Yöntem makalesi

Atıksu Arıtma Süreçlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi için Kimya ve Ekotoksikolojik Yöntemlerinin bir pil kullanılması östrojenik Potency çıkarmak

15.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54243

⸱

11 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University

Bu makalede

Özet

Endokrin Bozucu Bileşikler (EDC) Akuatik çevre için önemli bir risk oluşturmaktadır. Belediye atıksu arıtma tesisleri yüzey sularının östrojenik etki gücüne önemli katkıda bulunmaktadır. Bu yazıda verilen metodoloji EDC kaldırılması ile ilgili etkinlik ve atıksu arıtma süreçlerinin uygunluğunun değerlendirilmesi için izin verir.

Özet

Endokrin Bozucu Bileşikler sucul ortam için önemli bir risk oluşturmaktadır. Etinilistradiol (EE2) ve estron (E1), yakın zamanda Avrupa Su Çerçeve Direktifi kapsamında çevresel kirleticilerin izleme listesine dahil edilmiştir. Belediye atık su arıtma tesisleri, yüzey sularının östrojenik gücüne önemli katkıda bulunur. Atık su arıtma tesisi (AAT) atık sularının östrojenik potansiyelinin çoğu, bu maddelerin arıtma tesisinde eksik uzaklaştırılması nedeniyle estradiol (E2), EE2 ve E1 dahil olmak üzere steroid östrojenlerin deşarjına bağlanabilir. Atık su arıtma proseslerinin etkinliğinin değerlendirilmesi, çoğunlukla kimyasal analiz yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilen tek tek maddelerin kantitatif olarak belirlenmesini gerektirir. En sık kullanılan yöntemler arasında Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GCMS/MS) veya çoklu reaksiyon izleme (MRM) kullanan Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (LCMS/MS) bulunur. Düzenleyici amaçlar için çok yararlı olmasına rağmen, hedeflenen kimyasal analiz yalnızca izlenen bileşikler (ve spesifik metabolitler) hakkında veri sağlayabilir. Ekotoksikoloji yöntemleri ayrıca, üretilen herhangi bir yan ürünün veya mevcut bilinmeyen östrojenik bileşiklerin de biyolojik aktivitelerinin ölçülmesi yoluyla değerlendirilmesini sağlar. Atık su numunelerinin östrojenik aktivitesini ölçmek için Maya Östrojen Ekranı (YES) dahil olmak üzere bir dizi in vitro biyo-analiz mevcuttur. İn vivo ve in vitro biyo-tahlillerle bağlantılı kimyasal analiz, östrojenik endokrin bozucu bileşiklere göre atık su arıtma proseslerinin etkinliğinin ve uygunluğunun değerlendirilmesi için yararlı bir araç kutusu sağlar. Bu makale, laboratuvar ve saha çalışmalarında konvansiyonel, gelişmiş ve gelişmekte olan atık su arıtma süreçlerini değerlendirmek için bir dizi kimyasal ve ekotoksikoloji testi kullanmaktadır.

Giriş

Yaban hayatı üreme sağlığı konusunda endokrin bozan bileşiklerinin olumsuz etkileri ile ilgili endişeler Su Çerçeve Direktifi (SÇD) altında "watch list" iki östrojenik maddeler (östradiol ve etinilestradiol) yerleştirmek için Avrupa Birliği'ne yol açmıştır. EDC doğal ve sentetik steroid östrojenler, uyuşturucu, böcek ilaçları ve endüstriyel kimyasallar ve yaban hayatı üzerinde bilinen olumsuz etkileri ile tüketici ürünlerinin bileşenleri de dahil olmak üzere kimyasal sınıfların, çeşitli kapsamaktadır. Bu bileşiklerin bazıları, potansiyel olarak insan sağlığını 1 etkileyebilir.

Araştırma AAT gelen çıkış maddeleri halinde 2 balık östrojenik olduğunu göstermiştir ve bir sonucu olarak, birçok alıcı suların balık 3 östrojenik bulunmaktadır. Bu, ilk yabani erkek balıkların kanı ve yüksek öncesi (kadın özel sarısı protein habercisi 4) artarak vitellogeninin konsantrasyonlarını gösterdi Birleşik Krallık ulusal anketler aracılığıyla gösterilmiştirdeğerlik interseks normalde gonochoristic balık türlerinin 5,6 (erkek balık testislerde yumurta ve / veya kadın üreme kanalları geliştirerek).

Geleneksel atık su arıtma tipik haliyle çözündürüldü ve organik madde atılır ve birincil ve ikincil muamele edilir, bir ön tarama oluşan üç aşamalı bir işlemdir. Bireysel EDC çıkarılması etkinliği maddelerin fiziko-kimyasal özelliklerine ve uygulanan muamele işleminin etkililiğinin bağlıdır. adsorpsiyon ve biyolojik bozulma yoluyla birçok EDC çıkarılması için önemli ama eksik olabilir. Üçüncül arıtma, kum filtrasyonu gibi (örneğin ozon için) ileri oksidasyon kullanarak gelişmiş tedavi ise EDC kaldırılmasını 7 arttırılmasında etkili olabilir ya da aktif karbon komple kaldırma 7 yakın ulaşmada etkili olabilir.

Atıksu arıtma nee için herhangi bir yeni teknoloji değerlendirmesiDS EDC çıkarılması önerilen işlemin etkinliğini belirlemek için. Hedeflenen kimyasal ekotoksikolojisi test birlikte analiz, in vivo ve in vitro biyo-deneylerde kullanılarak dahil testlerin, bir pil, bu amaç için kapsamlı bir veri sağlar. düzenleyici amaçlar için çok yararlı olmasına rağmen, hedeflenen kimyasal analiz sadece izlenir bileşikler (ve spesifik metabolitler) hakkında veri sağlayabilir. Biyolojik tayinler ayrıca aksi halde 8,9 tespit edilmemiş olacaktır yan ürünleri metabolitleri ve tedavi oluşturulan atık su dönüşümün olumsuz etkileri "algılama" izin verir. Bu yazıda ham östrojenik etkiye ve tedavi kanalizasyon kaldırılması ve alıcı su ortamlarında gelişmiş ve gelişmekte olan atıksu arıtma süreçlerinin bir dizi etkinliğini değerlendirmek için kimyasal ve ekotoksisitesi laboratuvar deneyleri bir pil kullanımını açıklamaktadır.

Protokol

Etik bildirimi: balık kimyasallar / karışımların aktivitesini bozarak endokrin değerlendirmek için protokoller Brunel University Londra'nın Hayvan Refahı tarafından tescil edildi Hayvanlar altında Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986.

