Method Article

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

DOI:

10.3791/54231

⸱

August 28th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA'nın proteine çevirisi, temel ve yüksek düzeyde düzenlenmiş bir biyolojik süreçtir. Polizom profillemesi, translasyonel düzenlemenin analizi için altın standart olarak kabul edilir. Burada açıklanan yöntem, çeşitli bitki dokularından polizomları parçalamak için kolay ve ekonomik bir yoldur. Her katmanı sırayla dondurarak bir gradyan yapıcıya ihtiyaç duymadan bir sükroz gradyanı yapılır. Sitozolik ekstraktlar daha sonra sitozolik ve kloroplastik ribozomları mRNA'ya hareketsiz hale getirmek için sikloheksimid ve kloramfenikol içeren bir tampon içinde hazırlanır ve sükroz gradyanına yüklenir. Santrifüjlemeden sonra, ultrasantrifüj tüpünü delmeden altı fraksiyon doğrudan gradyanın altından üstüne toplanır. Toplama sırasında, 260 nm'deki absorbans, küresel öteleme aktivitesinin anlık görüntüsünü veren bir polizom profili oluşturmak için sürekli olarak okunur. Fraksiyonlar daha sonra üç farklı mRNA popülasyonu hazırlamak için bir araya getirilir: polizomlar, birkaç ribozoma bağlı mRNA'lar; monozomlar, bir ribozoma bağlı mRNA'lar; ve ribozomlara bağlı olmayan mRNA'lar. mRNA'lar daha sonra ekstrakte edilir. Bu protokol, Arabidopsis thaliana fideleri ve yetişkin bitkiler, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum ve Oryza sativa yaprakları dahil olmak üzere farklı bitki ve dokular için doğrulanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein sentezi, bütün hücreler 1 çok önemli ve enerjik olarak masraflı bir işlemdir. Her şeyden önce, hücreler için makine, ribozom üretiminde enerji yatırım gereklidir. Örneğin bir aktif bölünmesi maya hücre Dakikada kadar 2.000 olarak ribozomlar üretir. Böyle bir üretimi toplam transkripsiyonel aktivitenin% 60 ve hücrenin 2 toplam birleştirme etkinliğinin% 90 kadar gerektirmektedir. Ayrıca, enerji amino asitler, aminoasil-tRNA ve peptid bağlarının sentezi için gereklidir. Bitkilerde, ATP 3 4.5 5.9 moleküllerden bir peptid zinciri maliyetlerine bir amino asit eklenerek. Nedenle, protein mRNA'nın çeviri bunun değişen çevre koşullarına ile ilgili söz konusu, özellikle düzenlemenin önemli bir yer olması şaşırtıcı değildir.

Ribozom bir mRNA'nın birliğidir çeviri başlangıç ​​aşaması, düzenlenmesi ana hedefidirçeviri 4. Bir tercüme düzenlemenin bir sonucu olarak ve diğer transkripsiyon sonrası düzenleme adım olarak, protein konsantrasyonuna varyasyonları sadece% 40 mRNA bolluğu 5,6 ile açıklanabilir. Böylece, toplam mRNA çalışma protein bolluğu hakkında nispeten zayıf bilgi verir. Öte yandan, ribozom ile mRNA'nın dernek çeviri katılanların mRNA erişim sağlayan protein bolluğu içine daha iyi fikir verir. Aktif tercüme mRNAlar polisomlann adlandırılan yapılar çeşitli ribozom ile ilişkilidir. Tersine, kötü çevrilmiş mRNA'ların tek Ribozom (monosome) ile ilişkili olacaktır. Sonuç olarak, bir mRNA'nın translasyon durumu ribozom 7 ile ilişkisi izleyerek değerlendirilebilir.

Bu protokol altı gün eski Arabidopsis thaliana fide, RNA sonraki izolasyonu polizom izolasyonunu ve sonuçların analizini açıklar. polysomes ve monosomes bir sükroz yoğunluk gradyanı ile ayrılmıştır. Gradyanlar altı fraksiyon halinde toplanır. Polisomlar, monosomes ve ribozomlar ile ilişkili olmayan serbest 60S ve 40S ribozomal alt birimleri ve mRNA içeren hafif kısmını (bundan sonra adlandırılan yüzer madde): kesirler Bazı üç iyi ayrılmış kesirler elde etmek için bir araya getirilir. Küresel için etkinliği ve polisomlann profilleri karşılaştırarak eğri altında kalan alan entegrasyonu tarafından belirlenen bir polisom / monosome oranı üretilmesiyle tahmin edilebilir. mRNA ve proteinlerin daha sonra farklı fraksiyonlardan çıkarılır ve RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, mikrodizi, Western blot veya proteomik ile analiz için kullanılmıştır. Bu protokol, diğer bitkiler ve dokular için onaylanmıştır.

