Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

15.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54228

⸱

30 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, hipoksi/reoksijenasyon altında kültürlenen, immün olarak saflaştırılmış insan villöz sitrofoblast hücrelerinin benzersiz bir in vitro modelini sunmaktadır. Bu model, melatonin gibi umut verici tedavilerin, artmış oksidatif stres ve değişmiş plasenta fonksiyonu ile ilişkili gebelik komplikasyonları üzerindeki koruyucu etkilerini incelemek için uygundur.

Özet

Bu protokol, villöz sitrotrofoblast hücrelerinin ardışık enzimatik sindirimlerle termde plasentalardan nasıl izole edildiğini, ardından yoğunluk santrifüjlemesi, ortam gradyan izolasyonu ve immünomanyetik saflaştırmanın nasıl yapıldığını açıklar. İn vivo olarak gözlemlendiği gibi, primer kültürdeki tek çekirdekli villöz sitotrofoblast hücreleri, 72 saat sonra çok çekirdekli sinsitiyotrofoblast hücrelerine farklılaşır. Normoksi (% 8 O2) ile karşılaştırıldığında, hipoksi / reoksijenasyon (% 0.5 /% 8 O2) geçiren villöz sitotrofoblast hücreleri, preeklampsi, erken doğum ve intrauterin büyüme kısıtlaması gibi gebelik komplikasyonlarında in vivo olarak gözlenene benzer şekilde artmış oksidatif stres ve intrinsik apoptoza maruz kalır. Bu bağlamda, hipoksi/reoksijenasyon koşulları altında kültürlenen primer villöz trofoblastlar, insan plasentasında değişen mekanizmaları ve sinyal yolaklarını daha iyi anlamak ve belirli gebelik bozukluklarına karşı koruma sağlayan etkili ilaçların araştırılmasını kolaylaştırmak için benzersiz bir deneysel sistemi temsil etmektedir. İnsan villöz trofoblastları melatonin üretir ve sentezleyen enzimlerini ve reseptörlerini eksprese eder. Melatonin, koruyucu antioksidan etkileri nedeniyle preeklampsi ve intrauterin büyüme kısıtlaması için bir tedavi olarak önerilmiştir. Bu yazıda açıklanan primer villöz sitrofoblast hücre modelinde, melatoninin normoksik durumdaki trofoblast hücreleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur, ancak hipoksi / reoksijenasyon ile bozulan sinsityotrofoblast hücrelerinin redoks dengesini geri yükler. Bu nedenle, primer kültürdeki insan villöz trofoblast hücreleri, hipoksi / reoksijenasyon sırasında melatoninin plasental fonksiyon üzerindeki koruyucu etkilerinin arkasındaki mekanizmaları incelemek için mükemmel bir yaklaşımdır.

Giriş

insan gebelik boyunca, mononükleer kök hücreler plasenta sitotrofoblast hücreleri, hızla çoğalır ve villöz veya extravillous sitotrofoblast hücrelerine ya farklılaşırlar. Extravillous sitotrofoblastlar istila ve rahim duvarına spiral arterleri pişmanlık. Villöz sitotrofoblastlar, diğer yandan, çok çekirdekli sinsityotrofoblastik (Sinsityum) 1 oluşturmak için çoğalmaya ayırt ve sigorta devam etmektedir. villöz trofoblast homeostazındaki bakım fetal iyilik ve sağlıklı hamilelik için esastır. Aslında, villus trofoblastlar oksijen ve besin anne-cenin alışverişi sağlar ve gebelik için gerekli hormonları üretmek. Ayrıca, sinsityotrofoblast anne kan dolaşımı ile doğrudan temas halinde, sadece hücre tipi ve gerekli fiziksel ve immünolojik bir engel oluşturur. Bu nedenle, sinsityotrofoblast homeostatik bakım için apoptoz ve değiştirme geçmelidir ve Avo içinid plasental 2-5 yakınmaları.