1. Su Numune Toplama, Muhafaza ve Ekstraksiyon

  1. Örnek toplama ve koruma
    1. uygun bir yüzey aktif temizleme maddesi ile şişe kullanmak temizlemek için önce. Temizlikten sonra, su, drenaj ve kuru şişeleri durulayın.
    2. bakır (II) nitrat 0.5 g, 6 ml 3.6 M hidroklorik asit çözeltisi arasında oluşan bir koruyucu ihtiva eden 2-L kapasiteli cam şişe örnekleri toplamak. 10 ° C altında muhafaza örnekleri. Özü ve olası aşağıdaki toplama ve korunması en kısa sürede analiz.
  2. Örnek çıkarma ve (steroid östrojen analizi için) temizlik 10
    1. Katı Faz Ekstraksiyon (SPE)
      1. ekstraksiyon öncesinde, 1 mikron gözenek boyutu filtre kağıdı kullanılarak askıda katı madde, filtre su numuneleri azaltmak için.
        1. 2,4,16,16-d4 -17β-östradiol (E2): Bir kere d 2,4,16,16 4 -estron içeren döteryumlu iç standart stok solüsyonu spike 100 ul ekleyerek iç standart ile, başak örnekleri süzülmüş : ve 2,4,16,16-d4 -17α-etinilestradiol (EE2) (40 ug metanol / L) 1000 mi çıkışındaki (ya da 100 mi akan) kanalizasyon 2 ng / L iç başak sonuçlanan atık numuneleri ve kanalizasyon içeri giren örnekleri için 20 ng / L.
      2. SPE aparatına atılabilir valf gömlekleri, stiren divinil benzen SPE kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. ekipmanı test etmek için vakum pompası açın yeterince mühürlenir.
      3. Pipet Her hazne içine etil asetat 5 ml kartuş koşulu. Vakum pompası (10 inHg dakikada en az 10 ml'lik bir akış oranı izin vermek için, aşağıda) geçişve sıvı üzerinden çekin. SPE kartuşları kurumasına izin vermeyin. 5 ml su ve ardından, 5 ml metanol ile tekrarlayın.
      4. su ile her bir kartuş haznesi doldurun ve kartuş rezervuar ve cam numune şişeler arasındaki 1/8 "PTFE tüpleri bağlamak. dakikada en az 10 ml'lik bir akış hızında vakum açma ve bütün örnek kartuşu içinden geçmesine izin verir. atık şişesi olarak gerekli boşaltın.
      5. İyice (örneğin, koyu kahverengiden açık kahverengi) rengini değiştirmek vakum altında kartuş içeriğinin kadar (hava veya nitrojen kullanarak veya) SPE kartuşları kurutun.
      6. Ekstraksiyon manifoldu içindeki raf ve yerine temiz, kuru 10 ml'lik cam toplama şişeleri koyun. Her astar bir şişeye üstünde olduğundan emin olun. Pipet 8 vakum pompası (dakika başına yaklaşık 10 ml akış oranı) ile ilgili her bir örnek rezervuara diklorometan anahtarın ml toplanmasını şişelere sıvı çekin.
      7. SPE manifoldundan 10 ml flakon kaldır1 ml hacim azaltmak için yoğunlaştırıcı kullanın. oto-ömekleyici şişesine her bir örnek aktarın ve daha fazla azot blöf ekipmanı kullanılarak 100 ul için konsantre edilir.
    2. Jel Geçirgenlik Kromatografisi (GPC) temizleme
      1. . Tablo 1'de tarif edilen koşullar kullanılarak GPC donanımlı HPLC içine akıtılan örnek ekstresinin 95 ul enjekte GPC bir yoğunlaştırıcı ve azot aparatı aşağı darbe ve ardından hekzan ile 2.0 ml makyaj kullanarak 200 ul aşağı ayıklamak Konsantre.
    3. SPE temizlik
      1. SPE manifolduna atılabilir valf gömlekleri, aminopropil kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. Ekstraksiyon manifoldu içindeki raf ve yerine temiz, kuru 10 ml'lik cam toplama şişeleri koyun. Pipet Her hazne içine heksan 2 mi, kartuş koşulu. Sıvı kartuşları geçmesine izin verin.
      2. rezervuar içine GPC örnek özü Pipet ve tekrar sıvı izinKartuşun içinden geçmektedir. flakon örnek eluat toplayın ve manifold kaldırmak. eluat atmayın.
      3. rafın içine yeni bir temiz kuru 10 ml toplama flakon koyun ve çıkarma manifoldu içine yerleştirin. Kartuşu yıkama haznesine heksan (% 30 h / h) etil asetat 2 ml ilave edilir ve kartuşu içinden sıvı çekin. Tüm yıkama atarak, heksan etil asetat bir başka 2 ml ile tekrarlayın.
      4. geri çıkarma manifoldu içindeki rafa orijinal 10 ml toplama flakon (adım 1.2.3.2) yerleştirin. Pipet aseton, etil asetat 'ın 2 ml (% 50 h / h), rezervuar içine, vakum pompası üzerinde anahtarı ve şişenin içine sıvı haldeki çekme (2 inHg dakikada en az 2 ml' lik bir akış hızı sağlamak için, aşağıda) . etil asetat başka bir 2 ml işlemi tekrarlayın.
      5. Numune şişe çıkarın ve 1 ml özü hacmini azaltmak için bir yoğunlaştırıcı kullanın. t buharlaşmasına, ekipman aşağı darbe daha küçük bir cam şişenin içine örnek aktarmak ve azot kullanımıO yeni başlayan kuruyana kadar ayıklayın.
      6. metanol, 100 ul ilave edin ve iyice karıştırın. (0.3 mi insert ile) bir otomatik ömekleyici şişesine özü aktarın ve şişe kapağı. LCMS / MS kullanılarak numunelerin analiz (bakınız bölüm 2).
Kolon: PL jel, 50 A, 300 x 7.5 mm, 5 um
Guard Kolon: PL jel, 50 x 7,5 mm, 5 um
Mobil aşama: diklorometan
Akış hızı: ve dakika başına 1 mi
Kolon sıcaklığı: 25 ° C
UV detektörü: 210 nm
Enjeksiyon hacmi: 95 ul
Enjeksiyon modu: durmakard
Çekme hızı: dakika başına 500 mi
Hız Çıkar: dakika başına 500 mi
Pozisyon çizmek: 3mm
Fraksiyon toplanır: 3 mi fraksiyon (7-10 dk), 10 ml şişelerde

Tablo 1. ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile ekstre atık su örneklerinin temizlenmesi için parametreleri. Tablo GPC sütunu, mobil faz, sıcaklık, enjeksiyon hacmi, ve detektör dalga boyu detayları.

  1. (Maya Östrojen Ekranı için) örnek çıkarma
    1. bölüm 1.2.1.1 olarak detaylı filtre örnekleri. SPE aparatına atılabilir valf gömlekleri, C18 SPE kartuşları ve kartuş rezervuarları takın. ekipmanı test etmek için vakum pompası açın yeterince mühürlenir.
    2. Her hazne içine pipetle 5 ml metanol, C koşullandırılması için18 kartuşları. 1 dak yarım için duraklatma (dakika başına 5 ml'lik bir akış sağlamak için yaklaşık 5 inHg kadar) ve içinden sıvı çalışmasına izin vakum açın. kartuşları kuru çalışmasına izin vermeyin. HPLC notu veya çift distile su ile ya işlemi tekrarlayın (GKD 2 O). Yine kuru çalıştırmayın.
    3. bölüm 1.2.1.4 açıklandığı gibi su numuneleri ayıklayın. İyice kartuşları kuru için en az 30 dakika boyunca vakum devam edin.
    4. Ekstraksiyon manifoldunda bir rafa temiz, kuru 10 ml toplama şişeleri yerleştirin. Her astar bir şişeye üstünde olduğundan emin olun. Her bir hazneye 5 ml metanol ekleyin. Vakum (5 ml / dak maksimum debi) açın ve sıvı yoluyla 2 dakika yarım için duraklatma, bir şişenin içine kartuşun geçmesine izin verir.
    5. Önceki EVET ekranını kullanarak analiz, azot kullanılarak başlangıç ​​kuruyana kadar özü azaltmak ve 500-1,000 ul etanol ile sulandırın. buharlaşmasını önlemek için numune şişeleri kapakları Seal ve (4 ° C'de tutmak bir kıvılcım ücretsizbuzdolabı).

LCMS / MS Kullanma 2. Kimyasal Analiz

  1. Üreticinin talimatlarını kullanarak LCMS / MS sisteminin çalışma koşullarını optimize edin.
  2. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi koşulları kullanılarak kalibrasyon standart çözümler, örnek özleri, boş ve analitik kalite kontrol (AQC) numunelerin analiz ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak iyon geçişleri izlemek. İç kullanarak örnek özü steroid östrojenlerin konsantrasyonunu belirleyin standartlar 10.
LCMS
Sıvı Kromatografisi
Kolon: C18 (2) 150 x 4.6 mm, 5 um.
Enjeksiyon hacmi: 20 ul
debi: dakikada 0.5 mi.
MObile aşaması: Çözücü A:% 0.1 amonyak içeren su.
Çözücü B: asetonitril.
Gradyan programı:
Süresi (dak) 0 10 18 24 28
A: B çözücü oranı 90:10:00 50:50:00 0.479167 0.479167 90:10:00
Kütle spektrometrisi
Kaynak: Elektrosprey (negatif iyon)
Gaz ve kaynak: KKO: 20 psi, GS1: 70 psi, GS2: 30 psi
TEM: 600 ° C, CAD gazı, 5 ve IonSpray gerilimi -900
MRM geçişleri:
E1: 269/145 ve 269/143
E2: 271/145 ve 271/143
EE2: 295/145 ve 295/143
E1-D4: 273/147
E2-D4: 275/147
EE2-D4: 299/145

Tablo 2. Ayrıntılar parametreleri ve atık su özleri steroid estrojenlerin LCMS / MS analizi için koşullar. Tablo hızı, mobil faz koşulları örnek enjeksiyon hacmi verir ve akışnd degrade.