Bu protokol gerçekleştirmek için gerekli ekipman yaygın çoğu laboratuvarlarda bulunur: bir degrade üreticisi için gerek yoktur. Bir sonraki önlemek eklemeden önce her katmanı Donmatabakaların herhangi bir karışımını ya da rahatsızlık dan. Resim boru delicisi gradyanı içinde bir cam kılcal tüp daldırma ile elde edilebilmektedir gradyan toplanması için kullanılır. Bu nedenle, yüksek maliyetli ultrasantrifüj borular hasarsız kalır ve birçok kez yeniden kullanılabilmektedir. Topluca, bu mevcut protokol Polizom profil için kolay ve ucuz bir yöntemdir yapar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

% 20 ila 50 (ağırlık / hacim) sukroz dereceleri hazırlanması 1.

Not: Gradyan 13,2 ml'lik bir ultra santrifüj tüpüne sükroz 4 kat (% 50,% 35 ve% 20 2 kat) imal edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, iki ayrı katmanlar halinde% 20 sukroz dökme ölçüde Polizom hazırlıkları kalitesini artırır.

  1. stok çözümleri hazırlayın. tüm çözümler RNAse ve DNAse serbest olduğundan emin olun.
    1. 400 mM Tris-HCI pH 8.4, 200 mM KCI, 100 mM MgCl2: 10X tuz solüsyonu.
    2. 200 ml 1X tuz çözeltisi içinde sakrozun 137 g çözülür: 2 M sukroz çözeltisi hazırlayın.
  2. gradyanlar hazırlamak için, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, tuz çözeltisi içinde sukroz çözeltisi ile seyreltilir. Verilen miktarlar altı geçişlerini içindir.
Nihai sakaroz konsantrasyonu sukroz 2M (mi) Tuz çözeltisi 1X (mi) Nihai Vol. (mi)
% 50 8.8 3.2 12
% 35 12.9 12.1 25
% 20 7.4 17.6 25
% 20 5.8 14.2 20

Tablo Sukroz Çözüm 1. dilüsyonlar altı geçişlerini hazırlamak.

  1. Tablo 2'deki gibi katmanları dökün.
sukroz katmanıdır % 50 % 35 % 20 % 20
Vol. (Mi) 1.85 3.65 3.65 1.35

Katman başına sukroz çözeltisi Tablo 2. Cilt.

  1. Her katman döküldükten sonra, bir -40 ° C tüpler tutmak veya -80 ° C derin dondurucuda tam donma kadar bir sonraki sakaroz katmanı eklemeden önce. Donma, genellikle -40 ° C de 2 saat sonra elde edilir, ancak bir sonraki tabaka dökülmeden önce yaklaşık 6 saat bekleyen önerilir. Son 20% tabaka donduruldu ve deney gününde taze olarak ilave edilebilir.
    Not: Bir sonraki bir eklemeden önce her bir katmanı Donma tabakaların herhangi karıştırma veya rahatsızlık önler. Gradyanlar bir -40 ° C'de saklanır ya edilebilir -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya en az altı ay süreyle.
  2. Zaten bitmiş değilse, deney günü degradeler son% 20 katman ekleyin. Sonra, degradeler soğuk bir odada ya da bir buzdolabı çözülme sağlar.

Sitosolik özleri 2. Hazırlık

Not: tavsiyesinebiyolojik numune başına iki gradyanları kullanılarak sona erer. 300 mg 6 günlük, Arabidopsis thaliana fide çalışırken iki gradyan hazırlanması için bitki malzemesi uygun bir miktardır. az translationally aktif dokularda çalışırken, bitki materyali miktarı 600 mg kadar artırılabilir.