Insan plasenta primer villus sitotrofoblastlar izole etmek için 1986 yılında Kliman ve ark. 6 tarafından geliştirilen teknik villöz trofoblast farklılaşmasında rol oynayan moleküler mekanizmaların çalışma izin vererek plasental araştırmalarda bir devrim yarattı. yoğunluk santrifüj medyada izole ardından tripsin ve DNaz ile sıralı enzimatik sindirim dayanan bu klasik teknik, (kolloidal silika partikülleri polivinilpirolidon ile kaplanmış, ya da Percoll) artık villus sitotrofoblast hücrelerini izole etmek için altın standart olarak kabul edilmektedir. teknik manyetik immün-, bu hücrelerin yüzeyleri üzerinde spesifik antijenlerin farklı ekspresyonu göre olmayan trofoblastik hücrelerin villöz sitotrofoblastlar ayıran bir prosedürle optimize edilebilir. Biz nedeniyle trofoblastik hücre zarı üzerindeki ifadesinin yokluğu insan lökosit antijeni ABC (HLA-ABC) seçtie 7,8.

Plasenta gebelik sırasında oksijen seviyelerinde dramatik değişimleri uğrar bir organdır. İlk trimesterde, oksijenasyon oranı fizyolojik çok düşük (% 2 O 2), ancak ikinci ve üçüncü üç aylık dönemde oksijenasyonu hafif düzeyde (% 8 O 2) ile artar. Tuuli ve ark., 9 plasental villus içinde trofoblast ortamında in vitro üreme oksijenlenme seviyelerinde bir meydan okuma ve çeşitleri bile fenotipik değişikliklere yol açabilir olduğunu anlattı. Bu nedenle, gebeliğin 8,9 üçüncü trimesterde plasental villus bulunan oksijen gerilimi taklit etmek normoxia olarak% 8 oksijen benimsemeye önerdi olduğunu. Chen ve ark. 10 yoğun trofoblast hücre kültüründe oksijen basıncına ilgili çeşitli değişkenler okudu ve bir hücreyi ortamda oksijen düzeylerinin belirlenmesi önemini gösterdi. villuslarında oksijen seviyeleri artma eğilimindevaskülojenez nedeniyle. Sürekli plasental villus artar kan akımı ve hidrojen peroksit seviyesi (bol bir reaktif oksijen türleri) vaskülojenez 11,12 kontrol eden önemli bir sinyaldir. gebelik komplikasyonları, vaskülojenez eksikliği hipoksi ve daha da önemlisi, oksijenasyon aralıklı varyasyonlar (denilen hipoksi / reoksijenasyonunu) üretir. Bu koşullar plasental ve fetal canlılığı 13,14 ödün oksidatif stres anormal artışa yol açmaktadır. Villöz sitotrofoblastlar da sinsityotrofoblastlarda farklılaşırlar kadar normoksik koşullar (% 8 O 2) altında tutulan aşağıdaki gibidir: trofoblast hücrelerin hipoksi / reoksijenasyonun dönemleri sırasında, in vivo maruz değişiklikler in vitro taklit edilebilir. Daha sonra normoksiyada (reoksijenasyon) arasında ilave bir 18 saat, ardından 4 saat hipoksik koşullar (% 0.5 O 2) tabi tutulur. Bu hipoksi / reoksijenizasyon yaklaşımı kullanarak, ex trofoblastlarBazı gebelik komplikasyonları gözlenmiştir olarak HiBit, redoks durumu ve iç apoptoz 8 daha yüksek düzeyde deregüle. Bu nedenle, bu plasental hipoksi / reoksijenasyon ile ilişkili gebelik komplikasyonları ile mücadele için yeni önleyici ve tedavi yaklaşımları değerlendirmek için in vitro model bir yararlıdır.

Plasenta hücreler oksidatif stres ve plasental disfonksiyon 15 ortadan kaldırmak için bir yeteneği gibi birçok önemli işlevlere sahiptir melatonin üretir. Burada, moleküler, hücresel ve fonksiyonel 8. seviyede plasental trofoblast hücrelerinde melatoninin koruyucu etkisi göstermek için kullanılan deneysel yaklaşım ve hücre modelleri sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Plasenta, bilgilendirilmiş hasta onam ve etik komitelerin (CHUM-St-Luc Hastanesi ve INRS-Institut Armand-Frappier onayıyla, hemen CHUM-St-Luc Hastanesi, Montreal, QC, Kanada'da gebeden gelen spontan vajinal doğum sonrası elde edildi Laval, QC, Kanada).