Vitro Maya Östrojen Ekranda Kullanılması 3. östrojenik aktivite (EVET) Tahlili 8

  1. Hazırlayın ve (a) ve (g) Tablo 3 gereğince asgari orta ve orta bileşenlerini saklayın.
(a) En az Orta (pH 7.1):
Fe 2 (SO4), iki kez damıtılmış su 3-50 ml (GKD 2 O), 40 mg ekleyerek Fe 2 (SO4) 3 solüsyonu hazırlayın
Ekle 1 L GKD 2 O 2 L'lik bir cam behere
behere aşağıdaki bileşenleri ekleyin:
13.61 gr KH 2 PO 4
1.98 g (NH4) 2 SO4
4.2 g KOH
0.2 gr MgSO 4
Fe 2 (SO 4) 1 ml 3 çözüm
50 mg L-lösin
50 mg L-histidin
50 mg adenin
20 mg L-arginin-HCl
20 mg L-metionin
30 mg L-tirosin
30 mg L-izolösin
30 mg L-lisin-HCl
25 mg L-fenilalanin
100 mg L-glutamik asit
150 mg L-valin
375 mg L-serin
manyetik bir pire ile ısıtılan karıştırıcı Beher koymak ve tüm çözülene kadar karıştırın
pH 7.1 olduğunu kontrol edin ve gerekirse ayarlayın
50 ml'lik steril bir şırınga metal vida En kapaklı cam şişelere 45 ml lik kısımlar halinde tevzi kullanılması
bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de minimal ortam sterilize
oda sıcaklığında saklayın
(b) D - (+) - glikoz:
GKD 2 O% 20 ağırlık / hacim solüsyonu hazırlayın
metal vida üst kapaklı cam şişe için 20 ml alikotları dağıtın
bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C de glukoz çözeltisi sterilize
oda sıcaklığında saklayın
(c) L-aspartik asit:
GKD 2 O 4 mg / ml stok çözeltisi oluşturunuz
metal vida üst kapaklı cam şişe için 20 ml alikotları dağıtın
bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de, L-Aspartik asit çözeltisi sterilize
oda sıcaklığında saklayın
(d) Vitamin Çözüm:
GKD 2 O 100 ml biyotin 2 mg eklenerek bir biyotin çözeltisi hazırlayın
8 mg tiamin, 8 mg piridoksin, 8 mg pantotenik asit, 40 mg inositol tartılır. 180 mi GKD 2 O tüm kuru bileşenleri ve biyotin çözeltisi 20 ml ekleyin
levhalı bir hava akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu atılabilir filtre içinden filtre edilerek, 10 ml steril alikotları yapmak
Mağaza 4 ° C
(e) L-treonin:
GKD 2 O 24 mg / ml L-treonin 100 ml hazırlanması
metal vida üst kapaklı cam şişe için 10 ml alikotları dağıtın
bir otoklav içinde, 10 dakika boyunca 121 ° C 'de, L-treonin solüsyonu sterilize
oda sıcaklığında saklayın
(f) bakır (II) sülfat:
GKD 2 O 20 mm bakır (II) sülfat çözeltisi 25 ml hazırlamak
Laminer akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilerek, 5 ml steril alikotları yapmak
oda sıcaklığında saklayın
(g) Klorofenol Kırmızı-β-D-galaktopiranosid (CPRG):
GKD 2 O CPRG bir 10 mg / ml çözeltisinin 25 ml hazırlamak
Laminer akış kabininde, steril cam şişelere, 0.2 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilerek, 5 ml steril alikotları yapmak
Mağaza 4 ° C

Tablo 3. Maya Estrojen Ekran deneyi; hazırlanması ve minimal ortam ve orta bileşenlerinin depolanması.

  1. Hazırlık ve stora10x konsantre maya kültürü ge
    1. 1. gün, büyüme ortamı hazırlamak (3.4.1 ayrıntılı olarak) ve steril bir erlene dökün. -20 ° C'de saklandı kriyojenik şişeden 10x konsantre edildi maya 125 ul ekle. orbital bir karıştırıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de kuluçkaya ortamı inkübe edin.
    2. 2. günde, büyüme ortamı (~ 50 mi) iki şişe olmak ve ayrı steril konik şişeler içine dökün. Büyüme ortamı, her şişeye 24 saat kültürlendi maya 1 ml ilave edilir. orbital bir karıştırıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de kuluçkaya ortamı inkübe edin.
    3. 3. günde, steril bir 50 ml santrifüj tüpüne her 24 saatlik kültür dökün. 2,000 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje 50 mi borular. Süpernatantı dökün ve% 15 gliserol ile minimal ortamda 5 ml her bir pelet yeniden askıya. 4 aylık bir süre için -20 ° C'de steril cryovials ve mağaza 1.2 ml 10x konsantre edilmiş maya kültürü 0.5 ml'lik alikotları sağlayın.
  2. PrepaStandart eğriler için rasyon ve depolama kimyasal stoklarının
    1. mutlak etanol ile iki kez tüm cam ve spatula durulayın ve kirlenmektedir herhangi izlerini kaldırmak için kullanılmadan önce kurumaya bırakın.
    2. toz ağırlığındaki kabininde bir cam şişenin içine doğrudan E2 tartılır ve mutlak etanol içinde hacimce konsantrasyonunu ayarlamak. 2x10 -7 M (54.48 ug / L) bir konsantrasyona seyreltilir. Mühür kapak ve mağaza 4 ° C'de (bir kıvılcım serbest buzdolabında).
  3. tahlil yapımcı
    1. 0. günde, büyüme ortamı hazırlar. minimal ortamda 45 ml şişe için 5 ml glükoz solüsyonu, 1.25 mi, L-aspartik asit çözeltisi, 0.5 mL vitamin çözeltisi, 0.4 mi, L-treonin çözeltisi ve 125 ul bakır (II) sülfat çözeltisi ilave edin. steril erlene büyüme ortamı dökün.
      1. şişeye (-20 ° C depolama çözüldü) 10x konsantre edilmiş stok 125 ul ilave edin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde yaklaşık olarak 24 saat süre ile 28 ° C 'de İnoküle ortamı inkübe edin.
    2. 1. gün, steril 96-iyi 'seyreltme plaka' etiketlemek ve E2 standart eğrinin ve test kimyasal (lar) / çıkış ekstraktı (lar) (örn EE2) içinde (etanol içinde 100 ul hacim) seri dilüsyonları yapmak.
    3. Etiket steril 96-de optik düz dipli mikrotitre 'tahlil plaka (ler)'. her bir levha testi kimyasal (lar) / çıkış özü (ler) sıraları ilaveten boşlukları (artı / eksi çözücü) ve bir E2 standart eğri içerir.
    4. Pipet deney plakasının uygun kuyuya her bir konsantrasyonu 10 ul (E2, kimyasal veya ekstresi). Pipet deney plakasının her "Çözücü boş" kuyuya etanol 10 ul. kuruyana kadar buharlaşmaya kapak kapalıyken bir deney plakası bırakın.
    5. Büyüme ortamı (~ 50 mi) bir şişe yapmak ve şişe başına klorofenol 0.5 mi kırmızı β-D-galaktopiranosid (CPRG) çözeltisi ilave edilir. Bir levha okuyucu içinde 620 nm'deki kültür bulanıklığı ölçülerek 24 saatlik kültür içinde maya hücrelerinin yoğunluğu belirlemek. a aşılamak24 saat kültürden 4x10 7 maya hücreleri ile ssay araç.
    6. steril çukur içine inoküle deney ortamı dökün. Çok kanallı bir pipet kullanılarak 96 oyuklu deney plakasının her bir oyuğuna inoküle deney ortamı 200 ul ekle.
    7. 96-kuyu tahlil plaka kapağı koymak ve bant ile kenarları mühür. titre plaka karıştırıcısı üzerinde 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde deney plakasının (ler) çalkalanır ve doğal olarak havalandırılan bir ısıtma kabini içinde 32 ° C de inkübe edilir.
    8. 2. günde, kuvvetli bir şekilde 2 dakika boyunca bir titre plaka karıştırıcısı üzerinde deney plaka (lar) çalkalayın. 32 ° C inkübatör dönmek.
    9. 4. günde, bir titre plaka karıştırıcısı üzerinde 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde deney plakasının (ler) çalkalayın. Bir plaka okuyucusu kullanılarak, daha sonra yaklaşık 1 saat için stand 540 nm'de (CPRG ~ 575 nm için en uygun emiş) ve (bulanıklık) 620 nm 'lik bir emişteki bir deney plakası (ler) okuma plaka (lar) bırakın. oda sıcaklığında plaka (lar) ve gerekirse daha sonra okumak bırakın.
  4. Östrojenik aktivite hesaplamaları
    1. aşağıdaki denklem kullanılarak bulanıklık için doğru tahlil okuma: Düzeltilmiş değeri = örnek veya 540 nm'de standart (E2) absorbans - [620 nm'de örnek veya standart (E2) absorbans - 620 nm'de boş absorbans]. Uygun boşlukları (kirlenme kontrol etmek için) ile arsa E2 standart eğri 8.
    2. 'Estradiol eşdeğerleri' hesaplamak için düzeltilmiş örnek (özü ya da kimyasal) kullanın. / Numuneyi katmak E2 eşdeğer değerlere absorbans değerleri ayıklamak için çizilen E2 standart eğri değerleri ve regresyon denklemini (3 parametreli polinom veya lineer fit bağlı olarak) kullanın. Kullanım konsantrasyon faktörü (yani, su ekstre edilmiş ve hacim etanol ekstresi içinde yeniden süspansiyon haline) Önceden ekstre numunede östrojenik aktivite hesaplamak için kullanılır.