  1. ½ Murashige ve Skoog yetiştirilen Hasat altı gün eski fideler 8 orta sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulması ile% 1 sükroz veya eşdeğer medya ile desteklenmiş
  2. sıvı nitrojen ile önceden soğutulmuş havan ve tokmak taşlama bitki malzemesi.
  3. önceden soğutulmuş tartım tabağına toz malzemenin 300 mg tartılır. Numunenin çözülme önlemek için hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin.
    Not: -80 ° C derin dondurucuda en fazla bir hafta dondurulmuş örnekleri tutun.
  4. Dallanmış önceden soğutulmuş polisom tamponu 2.4 ml (Tuz Çözeltisi 4X, 5.26 mM EGTA,% 0.5 (h / h) oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol, 50 μg.ml -1 sikloheksimid, ekleme 50 μg.ml 1kloramfenikol) ve pipet ile karıştırılarak homojenize. iki adet 1,5 ml tüpler içine aktarın. ısınma örnekleri önlemek için hızlı bir şekilde çalışın.
  5. bir mikrosantrifüj 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin yıkıntıları pelet haline getirildi.
    Not: Her zaman, RNA bozulmasını önlemek 4 ° C'de örnekleri tutmak için, RNaz / DNaz ücretsiz koşullarda RNaz / DNaz ücretsiz çözümler ve çalışmayı kullanma. Heparin RNA korumasını geliştirmek için, 300 μg.ml -1 nihai konsantrasyona kadar, polisom tampon eklenebilir. Ancak, aşağı analizi engelleyebilir heparin beri, bu lityum klorür yağış yerine etanol yağış (bkz not 4.7) gerçekleştirerek RNA yağış adımı sırasında kaldırılması gerekir.

3. Polizom Profil

  1. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant pipetle. Bitki parçaları pipetle varsa, adımı 2.5 tekrarlayın. hafifçe pipettin tarafından degrade üstünde yüzer yükleyinsabit bir akışı tüpün yan duvar üzerine g. Her 1.5 ml tüp için bir degrade kullanın.
  2. (A SW41 rotor kullanıldığında, örneğin 32.000 rpm) bir ultrasantrifüjdeki, 4 ° C'de 2 saat 45 dakika süre ile 175,000 x g'de kepçe ve santrifüj soğutulmuş aktarın.
  3. Şekil 1'de açıklandığı gibi degrade toplama sistemi kurmak. UV küvet 1 mm yol uzunluğuna sahiptir.

figure-protocol-1
Şekil 1. Gradient toplama sistemi. UV küvet degrade altına inen bir cam kılcal tüp polivinil klorür boru ile bağlanır. degrade bir peristaltik pompa sistemi sayesinde yoluyla ilerler. OD 260 sürekli okunur ve 2 ml'lik fraksiyonlar toplanır. Büyük halini görmek için tıklayınızbu figür.

  1. Oda sıcaklığına fraksiyon toplayıcısı ayarlayın ve 2 mi fraksiyon koleksiyonu sağlayacak bir hızda döner bandı ayarlayın. Önceden soğutulmuş toplama tüpleri kullanın.
  2. gradyan toplama sistemine polivinil klorür boru ile bağlı bir cam kılcal tüp kullanarak alttan üste doğru kesirler toplayın. polivinil klorür boru ve cam kılcal boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için plastik bir parafin filmi kullanın.
  3. degrade yukarıya doğru 260 nm'de absorbansı okumak. Tüm gradyanı elde edildiğinde, RNA ekstraksiyonu önce buz üzerinde toplama tüpleri.

4. RNA Ekstraksiyon

  1. aşağıdaki gibi, santrifüj tüpleri şapkalı 50 ml iki geçişlerini toplanan kesirler, havuz:
    Polizom: fraksiyonlar 1-3 (12 mi)
    Monosomes: fraksiyon 4 (4 mi)
    Süpernatant: fraksiyonlar 5 ve 6 (8 mi)
  2. Her fraksiyon için, 1 vol ekleyin. 8 M guanidin hidroklorür,50 ug akril taşıyıcısı ve 1.5 hac. izopropanol.
    Not: Akrilik taşıyıcı alkol çökeltme sırasında, nükleik asitlerin geri kazanımını arttırmak için coprecipitant olarak kullanılan lineer akrilamid vardır.
  3. tüpler ters çevirerek karıştırınız ve -20 ° C 'de O / N hızlandırabilir.
  4. bir ultrasantrifüjdeki 4 ° C'de 1 saat, (a SW32 rotor içinde 32.000 rpm) 175,000 x g'de santrifüjleyin. Çökeltme aşaması, ultra-santrifüj ile uyumlu olmayan bir tüp içinde gerçekleştirilir, uygun bir tüp aktarın.
  5. Süpernatant atılır ve 200 mL RNaz içermeyen TE tamponu (10 mM Tris-HCI, pH 7,5-1 mM EDTA) içinde pelet çözülür. yeni bir 1.5 ml'lik tübe transfer edin.
  6. 1 vol ekleyerek RNA ayıklayın. suyla doyurulmuş fenol (pH 6.6) ve 1 hacim. kloroform: izoamil alkol (24: 1). kuvvetlice karıştırın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin. yeni bir 1.5 ml'lik tübe sulu faz transfer.
    Not: asit fenol (pH 4.5), DNA kontaminasyonu en aza indirmek için de kullanılabilir.
  7. 1/10 vol ekleyerek RNA hızlandırabilir. 3 M sodyum asetat ve 3 hac. % 100 etanol eklenmiştir. -20 ° C'de 20 dakika veya O / N -80 ° C'de çökelmesine izin verin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin.
    Not: polisom tamponu (bakınız Not 2.5) içinde heparin kullanılarak, uygun bir şekilde alt analizi 9 müdahale edebilecek heparin arındırıldı etanol çökeltme yerine lityum klorür (LiCİ) çökelmesini gerçekleştirin. Ekstraksiyon işleminden sonra, 4 ° C'de 20 ° C veya O / N 30 dakika çöktürülmüştür 2.5 M bir son konsantrasyona kadar LiCI ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin.
  8. 500 ul% 75 etanol ile pelet yıkayın. Hava pelet kurutulur ve 30 ul TE tampon maddesi içinde çözülür. Bir RNazsız% 1.2 agaroz jeli (100V, 15 dakika) ya da kapiller elektroforez yöntemlerle elektroforez RNA kalitesini değerlendirmek.