Villöz sitotrofoblast 1. Hücre İzolasyonu ve Saflaştırılması

  1. Çözümler ve medya
    1. Ilave Nakliye ortamı hazırlamak Dulbecco'nun Eagle Ortamı Yüksek Glikoz% 1 hacim / hacim antibiyotik (DMEM-HG) (10,000 birim / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve mağaza 4 ° C'de modifiye edilmiştir.
    2. % 10 hac / hac cenin sığır serumu (FBS), 25 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES),% 1 hacim / hacim, antibiyotik (10.000 ünite / DMEM-HG ilave birincil kültür ortamı hazırlamak ml penisilin G, 4 ° C de, 100 mg / ml streptomisin sülfat) ve saklayın. 37 ° C'ye ısınmaya ortam öncekullanın.
    3. tuz çözeltisi (% 0.9 ağırlık / hacim sodyum klorür) 4 L hazırlayın.
    4. HBSS (pH 7.4), 1x 25 mM HEPES ekleyerek Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) modifiye hazırlayın.
    5. (Modifiye (1.1.4 hazırlandı) HBSS, magnezyum sülfat (MgSO ^ 4), kalsiyum klorür (CaCl2), tripsin, deoksiribonükleaz IV (DNaz IV) ve% 1 hacim / hacim antibiyotik ile sindirim çözeltisi taze dört şişe hazırlanması Tablo 1 'de gösterildiği gibi, 10,000 ünite / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat).
    6. yoğunluk santrifüj medya degrade hazırlayın
      1. % 10 hacim / hacim HBSS 10x ile yoğunluk santrifüj ortamı tamamlayan tarafından yoğunluk santrifüj medya çözeltisi hazırlayın.
      2. Tablo 2'de tarif edildiği gibi, yoğunluk santrifüj ortam çözeltisi ve modifiye HBSS ile 14 deney tüpleri hazırlayın.
      3. şiddetle degrade içeriğini eklemeden önce her yoğunluk çözüm (adım 1.1.6.2) karıştırın. NazikçeEn yüksek konsantrasyonda (% 70) ile başlayan, bir peristaltik pompa (1 mi / dak) ile 50 ml'lik bir cam santrifüj tüpüne yoğunluk çözeltileri ilave edin. gradyan her bir katmanı uygun ayrılığı korumak için boru duvarına karşı çözüm süzülmesiyle damlacıklar kaçının.
        1. peristaltik bir pompa yokluğunda, Pasteur pipet ile çok yumuşak tabakalar uygulanır.
    7. Çalışan tampon ilave nihai çalışan tampon hazırlayın (10.000 adet / ml penisilin G, 100 mg / ml streptomisin sülfat) antimikotik% 2 hacim / hacim antibiyotik / ile (Malzeme Tablo). 4 ° C'de saklayın.
  2. Villöz sitotrofoblast izolasyon
    Not: Steril cerrahi aletler, cam, pipetler, mataralar, vb
    1. villöz sitotrofoblast izolasyon gün, 37 ° C su banyosu içinde ve FBS, 70 mi (aşama 1.1.5 arasında) sindirimler çözüm ısınmaya. Not: FBS 50 ml Kullanım sindirim ve kesmek içinçözüldükten sonra buz üzerine yerleştirilebilir soğutma aşamasında (1.2.22) için 20 ml geri kalan.
    2. Doğumdan sonra, mümkün (en az 1 saat) kısa sürede (adım 1.1.1) buz gibi soğuk taşıma ortamında laboratuvara plasenta getirmek.
    3. Iskarta taşıma orta ve sıvı çöplüğüne plasental kan. plasentayı tartılır ve soğuk tuzlu su çözeltisi içinde bırakın.
    4. Tedbir ve aşağıdaki özellikleri analiz: göbek kordonu uzunluğu; Göbek kordonu lokalizasyonu; plasental uzunluk, genişlik, şekil (oval, diskoid); membran renk; kotiledon yapı patolojileri. Not: Veriler sonuçlar bölümünde sunulmuştur.
    5. (Kordon etrafında ek 1 cm yarıçapında bir daire ile üssünde, yani) onun plasental ekleme yanında göbek kordonu kesti. Daha sonra histolojik analiz için histolojik doku fiksatif çözeltisi (formalin,% 10) 300 ml bırakın.
    6. 5 x 5 x 5 cm küpler halinde tüm plasentayı kesin. tuzlu, sol içinde (4 kez x ~ 1 dk) iyice yıkayınsalin çözelti berrak olana kadar Katkı (% 0.9), kan hücreleri çıkarmak için. parlatıcı atın.
    7. saat camı olarak, kan damarları ve kalsifikasyon kaldırmak için plasental membranlar ve kıyma dokuları çıkarın. forseps ile sıkıca kan damarları tutun ve Metzenbaum makas arka kullanarak dokuları kaldırın.