Erkek Etkafa golyan Vivo vitellogeninin İndüksiyon olarak kullanılması östrojenik Faaliyet 4. Laboratuvar Dayalı Değerlendirme

  1. (Pimephales erkek fathead minnows kullanınpromelas)> sekonder seks karakterleri (görüntüler eski 4 ay, yani gerdek tüberküllerin geliştirilmesi ve erkek cinsel belirlenmesi gösteren bir sırt fatpad).
    1. yumurtlama etkinliği önlemek için, ayrı olgun testi başlamadan önce üç hafta (± 3 gün) erkekler. 3 g / l arasında bir en fazla yükleme olan en az iki 45 L cam akvaryumları ayarlayın. test için sağlıklı balıkların yeterli sayıda sağlamak için, 100 erkek en az kullanın.
    2. Test deneyimli olacak gibi aynı çevre koşullarında erkek balık tutmak (yani, 25 ± 1 ° C su sıcaklığı ve 16: 8 saat aydınlık: karanlık fotoperiyot). Örneğin, en azından her 6-8 saat, bir% 95 değiştirme zamanı sağlamak için her bir tank için seyreltme suyu akış oranının muhafaza, 45 L tankı 330 ml / dakika.
  2. Test cihazı ve deneysel tasarım
    1. wat litresi başına balık en fazla 3 g yükleme karşılamak için büyük bir cam tankları kullanıner. 8 yetişkin erkekler (nominal 4.5 g her), 10-20 L tankı kullanın.
      1. Her tedavi için iki çoğaltma tankları kullanın ve gereksiz görme bozuklukları her tankı kalkan (yani, tanklar arasındaki lamine kart ekranlarını kullanın). Bir çalışmada numarası, bir poz konsantrasyonu ve bir gemi kimlik numarası ile her tankı tanımlayın.
    2. atıksu çıkış suyu çalışmaları için
      1. varışta, hemen 10 ± 1 ° C'de depolama tankına atık aktarın. atık alınmasından itibaren iki saat içinde atık dozaj başlayın.
      2. Aklimasyonundan kabına 10 ° C depolama tankından, peristaltik pompa vasıtasıyla, atık besleyin. 18 ± 2 ° C'de aklimasyonundan kabı içinde çıkış maddesinin ısıtın. (Balık tutan) testi akvaryumları sonra dozlama / karıştırma damarlarına aklimasyonundan kaptan ısıtılmış atık pompa ve. 25 ± 1 ° C 'lik bir sıcaklığa akvaryumları ısıtın.
    3. kimyasal dozlama çalışmaları için
      1. toz ağırlığındaki kabininde test kimyasalları tartılır. Tercih edilen çözücüler kullanılmadan GKD 2 O konsantre kimyasal stokları hazırlayın.
        Not: çözücüler test bileşiklerinin çözündürülmesi için gerekli olması halinde, seyreltme suyu kontrolüne ek olarak çözücü madde kontrolleri kullanın.
      2. karıştırma kabı dozlama için akış kontrol cihazı (ler) üzerinden bir sıcaklık kontrollü başlık tankı / Yerçekimi besleme veya pompa seyreltme suyu. Pompa gemileri karıştırma / doz bir peristaltik pompa sistemi kullanılarak kimyasal stok (ler) konsantre. İstenen poz konsantrasyonu elde etmek ve su debisi (seyreltme suyu) (stok kimyasal) pompa hızını kontrol edin.
        Not: Kullanım silikon tüp karıştırma kabı / dozajlama gelen her test kabına su / Test kimyasal beslemek için. En az 24 saat% 75 kabı değiştirilmesini sağlamak için yeterli olan bir akış oranı, 20 L'lik bir tank için, yani, 20 ml / dakika kullanın. belirtilen nominal değerin ±% 10 akış hızını korumak.
    4. (25 ° C'de 5.8 mg L-1) 25 ± 1 ° C'de poz tankı su sıcaklığı, hava doygunluğu değerinin% 70 üzerinde çözünmüş oksijen ve çalışma boyunca (6.5 ila 8.5 pH değeri başlayarak) ± 0.5 pH birimi koruyun. 16 saat ışık photoperiod aydınlatma koşullarını ayarlayın: 8 saat karanlık, 20 dakika şafak / alacakaranlık geçiş dönemleri ile.
    5. Balık 2.5 (± 0.1) de taze çözüldü dondurulmuş yetişkin artemia (Artemia) ile günde iki kez yem başına tank başına g besleyin. Ayrıca tropikal pul balık yemi küçük bir miktar (iki parmak tutam) ile günde bir kez balık yemi. Her yem arasında 3 saat en az bırakın.
      1. (Kontrollere göre, iyi, orta veya kötü) beslenme tepkisi / davranışını izlemek için bir günlük beslenme kaydını tutun. herhangi meyvelerin gıda ve dışkı çıkarmak için en az iki kez (tercihen günde) bir hafta tankları sifon. En az haftada bir kez deney gemilerin kenarlarına ve dipleri temizleyin.
    6. Haftalık su örneği alınHer tanktan s (analitik kimya yoluyla) (Maya ekran üzerinden) östrojenik aktivite ve kimyasal kompozisyonunu onaylamak için. su örnekleme, özetleme ve analiz ayrıntıları için bölümlere 1-3 bakınız.
      Not: her bir deney için, doz yanıtını izlemek için seyreltme suyu kontrol (negatif kontrol), pozitif kontrol (E2 ve EE2) artı çıkış maddesi (100, 50 ve% 25), en az üç ya da test dilüsyonları kimyasal kullanımı. Yeni teknolojiler test ise, tedavi olan veya olmayan bileşik / çıkış maddesinin kullanımı (tedavisiz ör EE2, TAML / hidrojen peroksit ile EE2 (H2O 2) tedavisi 12; Şekil 1).

figure-protocol-1
TAML / peroksit su arıtma kullanarak 17α-etinilestradiol ekotoksisite kaldırılmasını belirlemek için bir in vivo fathead minnow vitellogeninin Biyoassay deneysel tasarımı temsil eden Şekil 1. Diyagramı. Ihrkurmak erimental sekiz 11 L cam akvaryumlara suyun sürekli akışı ile her beslenen oluşur. Bağımsız bir kimyasal stok çözeltileri ve su (süzüldü deklorine) karışım odası teslim edilir. Karıştırma damarlarda (reaksiyon olmadan) Nominal konsantrasyonları 2 ng / L EE2, 80 nM TAML ve 0.16 mg / LH 2 O 2 'dir. Kimyasal stok çözeltileri (EE2, H 2 O 2 ve TAML) hazırlanmış ve reaksiyonları karıştırma damarlarda başlaması, böylece ayrı ayrı dozlanmıştır. Balıklar (tank başına 8 erkek fathead balıklardır) yaklaşık 45 dakikalık bir reaksiyon süresinden sonra karışım (lar) maruz kalmaktadır. Su numuneleri haftalık maruziyet tankları alınır. Plazma örnekleri çalışmanın başında, bir temel grubundan östrojenik biyobelirtecin vitellogeninin (VTG) ölçmek için fathead minnows alınan ve maruz kalma 21 gün sonra tüm diğer balık vardır. Belirli tedaviler şunlardır: '-C'; Negatif kontrol (seyreltme suyu sadece), '+'; EE2 olumlu kontrolü,'+ H'; EE2 artı H 2 O 2 '+ T'; EE2 artı H 2 O 2 artı TAML. Bu rakam Mills ve ark., 2015 12 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Test prosedürü
    1. aklimasyonundan dönemi
      1. Her seksüel olgunluğa erişmiş erkek balık ıslak ağırlığı (g) ölçün ve her tankın (tank başına 8 erkek) rastgele ayrılamadı.
      2. Aynı partiden ayrılmamış balık tutmak ve aynı test koşullarında onları korumak. fiziksel hasar ya da 7 günlük alıştırma döneminde durumun eksikliği belirtileri göstermeye herhangi bir bireyi değiştirmek için bu balıkları kullanın. Her tedavi tankı tamamen test koşullarına acclimated olan 8 erkek vardır aklimasyonundan döneminin sonunda olun.
      3. Aynı ba ek bir 8 erkeklerden 'temel' plazma numuneleri almakerkek balık tch. bölüm 4.4 kan örnekleme yöntemi ve 4.5 de vitellogeninin (VTG) analiz yöntemini izleyin.
    2. 4.2.2 ya 4.2.3 de tarif edildiği gibi bir alışma periyodunun ardından 21 gün süreyle maruz tanklarına çıkış maddesi ya da kimyasal dozaj stokları sağlar. Monitör ölüm, davranış ve her balık fiziksel görünümü günün ilk yem günlük öncesinde tankı çoğaltırlar. Herhangi bir anormal davranış veya olayları kaydetmek.
      Not: çevresel koşulların sağlanması ve beslenme oranları balıkların sağlığını (bölümler 4.2.4 ve 4.2.5) korumak.
  2. 21 günlük maruziyet süresinden sonra balık Örnekleme
    1. örnekleme öncesinde 12 saat, balık besleme durdurmak.
    2. Kan örneklerinin toplanması için etiket mikro santrifüj tüpleri, Aprotininin ~ 5 ul (bir proteaz inhibitörü) ekleyin ve buz üzerine koyun.
    3. deklorine 1 L su başına MS222, 500 mg çözülmesiyle MS222 (anestezi) içindeki bir 500 mg / l'lik bir çözelti (daha önce iklime25 ± 1 ° C). 1 M NaOH ile pH 7.4 ± 0.4 MS222 nötralize.
    4. tamponlu MS222 halinde depodan her balık getirin. Tüm operkulum hareketi (genellikle 5 ± 1 dakika) sona erene kadar çözelti içinde tutun.
    5. Tedbir ve terminal anestezi altında çatal uzunluğu (mm) kaydedin. Kuyruk kesmek ve kaudal arter (Şekil 2) kan toplamak için heparinli hemocrit tüp kullanmak için tek kullanımlık neşter kullanın. Dikkatle önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpe kan dağıtmak ve buz üzerinde tutmak.
    6. Kan çizdikten sonra hemen balıkları öldür. dolaşım ve / veya beyin imha kalıcı durmasıyla ölüm onaylayın. Tedbir ve toplam balık ağırlığı (en yakın 0.01 g) kaydetmek ve gerektiğinde dokuların teşrih.
    7. toplama, 2 saat içinde kan (4 ° C'de 5 dakika boyunca 7,000 x g) santrifüjlenir. Yeni etiketli 0.4 ml mikrosantrifüj küvetin içine bir pipet kullanarak plazma süpernatant aktarınbuz üzerinde es ve mağaza. Plazma VTG konsantrasyonlarının analiz edilmeden önce -80 ° C 'de santrifüj ve mağaza 30 dakika içinde, kuru buz üzerinde plazma içeren tüpler dondurun.

