISA kiti ve nbsp; | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin saflaştırılmış antikor | eBioscience | 14-9897 | Konakçı: fare |
| Anti-Sitokeratin 7 (FITC) antikoru | Abcam | ab119697 | Ev sahibi: fare |
| Alexa Fluor 488 Keçi Anti-köpük IgG H & L antikoru | Yaşam Teknolojileri | A-11029 |
Kaynaklar
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Fac....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