      1. Bir Büchner hunisi içinde kıyılmış plasentayı yerleştirin. tuzlu su tampon maddesi, yaklaşık 100 ml ile durulayın. kıyılmış doku 35 gr (tekne ve tartı kullanımı plastik) elde edilir - 30 kadar kıyma devam edin. 35 gr hazırlıkları - Gerekirse, üç ek 30 kadar elde etmek için plasentanın kalanını kıyma. Bu süre boyunca, buz üzerinde bir tartma tekne kıyılmış doku koydu.
        Not: Bu adım 1 saat için yaklaşık 45 dakika sürer.
    8. Bir trypsinizing şişeye 35 gr kıyılmış plasental doku - 30 ekleyin. Aktarım 150 tripsinize şişeye hazırlanan sindirim çözeltisi 1 (Tablo 1) ile yıkanır ve iyice karıştırın.
    9. içinde trypsinizing şişeyi koyunBir çok 50 devir / dk'lık bir hızda 30 dakika boyunca su banyosu çalkalanarak elle tripsinize şişeye homojen sindirim için her 5 dakikada karıştırılır.
    10. İlk sindirim sonunda, su banyosu tripsinize balon çıkarın ve plasenta dokusu çökeltmek için 1 dakika için (45 °) yatırın. 10 ml steril pipet ile çıkarın ve süpernatanın 80 ml atın. doku aspire kaçının.
    11. Aktarım tripsinize şişeye sindirim çözeltisi 100 ml x 2 (Tablo 1); iyice karıştırın ve adım 1.2.9 tekrarlayın.
    12. İkinci sindirim sonunda, su banyosu tripsinize şişeyi çıkarın ve 1 dakika boyunca o 45 ° yatırın. 10 ml steril pipet ile, 80 mi süpernatant kaldırmak ve yavaşça, bir hücre süzgecinden (100 um ağ gözü) olan bir santrifüj tüpüne aktarılır. FBS 2 ml santrifüj tüpü dolu her ihtiva eden bir çanağa filtre süpernatant aktarın.
    13. için tarif edildiği gibi, üçüncü sindirim gerçekleştirmeBuna paralel olarak 75 ml sindirim çözüm 3. kullanarak ikinci sindirim (1.2.11 ve 1.2.12), sindirim 2 1.2.16.1 arasındaki adımları 1.2.15 gerçekleştirin.
    14. Sindirim solüsyonu 4 (75 mi) ile üçüncü bir sindirim tam olarak dördüncü sindirim gerçekleştirmek ama yüzer maksimum miktarda toplamak. sindirim 3 paralel 1.2.16.1 arasındaki adımları 1.2.15 gerçekleştirmek ve nihayet sindirim 4.
    15. (Sindirim 2, 3 arasında ve 4) süpernatant 13.5 mi parçaya, bir 15 ml santrifüj tüpüne her bir parçayı kısım. Bir 22.8 cm uzunluğunda cam Pasteur pipeti ile, çok nazik ve yavaş yavaş ayrı bir katman yaratmak amacıyla her tüpün dibinde FBS 1.5 ml yerleştirin. FBS ve süpernatant karışmaz. Oda sıcaklığında 1.250 x g'de 20 dakika süre ile fren olmayan tüpleri santrifüjleyin.
      Not: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra, 4 kat, tüp içinde görebilir Tripsin ve trofoblast hücrelerin ayrılması, aşırı selüler sindirim önler..
    16. Bir vakum pompası, aspir ileyedik ve iki tabaka arasında beyazımsı film dahil süpernatant (sindirim çözeltisi) ve FBS katmanları, atın. Sıcak hücre kültürü ortamı, 1 ml ile pelet (trofoblast ve kırmızı kan hücresi kat) yeniden süspanse edin (aşama 1.1.2, hiç FBS ve Resim HEPES).
      1. Tüm tüplerinden yeniden süspanse hücreleri toplamak ve 1 tüp içinde bunları birleştirmek. Tüp tüm sindirim sonuna kadar oda sıcaklığında bekletin. Not: Tüm sindirim sonra, her zamanki verimi yeniden süspanse hücreleri (sindirim başına bir) 3 tüp olduğunu.
    17. Sıcak hücre kültür ortamı ile 15 ml hacim oluşturuyor. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1250 x g'de santrifüjleyin. bir vakum pompası ile süpernatantı. pelet çekilmesini önlemek.
    18. Yavaşça sıcak hücre kültürü ortamı, 1 ml 3 tüplerden elde edilen topak yeniden süspanse edin. 1 tüp içinde kendi içeriklerini Havuz. 8 ml elde etmek için, sıcak bir hücre kültürü ortamı olan hacmi tamamlamak.
    19. Çok hafifçe ayırma grad hücre süspansiyonu katmanPasteur pipeti ile sağ- lasa. Oda sıcaklığında 507 x g'de 30 dakika süre ile fren olmayan santrifüjleyin.