figure-protocol-2
Şekil erkek (Pimephales promelas), plazma toplama ve testis yerini gösteren 2. Fotoğraf. Bütün balık kan örnekleri toplamak için öldürülmeleri gerektiğini 21 günlük maruziyet sonunda. Bir kez hızlı bir şekilde, ölçülen kaudal arterden kan toplama takip gerekir bu terminal anestezi balık uzunluğu (çatal boy, mm) altında Photo-A:. ​​Kırmızı noktalı çizgi (tek kullanımlık neşter kuyruğu kesmek için kullanılması gereken kuyruk amputasyon için yeri gösterir ). Fotoğraf-B kan toplamak için kullanılan bir heparinli hemocrit tüpü gösterir. onun kan örneği alındıktan sonra her balık bu durumda bütün kafa içinde, hemen öldürülmesi gerektiğinivücut (Foto-C) den kopmuş edilmiştir. Balık öldürüldü edildikten sonra vücut boşluğuna iç organları ortaya kadar açılabilir. Fotoğraf-C vs sazan balıkları, örneğin, fathead minnow, kızılkanat, sazan, yüzmek mesane (SB) göre testis (gonad) konumunu gösterir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. fathead minnows için özel olarak tasarlanmış bir homolog VTG enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) kiti ile, plazma VTG konsantrasyonları ölçülür.
    1. üreticinin protokolü tarif edilen VTG standartları ve tamponlar hazırlamak. 5,000 ve 1: plazma örneği 01:50, 1 seyreltilir 500.000 ve üreticinin talimatlarına göre VTG standart eğri aralığında okumaları elde etmek için iki nüsha halinde bunları tahlil. vitellogeninin konsantrasyonlarını hesaplamak için üreticinin yönergeleri izleyin.

Gelişmiş / Roman Atıksu Arıtma Teknolojileri 5. Tarla Değerlendirmeleri Roach Vivo vitellogeninin ve İnterseks İndüksiyonunun (Rutilus rutilus) olarak kullanılması östrojenik aktivite Azaltmak için

  1. yabani roach yakalama Atıksu Arıtma Tesisi deşarjı akışı aşağı yaşayan
    Not: gonochoristic ve östrojenik endokrin bozulmasına duyarlı olduğu bilinen vardır kullanın roach (Rutilus rutilus) ya da diğer bol tatlı su veya tuzlu balık türleri.
    1. Balık yakalamak, electrofishing kullanarak örgü, yakalama ya da durumun 13 bağlı diğer tanınmış balıkçılık yöntemleri. Örnekleme için laboratuvara geri havalandırılan tanklarda balık taşıyın.
    2. 4.4.2 detaylı olarak mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. 4.4.3 tarif edildiği gibi MS222 tamponlu hazırlayın. 4.4.4 detaylı olarak balık uyutmak.
    3. Terminal anestezi altında balık boy ve ağırlık ölçün.
    4. kaudal arter kullanarak Dispo kan toplamaksamur heparinize şırınga. hemen kan örneği alındıktan sonra her balık öldür. Dikkatle önceden etiketli mikrosantrifüj tüpler içine kan dağıtmak ve buz üzerinde tutmak. Adım 4.4.7 de açıklandığı gibi plazma hazırlayın ve ELISA (4.5) ile VTG ölçün.
    5. forseps her balığın 2-3 balık pulları kaldırmak ve tek tek etiketli küçük kağıt zarf yerleştirmek kullanma. Daha sonra balık yaş tayini ve büyüme analizi için kuru koşullarda oda sıcaklığında saklayınız zarflar.
    6. Bir neşter ile Açık vücut boşluğuna iç organları ortaya çıkarmak için. Iki tarafında yer alan bir gonad (Şekil 2) ile yüzmek mesane ortaya çıkarmak için bağırsak dışarı atın. Dikkatle cam şişenin içine ince burunlu forseps ve yer ile eşleştirilmiş gonadlar çıkarın. 01:10 doku oranında Bouin fiksatifi sahip gonadlar için kullanılabilir: sabitleştirici.
    7. doku büyüklüğüne (sabitleştirici saat başına 1 mm nüfuz) bağlı olarak 6-24 saat süreyle Bouin en doku bırakın. Sabit sonra Bouin sabitleştirici bir off dökün% 70, endüstriyel metil alkol (IMS) ile değiştirin d. dokular histopatolojik (Bölüm 5.3) için işleme kadar oda sıcaklığında sabit doku saklayın.
  2. Roach in vivo vitellogeninin ve interseks indüksiyon kullanarak östrojenik aktivite Alan dayalı değerlendirme
    1. Deney tasarımı ve kurmak
      Not: in vivo çalışma başlatılmasının öncesinde de tank ve pilot tesisi kurma. sisteme balık herhangi ilave edilmeden önce 3-4 hafta akan tankları başlayın. Su akış oranları, su kalitesi ve emin parametreleri aktif hale getirmek için düzenli olarak şartları (pH, sıcaklık, çözünmüş oksijen, vb) Monitör korunabilir.
      1. Büyük tanklar Construct (örneğin, 300-1,000 L) 'kontrol' alabilir pilot tesis sitesinde, klorlu de musluk suyu, standart tedavi atık (lar) ve paralel tedavi atık (ler) gelişmiş. tanklara hava pompası / havalandırıcılar takın. Set su akış hızları en az 6 tankı v ulaşmak içinGünde olume değişim.
        Not: tanklar iyi yalıtılmış ve aşırı günlük sıcaklık dalgalanmaları önlemek için gölgeli olduğundan emin olun. Tasarım tankları davranışsal değişiklikler (beslenme yetersizliği vb), hastalık ve ölüm belirtileri için balık gözlem, izin vermek.
    2. 1 saat için ilgili tanklarda (balık çiftliğinden) roach çanta yüzen pozlamayı başlayın. yavaş yavaş su sıcaklığına kadar çanta tank su ekleyin ve koşullar, ortam vardır. onların tankları içine balık bırakın.
    3. pelet haline balık yemek (boyut 0.5-0.8) günlük yetişkin roach besleyin. Uneaten yem temelinde ayarlanmış küçük topak haline (pelet boyutları 100-300) non-östrojenik besleme 14 ad libitum, günlük çocuk roach besleyin. Bir günlük besleme rekor belgeleyen besleme yanıtı / davranış tutmak (kontrollere kıyasla, orta veya zayıf, iyi).
    4. östrojenik aktivite ve kimyasal kompozisyonunu onaylamak için her tanktan haftalık su numuneleri alır. Sesu numune alma ve analiz yöntemleri ile ilgili ayrıntılar için e bölümleri 1-3.
  3. Balık histopatoloji 15 Gonadlar
    1. Dikkatle bir kesme tahtası üzerinde cımbız ve yer ile kaptan (adım 5.1.6 ve 5.1.7 açıklanmıştır) disseke ve sabit gonadlar çıkarın.
    2. 3 bölümden (ön, orta ve arka) içine ve her bölüm 3-5 mm kalınlığında kesiti kesim her gonad kesmek için bir mikrotom bıçak kullanın. Dikkatle etiketli plastik biyopsi kaset içine altı adet koyun ve Tablo 4'te listelenen zamanlamaları kullanılarak doku işlemci içine yerleştirin.
    3. Balmumu embed dokular ve döner mikrotom (3-5 mikron) bölüm. (45 ° C'de ayarlanır) ısıtılmış bir plaka üzerinde etiketli biyo-yapışkan kaplı cam slaytlar ve yer slaytlar transfer bölümleri 24 saat boyunca kurumaya.
    4. . Ya elle ya da Tablo 5'te ayrıntılı zamanlamaları kullanarak, otomatik Stainer kullanarak, slaytlar Leke lekeli doku üzerinde montaj maddesinin bir damla yerleştirin ve lay cam doku korumak için montaj ajan üzerinde lamel.
    5. İlk olarak, cinsiyet belirleme (10X göz hatları büyütme ile 20X, yani 2X objektif) düşük büyütme her slayt ve vücut boşluğuna 15 eklerin noktalarının sayısını inceleyin. Her balık için herhangi bir anormallik edin.
    6. Daha yüksek büyütme (100X veya 400X) at, gametogenez aşamaları, anormallikler ve testis dokusunda oosit varlığını değerlendirmek için doku incelemek. 6 (Tablo 6) 7 (% 100 yumurtalık dokusu) 0'dan değişen aşağıdaki derecelendirme sistemi (normal erkek doku) kullanarak interseks şiddetini kaydedin.
adım sayısı tedavi amaç Süresi (saat)
1 % 70 IMS kurutma 3
2 % 90 IMS kurutma 2.5
3 % 95 IMS kurutma 1.5
4 % 100 IMS kurutma 1.5
5 % 100 IMS kurutma 1.5
6 % 100 IMS kurutma 1.5
7 % 100 IMS kurutma 1.5
8 Histoloji temizleme maddesi takas 1.5
9 Histoloji temizleme maddesi takas 1.5
10 Histoloji temizleme maddesi takas 1.5
11 BALMUMU Wax infiltrasyonu 1.25
12 BALMUMU Wax infiltrasyonu 1.25
20 saat TOPLAM