5. Veri Analizi

  1. Bir grafik ve veri analizi yazılımı İhracat ham veriler.
    NotŞekil 2A ve B de gösterildiği gibi, ham profil niteliksel bilgileri vermek: görülebileceği polisom tepe sayısı monosome tepe yüksekliği ve serbest ribozom alt birimlerine karşılık gelen bir omuz varlığı.
  2. örnekler arasındaki profillerin karşılaştırılması izin profilleri Birleştirme. Her numune için monosome zirve X değerini belirlemek için ekran okuyucu aracını kullanın ve eğrilerin başında ekstra veri noktaları kaldırarak monosome doruklarına hizalayın. eğrinin en alçak noktası belirlemek ve Y değeri (ekran okuyucu aracını kullanarak) belirler. "Set sütunları değer" fonksiyonunu kullanarak 0'a en alçak noktası Y değerini ayarlayın.
  3. Ham bulunmaktadır (Şekil 3C) için eğri altındaki alanların integrasyonu ile belirlenmişlerdir polisomlann / monosomes oranını belirler. alanın sınır entegre edilecek tanımlamak için veri seçici aracını kullanın. Sonra entegre fonksiyonu (Analiz-Matematik) kullanın.
  4. normalleştirmekmonosome tepe zirvesine Y değerine göre bir eğrinin tüm veri noktalarını bölerek monosome zirve eğrileri (ekran okuyucu aracını kullanarak belirlenir). sütunu seçin, ardından Analiz-Matematik altında, Normale seçin ve "belirli bir değere bölünmesi" yöntemleri seçin. Bu adım, polizom göreli seviyesi (Şekil 3D) karşılaştırılmasına olanak sağlar.