    20. Santrifüj işleminden sonra arka aydınlatma ile degradedeki hücrelerin farklı katmanları belirlemek. yoğunluk santrifüj ortamı% 50 - katmanları trofoblast içeren ve 40 ila hücreleri kirletici bulun. Bir vakum pompası ile üst katman (>% 50) çıkarın.
    21. Pasteur pipeti ile ilgi katlarındaki hücrelerde toplamak ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne transfer edin. hücre kültürü ortamı ile 50 ml hacim oluşturmaktadır. Oda sıcaklığında 1.250 x g'de 10 dakika süre ile santrifüjlenir.
    22. Steril koşullar altında, süpernatantı atmak FBS 20 ml pelet tekrar süspansiyon ve bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı. Buz üzerinde, steril dimetil sülfoksit (DMSO) 2.22 ml ilave edilir ve çevirerek hafifçe karıştırın. kriyojenik şişelere hücre süspansiyonu alikotu 1.5 mL, -80 ° C de bir gece boyunca dondurma ve bir sıvı azot tankına aktarılır.
  3. Trofoblast arıtma
    1. durulama ve çalışan tamponlar ve üreticinin talimatlarına göre manyetik arıtma cihaz üzerinde yeni bir filtre sütun takın. negatif 1, pozitif 1 ve pozitif 2 portları temizleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre her port altında 50 ml tüpler tanıtmak "temiz programı" gerçekleştirin.
    2. 37 ° C su banyosu içinde hızla aşama 1.2.22 dondurulmuştur hücreleri çözülme. 50 ml'lik bir tüp hücreleri aktarın ve yavaşça akan soğuk tampon çözeltisi 20 ml tekrar süspansiyon hücreleri. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de tüp santrifüjleyin.
    3. süpernatant atın. akan soğuk tamponu ile yıkama adımı yineleyin. canlılığı belirlemek için bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. santrifüj tekrarlayın (5 dakika, 4 ° C'de 450 xg için). Dikkatle süpernatant kaldırmak. % 1 hacim / fare anti-HLA-ABC antikor vol ihtiva akan soğuk tampon maddesi 1 ml. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir, Mixiyavaşça her 5 dakikada ng.
    4. akan soğuk tampon 6 ml ekleyin. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. Süpernatantı atın ve bu adımı tekrarlayın. % 10 hacim / anti-fare ikincil antikoru ile birleştirilmiş manyetik boncuk vol ihtiva akan soğuk 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri. yavaşça her 5 dakikada, karıştırma, 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    5. akan soğuk tampon 6 ml ekleyin. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. 5 ml soğuk çalışan tampon supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
    6. Manyetik arıtma cihazı kullanılarak trofoblast hücreleri ayırın. Negatif limanda hücreleri toplamak ve akan soğuk tampon 20 ml ekleyin.
      Not: Trofoblast hücreler kompleks HLA-ABC içermez ve bu nedenle negatif 1 portuna doğru diğer hücre tiplerinden ayrılan ve yönlendirilmektedir.
    7. 450 x g'de 5 dakika 4 ° C'de santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça 20 ml ılık birincil kültür ortamında hücreleri tekrar süspansiyon. istimal hücreleri sayınga hemositometre canlılığı belirlemek için.
    8. Plaka, aşağıdaki yoğunluklarda hücre: 0.15 x 10 6 hücre / kuyuda 96-kuyu plakaları, 1.6 x 10 6 hücre / kuyuda 24-kuyu tabak ve 4.5 x 10 6 hücre / oyuk, 6-çukurlu levha. 37 ° C'de ve% 5 CO2 de inkübe edin.
    9. 16,17 sitometri ve / veya 18 immünhistokimya ile akışının trofoblast hücrelerinin saflığını onaylayın.
      Not: immüno hücrelerinin saflığı sitokeratin-7 ve vimentin 17-19 karşı FITC konjüge monoklonal antikor kullanılarak tespit edildi. Bu protokol Lanoix ve ark iyi ayrıntılı., 2008 7.
    10. En az 4 saat sonra, birleşmeyen hücrelerin çıkarılması ve daha sonra% 8 O 2 (Şekil 2 ve bakınız bölüm 2) oluşmaktadır normoksi odası, plakalar transfer sıcak kültür ortamı ile hücreler iki kez yıkayın.