Tablo 4. İşleme histopatoloji için doku emprenye balmumu rejim. Dokular otomatik doku işlemcisinde işleme tabi tutulmalıdır. Dokular belirtilen süre için ayrıntılı çözümleri dalmış olmalıdır.

Hayır Leke. Leke amaç Süresi (dak)
1 Histoloji Takas ajan balmumu erir 15
2 % 100 IMS hidrasyon 2
3 % 90 IMS hidrasyon 2
4 % 70 IMS hidrasyon 2
5 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) Durulama 2
6 hemotoksilin Lekeleri hücre çekirdekleri mavi 10
7 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) fazla kaldır 10
8 asitleştirilir IMS klorsuzlaştırma 20 sn
9 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) Durulama 20 sn
10 LICO 3 Tuz 20 sn
11 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) Durulama 20 sn
12 % 1 Eosin (sulu) Lekeleri sitoplazma pembe 20 sn
13 MUSLUK SUYU (ÇALIŞIYOR) fazla kaldır 5
14 % 70 IMS kurutma 2
15 % 90 IMS kurutma 2
16 % 100 IMS kurutma 5
17 Histoloji Takas ajan IMS, bağlama maddesini çıkarın 5

Tablo 5. Hematoksilen ve Eosin (H & E) Balık gonadal dokuların boyanması için çözümler ve daldırma süreleri. Slaytlar Alloc her banyosunda yerleştirilmelidirsırayla zaman caktır. Dokuların H & E boyama balık gonadlar üzerinde östrojenik atıksu atık gelişimsel ya da örgütsel etkilerini belirlemek için gereklidir.

Gol bölüm Açıklama
0 Normal erkek testis
1 Multifokal testis dokusunda arasında dağılmış 1-5 oosit (genellikle tek başına) ile ovotestis
2 Multifokal ovotestis, genellikle küçük kümeler halinde 6-20 oosit testis dokusunda arasında dağılmış
3 Multifokal ovotestis, kümeler halinde 21-50 oosit
4 > 50 ve <100 oosit. Bölüm genellikle multifokal ve test bir mozaik görünümündediricular ve yumurtalık dokusu.
5 > 100 oosit, genellikle multifokal ama aynı zamanda testis dokusundan ayrılır yumurtalık ve testis dokusunun açıkça tanımlanabilir bölgeleri ile fokal olabilir.
6 bölümündeki gonadal doku yüzde> 50 yumurtalık ve açıkça epitel hücreleri ve fagositik dokuların testis dokudan ayrılır.
7 bölümünde gonadal doku 100 yüzde yumurtalık olduğunu.

Tablo 6. skorlama sistemi roach interseks durumunun ciddiyetini değerlendirmek için. Histolojik gonad dokusu hazırlanan slaytlar ışık mikroskobu altında incelenmesi gerektiğini, 20X de, 100X ve 400X büyütme, herhangi bir anormallik ve testis dokusunda oosit varlığını değerlendirmek için. Bu tablo Jobling ve diğ. 2006 6.

Sonuçlar

Girişimleri atıksu arıtma süreçleri iyileştirme etkisini anlamak için ya da boşalmış atık endokrin bozan aktivitesinin kaldırılması etkinliği açısından AAT mevcut en yüksek tedavi olarak ekipman güçlendirme için en uygun teknolojiyi belirlemek için, anahtar kimyasal ölçümünü sadece gerektirir işleri girmek değil, aynı zamanda endokrin bozan aktiviteye sahip olabilir yıkım ürünlerinin analizini gerektirir bileşenleri. Evsel atık atık, bu en estrojenik maddeler, steroid hormonlar, estron (E1) 17β-estradiol (E2) ve 17α-etinilestradiol (EE2) 5,8 bulunmaktadır. Steroid estrojenler esas aktif olmayan konjugatlarının 16,17 bir karışımı olarak vücuttan atılır. Bu konjuge östrojenler ölçüde bakteriyel aktivite ile kanalizasyon sistemine ayrıştırdığından ve daha fazla bozulma AAT oluşur. ayrıştırdığından steroidler aradsorpsiyon yoluyla atık su akışından çıkarıldı e çamur ya da oluşumu ile sonuçlanan ikincil tedavi sırasında biyolojik olarak parçalanır, öncelikle dönüşüm yan ürünleri ve sonuçta tam mineralizasyon ilk aktif bileşen oluşabilir için. çıkış akımındaki tüm tek tek bileşiklerin kimyasal analiz zaman alıcı ve pahalı bir zor olacak ve bir numune içinde mevcut bilinmeyen aktif bileşenleri kapsamaz olacaktır. Ayrıca, her bir bileşenin estrojenik bir miktar, sadece analiz bileşiklerin bir numunesinin kümülatif estrojenik potansiyelleri estradiole göre bir göstergesini sağlayacaktır. Bu dönüşüm süreçleri bilinmeyen östrojenik maddeler ya da nerede içeri giren endüstriyel kaynaklı olduğunu oluşturmak bir risktir. In vivo ve in vitro ekotoksikolojisi biyo-deneylerde kimyasal analizi birleştiren gibi muamele edilmiş kanalizasyon gibi karışımlar bilinmeyen estrojenik bileşenlerin varlığı için bir çözüm sağlar. Maya östrojen Scr gibi in vitro deneylerleeen (VAR) kanalizasyon atık östrojenik aktivitesini belirlemek için ve işlenmiş numuneler 8,18,19 aktif bileşenleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, in vivo ve in vitro ile test karşılaştırmalar 11 önemli olabilir ve endokrin bölücü potens tedavisi ile ilgili olarak, yeni işlemler kapsamlı bir değerlendirme, kimyasal ve ekotoksikolojisi testlerin bir pil gerektirir.