figure-protocol-2
Şekil 2. Örnek polisom profilleri., Arabidopsis thaliana, vahşi tip (wt, ekotip col-0) ve mutant fideleri uzun gün fotoperiyodların (16 saat ışık, 8 saat karanlık) altında yarım Murashige ve Skoog ortamı üzerine, altı gün süre ile büyütülmüştür. A: wt fideler ham Polizom profilleri. B: mutant fideler ham Polizom profilleri. C: eğri D altındaki alanın entegrasyonu ile polizom ve monosomes yüzdesinin belirlenmesi: Polizom profiles monosome zirveye normalize. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Literatürde, polisom profilleri genellikle örneğin, yukarıdan aşağıya doğru, gradyanlar toplanır şeklinin bir sonucu olarak, ağır fraksiyonuna hafif fraksiyondan gösterilmiştir. Burada anlatılan protokolde geçişlerini alttan üste doğru toplanır, biz göstermek profilleri ağır fraksiyon (Polisomlar) ile başlar ve hafif fraksiyon (serbest ribozom alt birimlerinin ve RNA'lar) (Şekil 2A) gidin. Daha sonra, altı, 2 ml fraksiyonlar her gradyanı toplama ancak polisom içeriğine i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunduğumuz protokol, polizom profilleri oluşturmak ve polizomlar, tek ribozomlar veya ribozomlar içermeyen mRNA'ları izole etmek için kolay ve ucuz bir yöntemdir. Literatürde çok çeşitli farklı polizom fraksiyonlama yöntemleri tanımlanmıştır. Burada anlattığımız yöntem, yalnızca gerekli bileşikleri tutacak şekilde optimize edilmiş ve bitki materyali için uyarlanmıştır. Özellikle, deterjan11 miktarını azalttık ve kloroplastik ribozomları mRNA'ya sabitlemek için tampona kloramfenikol ekledik (sikloheksimi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-14-CE02-0010) tarafından desteklenmiştir. Biz yazının eleştirel okuma Dr Benjamin Field ve Dr. Elodie Lanet teşekkür ederim. Biz video düzenleme ile yaptığı yardım için Bay Michel Terese teşekkür ederim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ultrasantrifüj tüpü, ince duvar, poliallomer - 13.2 mlBeckman Coulter331372
Ultrasantrifüj tüpü, ince duvar, poliallomer - 38.5 mlBeckman Coulter326823
Cam kılcal boruDrummond Scientific1-000-1000
Ultrasantrifüj Beckman CoulterOptima serisi
Ultrasantrifüj Rotor SW41Beckman Coulter331362
Ultrasantrifüj Rotor SW32Beckman Coulter369650
Peristaltik pompaHerhangi bir
Tygon R3607 polivinil klorür borusu ve nbsp;Fisher Scientific070534-22Polivinil klorür boru, 2,29 mm 
Fraksiyon toplayıcı Model 2110Bio-Rad731-8120
UV küvetHellma170.700-QSKuvars akışlı küvet
UV Spektrofotometre VarianCary50Her 0.0125 saniyede bir okuyun
Tüm kimyasallarHerhangi BirKullanım Sadece Moleküler Biyoloji Sınıfı
Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı (MS)Sigma-AldrichM5524
Rnase-Free waterHerhangi bir
Petri KabıFisher Scientific10083251 
Oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol, dallı (Nonidet P40)EuromedexUN3500
Doğrusal akrilamid (akrilik taşıyıcı)ThermoFischer bilimselAM9520RNA çökeltme taşıyıcı
OriginPro 8OriginLabAnaliz yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, C. J., Millar, A. H. Protein turnover in plant biology. Nat Plants. 1 (3), 15017(2015).
  2. Warner, J. R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast. Trends Biochem Sci. 24 (11), 437-440 (1999).
  3. Amthor, J. S. The McCree-de Wit-Penning de Vries-Thornley Respiration Paradigms: 30 Years Later. Ann Bot. 86 (1), 1-20 (2000).
  4. Preiss, T., W Hentze, M. Starting the protein synthesis machine: eukaryotic translation initiation. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 25 (12), 1201-1211 (2003).
  5. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2013).
  6. Baerenfaller, K., et al. Genome-scale proteomics reveals Arabidopsis thaliana gene models and proteome dynamics. Science. 320 (5878), 938-941 (2008).
  7. Zanetti, E., Chang, I., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of Polyribosomal Complexes of Arabidopsis for Global Analysis of Gene Expression. Plant physiol. 138 (2), 624-635 (2005).
  8. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  9. del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
  10. Arabidopsis protocols. Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J. , Methods in molecular biology; 323. Clifton, N.J. (2006).
  11. Piques, M., et al. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis. Mol syst biol. 5 (314), 314(2009).
  12. Morita, M., Alain, T., Topisirovic, I., Sonenberg, N. Polysome Profiling Analysis. bio-protocol. 3 (14), 3-8 (2013).
  13. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS One. 8 (8), (2013).
  14. Sormani, R., et al. Sublethal cadmium intoxication in Arabidopsis thaliana impacts translation at multiple levels. Cell Physiol. 52 (2), 436-447 (2011).
  15. Lanet, E., et al. Biochemical evidence for translational repression by Arabidopsis microRNAs. Plant cell. 21 (6), 1762-1768 (2009).
  16. Jabnoune, M., Secco, D., Lecampion, C., Robaglia, C., Shu, Q., Poirier, Y. A Rice cis-Natural Antisense RNA Acts as a Translational Enhancer for Its Cognate mRNA and Contributes to Phosphate Homeostasis and Plant Fitness. Plant cell. 25 (10), 4166-4182 (2013).
  17. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470 (10), Elsevier Inc. (2010).
  18. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. PNAS. 111 (1), 203-212 (2013).
  19. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingPlant TissuesSucrose GradientRNA ExtractionUltracentrifugationCytosolic ExtractFraction CollectionOD MeasurementArabidopsis ThalianaNicotiana Benthamiana

Related Articles