2. İn Vitro termik indüklemeNormoksi n ve Hipoksi / reoksijenizasyonun

  1. Inkübatör odası operasyonu (kurulum için Şekil 2A bakınız).
    1. bir laminar akış başlığı içinde, kuruluğu önlemek için kuluçka odasının altındaki steril su ihtiva eden bir Petri çanağı yer; Daha sonra odanın üstün raflarda önceden hazırlanmış hücre kültürü plakaları veya şişeleri (adım 1.3.10) yerleştirin.
    2. Kapağın dışında, gaz hortumuna bölme (giriş ağzı parçasını) (Şekil 2A: 5a, b ve c) gaz (% 8 O 2 veya% 0.5 O 2) tüpü ulaşmak için (Şekil 2A: 7). odasının hem giriş ve çıkış portları açın. Bu noktada, gaz regülatörü (Şekil 2A: 4) kapalı kalmalıdır.
    3. Dikkatle gaz regülatör vanasını açın (Şekil 2A: 4). 25 L 'lik bir hava akışı ile 4 dakika için Yıkama / dakika pistonun içinde hava yerine.
    4. odasını basması sonra, o giriş ve ou gaz regülatörü kapatınOdanın tlet portları.
    5. Akış ölçer çıkış hortumunu çıkarın (Şekil 2A: 5c) ve odanın giriş portundan 37 ° C 'de, bir hücre kültürü inkübatöründe odası yerleştirin.
    6. Aşama 2.1.3 sonra gazı 1 saat ile odasını doldurmak, kültür ortamı içinde, şu anda tablalar, şişeler içinde mevcut ve çözünmüş hava değiştirin.
    7. Dier gaz bileşimleri için 2.1.6 için 2.1.1 adımları (örneğin,% 2 birinci trimester trofoblast kültürü 9 O 2).
  2. Oksijen yüzdesi onaylayın (Şekil 2B-C)
    1. odası içinde (hücre içermeyen) hücre kültür ortamı içinde, oksijen konsantrasyonunun teyit etmek için, bir oksijen adaptörüne bağlı bir oksijen elektrodu kullanın. Bir voltmetre oksijen elektrodu bağlayın.
    2. Aynı çözelti içinde bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak (yani, hücre kültür ortamı), bilinen oksijen içeriği ile (gazlara çözelti maruz bırakılması ile, örneğin,% 0 ve% 21 oksijen). Kaynaklar her bir konsantrasyon için dengeye oturtulduktan sonra, oda içinde ortam içine elektrot getirmektedir.
      Not: oksijen konsantrasyonu 10 herhangi bir önyargı önlemek için aynı derinlikte tüm ölçüm alın.
  3. trofoblastlar içinde normoxia ve hipoksi / reoksijenasyon indüksiyonu.
    1. Uygun hücre kültürü şişeleri, tabak ya da Petri birincil trofoblast hücreleri ekledikten sonra, gerekli tedavileri yapar.
    2. Buna paralel olarak, bölme içinde belirli bir durum, her 24 saat (Şekil 3) üretmek için istenen gaz karışımına hücrelerin maruz kalmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Vajinal doğum ile elde edilen normal bir terim plasenta İzolasyon ve villöz sitotrofoblast hücrelerinin immünolojik saflaştırma 1 x 10 8 canlı hücreleri elde edildi. Plasenta, 350 g ağırlığında diskoid şekil ve şeffaf membran ile 4 cm boyunda çapı 19 cm idi. Hiçbir kotiledon malformasyon tespit edildi. Göbek kordonu Parasantral lokalizasyon ve 56 cm'lik bir uzunluğa sahipti. saflık vimentin ve sitokeratin-7 belirteçleri kullanarak flow sitometri ile değerlendirildi. Hücrel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Memelilerde, fetal gelişim yeterli plasental fonksiyonu üzerine doğrudan bağlıdır. Sağlık bozukluklarının gelişimsel kökenleri sonraki hayatında tecelli hastalıkların nedeni erken gelişmesine ve plasenta, fetal programlama 30-32 bir mekanik role sahip olduğu geri izlenebilmektedir hipotezine dayanmaktadır. Bu besin devrini düzenleyen zararlı maruz karşı korur ve önemli endokrin fonksiyonlara sahiptir: plasenta, fetal büyüme ve gelişmenin temel aracıydı. Kliman ve arkadaşları tarafından geliştiril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden (NSERC) (no. 262011-2009) CV'ye ve March of Dimes Sosyal ve Davranış Bilimleri Araştırma hibesi (#12-FY12-179) ile CV ve JTS'ye verilen hibelerle desteklenir; Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) ve Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS'den LSF'ye öğrenci bursları ile, Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE'den HC'ye, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) ve FRQ-Santé'den AAHT'ye ve NSERC'den JBP'ye; Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) ve Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT'den EMAS'a burs ile.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kavisli Metzenbaum MakasShandon9212cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet)