Bireysel arıtma tesisleri veya işlemler atık akımından aktif bileşikleri çıkarmak olmadığının belirlenmesi Örnek ekstraksiyonu, konsantrasyon ve özü, analizden önce temizlenmesi takip kimyasal analiz kullanılarak elde edilebilir, genellikle LCMS (/ MS) veya GCMS kullanılarak yapılan (/ MS) yöntemleri. Bireysel etkisiz konsantrasyonlar (PNEC) 20 veya çevresel kalite standardı tahmin kimyasal analizinden elde edilen veriler uygunluğunu belirlemek için kullanılabilirs (EQS) özel bireysel bileşiklerin 21 ve bu nedenle bu tür yöntemler yasal uyumluluk verileri için hayati önem taşımaktadır. Bundan başka, hedef ya da hedef olmayan kimyasal analiz yöntemleri toplam yanıt sağlamak, biyolojik yöntemler ile karşılaştırıldığında, tek tek bileşiklerin ya da izomerlerin tanımlanması ve kantitatif sağlar. Kimyasal analiz yöntemleri, bu nedenle ayrı bileşiklerin değerlendirilmesi karşılamak ve bireysel arıtma tesisi bazında bu atıksu arıtma sorunlarını çözmek için yapılabilir izin verir. Çalışmalar sentetik hormon çıkarılması EE2 daha az etkili olma eğilimindedir, ancak geleneksel bir atık su muamele (örneğin, aktif çamur bitkiler), doğal steroid hormon çıkarılması son derece etkili olduğunu göstermiştir. bunlar pred aşağıda EE2 kaldırmak için bir uç boru-çözeltisi olarak kullanılabileceğini ozon gibi teknikler kullanılarak, gelişmiş tedavi ile alan çalışmaları, granül aktif karbon (GAC) ve membranlar, yüksek maliyetli olsa göstermiştiretki seviyeleri icted ve algılama sınırları aşağıda. Şekil 3 pilot ölçekli belediye atık su arıtma tesisinde GAC kullanarak EE2 kaldırılmasını gösterir. Boru GAC tedavisinin ucunu kullanarak belediye atık su arıtma tesislerinde pilot ölçekte yapılan çalışmalar da östrojenik etki gücü azalma GAC aşağıdaki Şekil 4'te görüldüğü gibi Maya Östrojen Ekranı (EVET) kullanılarak ölçülür gösteriyor.

figure-results-1
Şekil 3. gelişmiş üçüncül tedavi sonrası etinilestradiol kaldırılmasını gösteren örnek alan verisi. (A) Numuneler numune korunması için açıklanan prosedürler izlenerek, geleneksel (aktif çamur tesisi) tedavi sonrasında AAT tahsil edilir. (B) Numuneler normal faz SPE kullanarak müdahale maddeleri kaldırmak için katı faz ekstraksiyon, temizlenmiş-up kullanılarak ayıklanır veJel geçirgenlik kromatografisi. (C), temiz, konsantre edilmiş ekstrakt düşük bir hacme konsantre edildi ve MRM modunda negatif iyon elektrosprey LCMS / MS ile analiz edilir. Sonuçlar izotopik iç standartlarını kullanarak iç standardizasyon kullanılarak hesaplanır. Gösterilen örnekte, EE2 0.1 ng / L öngörülen etkisiz seviyeye (PNEC) üstünde bir konsantrasyonda nihai ASP çıkış maddesi içinde mevcut olan ve GAC ve ozon kullanılarak çıkarılır (O 3) çevresel olarak güvenli bir konsantrasyona seyreltildi. Burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

figure-results-2
Bir Maya Östrojen Ekranı (EVET) tahlil plaka (A), sarıdan kırmızıya renk değişikliği gösteren örneklerin östrojenik aktiviteye ilişkin Şekil 4. Fotoğraf. EVET tahlil plaka gösteren oluşturulan araziler absorbans düzeltilmiş (540Estradiol standart (B) nm), aktif çamur çıkış (ASP) ve granül aktif karbon (GAC) ile muamele atık çıkış maddesi örnekleri (C). Her numune iki kez test edilmiştir. ASP ve GAC atıkları ayıklanır ve bölüm 1'de belirtilen SPE yöntemleri kullanılarak konsantre edilmiştir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ozonlama Ayrıca, geleneksel olarak işlenmiş atık su işleme tesisleri, steroid östrojen ve östrojenik aktivite giderilmesinde etkilidir. Ozon atık su numuneleri bir organik kirletici maddelerin geniş ve çözünmüş organik madde oksitleyebileceğini ve dezenfeksiyon özellikleri sağlar. ozonlama etkinliği pH, organik madde miktarına ve ozon uygulanan doz su özelliklerine bağlıdır. Kötü geleneksel muamele ile çıkarılır östrojenler olabilir0.8 ve 2 mg O 3 / mg DOC arasındaki dozlarda atık çıkarıldı. Ozon EDC bir dizi dökümü için uygulanabilir ozon yapan elektron yönünden zengin bir bölgede (doymamış karbon-karbon bağları, aromatik alkoller dahil olmak üzere aromatik bileşikler), ile reaksiyona giren bir seçici oksitleyici maddedir. Bununla birlikte, tek tek bileşiklerin ortadan kaldırılması gerekli orijinal bileşiğe tam mineralizasyon yol açmaz. Organik maddeler, aşağıdaki ozonlama yan ürünler, düşük molekül ağırlıklı bir dizi içerir üreten ara maddeleri ya da dönüşüm oksidasyon transforme edilebilir, aldehidler, ketonlar, karboksilik asitler, keto asitler ve bromlu bileşikler gibi bileşiklerin, polar sınıfları. Örnekler, bromat, formaldehit, asetaldehit ve karboksilik asitler yer alır. In vivo kullanma ve in vitro biyo-deneylerde ozon kısmen bazı kimyasal maddeler okside olmasına rağmen, elde edilen önemli bir transformasyon ürünleri daha düşük bir estrog sahip olduğu gösterilmiştirENIC gücü ve dolayısıyla östrojenik aktivitenin yüksek çıkarılmasına uygun bir doz sonuçlara ozon uygulanması.

atıksuların ek tedavi önemli faydalarından biri alıcı su ortamlarında erkek balıkların feminizasyonu azalma olduğu; azaltılmış doğurganlık 3 yol açabilir olumsuz etkisi. balık kullanılarak in vivo çalışmalar (örneğin, hamamböceği ya da fathead minnow) (Şekil 5'de görüldüğü gibi, örneğin) erkek balıkların testiste atıksu gösterisi dişi germ hücreleri veya oosit maruz. Interseks veya erkek VTG yoktur ya da önemli ölçüde bu tür GAC 7 veya ozon 22 gibi gelişmiş tedavi sonrası balık azaltılır. Bu çalışmalar, ancak bu üretilen çıkış maddesinin toksikliğini hitap etmez, ozonasyon sırasında üretilen dönüşüm ürünleri estrojenik olmadıklarını göstermektedir. Bu sorun, örneğin, diğer çalışmalarda Magdeburg ve arkadaşlarının çalışması ele alınmıştır. 23 kadar.

figure-results-3
Normal bir erkek (A) ve interseks Şekil 5. Fotomikrografları (B, C) ​​alan bazlı değerlendirme. Photomicrograph-A atıksuların maruz kalan yetişkin roach (Rutilus Rutilus) dan gonadlar, normal erkek testis histolojik bölüm göstermektedir. Fotomikrografıdır-B ve C, altı ay boyunca aktif çamur prosesi atiksuyun maruz kalmış bir interseks erkek balık histolojik bölümleri, göstermektedir. Oklar testis dokusunda bulunan oosit göstermektedir. Ölçek çubuğu her fotomikrografiyle 100 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ozon, GAC veya membran teknolojisini kullanarak boru tedavi sonunda yüksek maliyetli bir alternatif daha düşük maliyetle geliştirilmesini gerektirmektedir, kimyasal (EDC) çıkarılmasını bozmakta endokrin için sürdürülebilir yöntemler. Ayrıca, soğurma ve ayırma yöntemleri, sadece yıkımı yoluyla ortadan kaldırarak yerine başka bir fazdan EDC ayırın. 26 - TAML aktivatörleri atık 12,24 içinde organik mikro hidrojen peroksit oksidasyonu katalize etmek için geliştirilmiştir. TAML etkili bir saf laboratuvar suda yanı sıra belediye atıksu arıtma tesislerinden gelen atık ve çivili idrar örneklerinin 12 EE2 ve diğer steroid östrojen aşağılamak O 2 H 2 ile aktivatörlerinin. Laboratuar çalışmaları, TAML / H 2 O 2 tedavisi EVET biyoassay ve substantia kullanılarak in vitro ölçülen östrojenik aktiviteye EE2 çıkarılması dahil olmak üzere yüksek steroid östrojen temizlenmesini sağlar ve önemli ölçüde düşürdüğünü göstermektedirlly VTG biyoassay (Şekil 1 ve Şekil 6) kullanılarak ölçüldü vivo balık feminizasyon azalır.