Splinter Foreps Fine 41/2 inFisherbrand13-812-42cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet)
Makas 4.5 Str DiseksiyonFisherbrand08-940cerrahi ekipman (hücre izolasyonu) (2 adet)
Gazlı Bez Sünger 10 cm x 10 cmKardinal Sağlık
Dikdörtgen Cam Pişirme KabıPyrex1105397Züccaciye (2,8 L)
Huni BuchnerCoorstek Inc10-356EZüccaciye (114 mm çap)
Saat Camı pyrex9985100EMDZüccaciye
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10Sigma-AldrichHT501128-4Lhistolojik doku fiksatif çözeltisi
Tripsiniz ŞişeleriWheaton355395Züccaciye (1 adet)
Tek Kullanımlık Kültür TüpleriKimble73750-13100Züccaciye
Borosilikat Cam Pastör Pipeti (22,8 cm)FisherbrandK63B1367820CZüccaciye
250 ml Cam BeherlerFisherbrandKFS14005250Züccaciye
Kapaklı Cam Ortam ŞişeleriFisherbrandKFS14395250Züccaciye (8 adet
)50 ml Corex Tüp Corning8422-A(1 adet)
15 ml Polistiren Santrifüj TüpüCorning430791
50 ml Polistiren Santrifüj TüpüCorning430829
10 ml SerolojikPipet Corning11415038
Hücre Süzgeci 100 & mu; m NaylonCorning431752
Emici AstarScienceware1199918
500  ml Şişeler Üst FiltreCorningGözenek: 0.22  &mikro; m / orta ve HBSS hazırlama
2 ml Kriyojenik ŞişelerCorning430488
Dondurma Kabı, Nalgene Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EA
Peristaltik PompaPharmacia İnce KimyasallarP3 modeli
Çalkalama SuBanyosu FisherModel 127
Vakum PompasıABM4EKFS6CX-4
Sodyum KlorürFisherbrandEC231-598-3Tuzlu su çözeltisi %0.9
Hank' s Tamponlu Tuz Çözeltisi (Hbss)Sigma-AldrichH2387Miktar: 1 L sindirim çözeltisi için 9,25 (bir şişe)
Hidroksipiperazineethansülfonik Asit (Hepes)Life Technologies15630-0801 L sindirim çözeltisi için 25 ml (1 M)
Tripsin Tip ISigma-AldrichT80039,888 U
Deoksiribonükleaz Tip IVRoche10-104-159-001402,000 U
Kalsiyum KlorürSigma-AldrichC4901100 mM
Magnezyum SülfatFırıncı2500-01800 mM
Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta Yüksek Glikoz (Dmem)Yaşam Teknolojileri10564-045
Penisilin / Streptomisin Sülfat HiklonSV30010
Fetal Sığır SerumuCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Yoğunluk santrifüjleme ortamı gradyanı. Hacim: 36 ml
İzopropanolAcros42383-001050 ml
Dimetil SülfoksitSigma-Aldrich472301
Automacs Manyetik AyırıcıMiltenyi BiotecModel 003
Automacs  Sütunlar Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs Çalışan Tampon Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs Durulama Solüsyonu Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anti-İnsan Hla Abc Saflaştırılmış Klon W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82anti-fare antikoru
Anti Fare Igg MikroboncuklarMiltenyi Biotec130048401
Çok Kuyulu Plaka -  6 Kuyulu KapakCorning3335Hücre Bağlama yüzeyi
Çoklu Kuyu Plakası -  24 Kuyulu KapaklıCorning3337Hücre Bağlama yüzeyi
Çoklu Kuyu Plakası -  96 Kuyu KapaklıCorning3300Hücre Bağlama yüzeyi
Modüler İnkübatör Odası Billups-RothenbergMIC-101Normorxia ve hipoksi/reoksijenasyon koşullarını aynı anda oluşturmak için iki set gereklidir
Tek AkışÖlçer Billups-RothenbergSFM3001
50 mm Sıralı FiltreWhatman6721-5010PTFE, gözenek: 1.0 ve mikro; m
Gaz RegülatörüPro StarPRS301233Normoroksi ve hipoksi/reoksijenasyon koşullarını aynı anda oluşturmak için iki set gereklidir
Gaz Hortumu Sınıf Vi Clear 5/16 Parker100-050701023 adet ~ 0,5 m
17 mm Ayarlanabilir Gaz Hortumu KelepçesiKravat SargılarıTHCSS-16
Normoxia Gaz Tüpü PraxairNI CDOXR1U-KBoyut K (3rd trimesterin bileşimi: %5 CO2, %8 O2, Bal. N2)
Normoxia Gaz Tüpü PraxairNI CDOXR1U-KBoyut K (3rd trimesterin bileşimi: %5 CO2, %0.5 O2, Bal. N2)
Oksijen Mikroelektrodu Mi-730Mikroelektrotlar INC84477
Oksijen AdaptörüMikroelektrotlar INC3572
ROS Algılama Reaktifi: CM-H2DCFDA InvitrogenC-400
ve beta; -hCG ELISA kiti ve nbsp;DRG internatinalEIA-4115
Anti-Vimentin saflaştırılmış antikoreBioscience14-9897Konakçı: fare
Anti-Sitokeratin 7 (FITC) antikoru  Abcamab119697Ev sahibi: fare
Alexa Fluor 488 Keçi Anti-köpük IgG H & L antikoruYaşam TeknolojileriA-11029
361020733

Kaynaklar

  1. Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
  2. Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
  3. Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
  4. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
  5. Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
  6. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  7. Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
  8. Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
  9. Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
  10. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
  11. Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
  12. Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
  13. Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
  14. Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
  15. Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
  16. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
  17. Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
  18. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
  19. Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
  20. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
  21. Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
  22. Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
  23. Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
  24. Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
  25. Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
  26. Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
  27. Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
  28. Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
  29. Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
  30. Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
  31. Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
  32. Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
  33. Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
  34. Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
  35. Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
  36. Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
  37. Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71(2015).
  38. Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
  39. Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
  40. Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
  41. Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
  42. Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
  43. McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
  44. Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
  45. Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
  46. Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
  47. Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
  48. Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
  49. Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
  50. Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
  51. Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
  52. Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
  53. Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
  54. Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
  55. Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141(2013).
  56. Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vill z Sitotrofoblast zolasyonuPrimer Trofoblast K lt rHipoksi Reoksijenasyon ModeliMelatoninin Koruyucu Etkilerimm nomanyetik Safla t rmaYo unluk Santrif gasyonuAk Sitometrisi AnaliziSinsityotrofoblast DiferansiyasyonuOksidatif Stres De erlendirmesiBeta hCG Salg lamas
İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.