figure-results-4
Şekil 6. Ortalama EE2 konsantrasyon ve estrojenik etkinlik tedavi edilen ve edilmeyen tankı sular (A) ve başlangıç ​​plazma vitelogenin ve açıkta kalan bir erkek balık (B). A) EE2 konsantrasyonu (ng / L, koyu mavi bar) LCMS / MS ile ölçülmüştür , östrojenik aktivite (EE2 eşdeğer ng ​​/ L, koyu yeşil çubuklar) (EVET) in vitro Maya Östrojen Ekran ile ölçüldü. B) Plazma vitellogeninin (erkek fathead minnows içinde / ml, açık mavi bar) konsantrasyonu ng kantitatif enzim aracılığıyla ölçüldü immünosorbent deneyi (ELISA) -bağlı. Olarak rapor EE2 kimyasal analiz sonuçları <0.03 ng / L EE2 (yani, saptama sınırı (LOD) daha düşük), yani (yarım LOD sahip olarak tedavi edildi ortalamalar, standart hata ve istatistiksel analiz hesaplamalarında kullanılmak üzere 0.015 ng / L EE2). EE2 ve östrojenik aktivite 21 gün aşırı maruz kalmak örneklenmiş ortalama ölçülen konsantrasyonlar vardır. Plazma VTG maruz kalmadan önce (taban) ve 21 gün maruziyetten sonra ölçülmüştür. Tedavi rejimi oluşuyordu; Negatif kontrol (seyreltme suyu sadece), EE2 + H 2 O 2 + TAML, EE2 + H 2 O 2 ve EE2 sadece. Grafik-A Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil etmekte, grafik,-B'de Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Grafik-B barlarda yukarıdaki harfler istatistiksel benzerlik gösterir. Bu rakam Mills ve ark modifiye edilmiştir. 12 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Atıksu arıtma tesisleri EDC ile yüzey suyu kirlenme önemli yol vardır. Geleneksel olarak ilerlemiş veya gelişmekte olan tedavi süreçlerinin endokrin aktivitesinin giderilmesi etkinliğinin değerlendirilmesi, kimyasal ve biyolojik tahlillerin çeşitli kullanılmasını gerektirir. hedeflenmemiş ve hedeflenen analizi kullanılarak kimyasal analiz tek tek bileşenlerin çıkarılması etkinliği üzerinde nitel ve nicel veriler sağlar ve bu nedenle bir değerlendirme çevresel kalite standartlarına karşı yapılan veya analiz bileşiklerin veya bileşimlerin karışımları etkisiz konsantrasyonlar tahmin sağlar.

arıtılması ve bilinmeyen biyolojik olarak aktif bileşenlerin varlığında aşağıdaki maddelerden eksik mineralizasyon kaynaklanan dönüşüm ürünlerinin üretimi, tek başına kimyasal test kullanımlarını sınırlandırmaktadır. Analitik kimyager ile kombinasyon halinde in vitro biyo-deneyler, in vivo ve in bir kombinasyonury tarama atıksu arıtma süreçleri ortaya çıkan yoluyla EDC çıkarılması etkinliğini belirlemek için kullanışlı bir araç sağlar. geleneksel su kalite parametreleri ve diğer toksikolojik ve mikrobiyolojik uç noktaları ile birlikte yürütülen bu testler, mevcut ve gelişmekte olan atıksu arıtma teknolojilerinin kritik bir değerlendirmesini sağlar.

Olmadığı Maya tabanlı östrojen ekranları (örneğin, YES) not kimyasallar ve atıksuların östrojenik gücünü belirlemek için deneyler in vitro önemlidir. Kararlı biçimde transfekte edilmiş memeli hücre bazlı deneyler arasında bir sayı, örneğin, ER-CALUX 27 ve insan göğüs kanseri hücreleri ya da servikal tümör hücreleri ile 28 hERα-HeLa-9903 sırasıyla, çok geliştirilmiştir. EVET benzer memeli hücre bazlı analizlerle kıyasla olmuştur ve tekrarlanabilirlik karşılaştırılabilir yüksek düzeyde olduğu tespit edilmiştir, gerçek pozitif ve gerçek negatif östrojenik kimlik oranları 29, bussesöf bazen 27 biraz daha az hassas olduğu kabul edilir. Maya tabanlı muhabiri deneyleri yararlarından biri daha az sıkı biyo-kontrol önlemleri ve steril teknikler gerektirir gibi memeli hücre kültürü ile önemli bir deneyime olmayan laboratuvarlarda EVET daha kolay (EVET gerekirse tezgah üstünde yapılabilir), kabul edilebilir olmasıdır . İnsan hücre bazlı deneyler de EVET kullanılan standart kuvöz ve mikro okuyuculara kıyasla CO 2 inkübatör ve luminometreyle gerektirir. İki maya bazlı östrojen raportör testleri (EVET, Saccharomyces cerevisiae ve A-EVET, Arxula adeninivorans) ISO 19040 onaylanması için şu anda geçiren laboratuvarlar arası yollar "Su kalitesi - su ve atık su östrojenik potansiyelinin belirlenmesi" endüstrileri vurgulayarak bu tekniklerin ilgi.

etkiyi açıklanan yöntemlerle sınırlamaları vardıralan ya da laboratuvar ortamında veya insan kirlenme (örneğin, plastikleştiriciler, yüzey aktif maddeler, kişisel bakım ürünleri) ile kaynaklanan östrojenik maddeler ile numune, numune saklama ve analiz esnasında numune. EVET deneyi (ya da diğer hücre bazlı raportör tahlilleri) kontaminasyon Bu tip arka plan yükseltmek ve tahlil kullanımını etkileyecektir. plastik şişelerde saklanan su örnekleri veya çözücüler kolayca yanlış pozitif neden olabilir. LCMS / MS ve EVET tahlil hem saptanabilir düzeye östrojen konsantre SPE gerektiren yanlış negatifler endişe de bulunmaktadır. matrisi, SPE sorbent ve yıkama çözücü seçimi ekstraksiyon etkinliğini ve akıtılan bileşiklerin türlerini etkileyebilir. Çok kutuplu ve bazik bileşikler kötü sorbent tarafından muhafaza edileceği gibi, negatif bir eğilim oluşturabilir, bu protokolde belirtilen koşullar kullanılarak çıkarılması için C18 SPE kartuşları kullanarak. Ayrıca, bu protokol metan elüte EVET eluent sulandırılması gereklidirol uçucu bileşiklerin kaybı ile sonuçlanan fon sağlayıcısı azot kuruyana kadar buharlaştırma yolu ile etanol. Bunun bir sonucu olarak protokol test edilen örneklerin östrojenik aktivite hafife sağlamak olabilir. Onlar çıkarılan henüz ya da buharlaşma nedeniyle kaybolur, çünkü bilinmeyen veya beklenmeyen bileşikler olarak EVET deneyi, cevapsız olabilir göz önüne alındığında Bu sınırlamalar özellikle önemlidir. Ayrıca, LCMS / MS tekniği kurtarma düzeltmek için etiketli dahili standartların kullanımı yapar; Bu yaklaşım VAR testi ile kullanılamaz.

Atık in vivo test önemli sınırlamalar, in vitro yöntemlerle karşılaştırıldığında değerlendirme için gerekli olan yüksek maliyet ve zaman bulunmaktadır. Şu anda östrojenik aktivite tespit etmek için balık embriyo testlerinin kullanımı sınırlıdır. Ancak, gelecekteki uygulamalara sahip olabilir balık embriyoları 30, parlayan östrojen duyarlı transgenik üreten bazı başarı olmuştur. Bu protoc kullanılan Etkafa balıklardır (ol), ortak bir laboratuar türleri ve erkek balık VTG indüksiyon östrojenik maruz iyi belgelenmiş bir biyo-marker atık çıkış maddesi östrojenizitede 22 ya da diğer östrojenik bileşikler veya bunların karışımları 31 bir ölçülebilir ölçer bulunmaktadır. Endokrin bozucu kimyasallara OECD testi kurallar VTG her üç türün östrojen maruz kalma hassas bir biyolojik belirteç olmak, yetişkin fathead Minnow, Japon Medaka ve zebrafish 32,33 ile onaylanmıştır. Ciddi interseks roach 3'te görüldüğü gibi Ancak, VTG indüksiyon doğrudan üreme bozukluğu ve atıksu maruz kalma nedenle ekolojik sonuçlara ilişkili değildir. Öte yandan, hamamböceği nedeniyle büyük boyutlu, uzun nesil süre (2-3 yıl cinsel olgunluğa ulaşması), üreme tarzı için Ekotoksikoloji araştırma için bir klasik 'laboratuvar türleri' değildir; grup yumurtlama (üreme) yılda bir kez gerçekleşir ve zorluk sırasında başka kadın dan erkeklere (tanımlamak içinyumurtlama mevsimi). Ancak, bu normal gonochoristic türün çok iyi nedeniyle östrojenik atıksu atık aşağı, erkek balıklar endokrinoloji (örneğin, kadın-spesifik kanlarında vitellogeninin varlığı) ve histopatolojik (ovotestes tedirginlikler sergilenen keşif, İngiltere'de çalışılmıştır - testis ve / veya kadın üreme kanallarında) 5,6 yumurta geliştirilmesi. Bu nedenle, bu protokollerin bir gelecek uygulaması olarak, hamamböceği (veya benzeri türler) atıksu kalitesi (ve düşük östrojenizitede) gerçek iyileştirmeler ileri işlenmiş atık suların alıcı nehirler görülür olmadığını göstermek için yararlı bir vahşi nöbetçi tür olabilir. Onlar da pilot bitkilerden 7'den teknolojik gelişmiş atık suları izlemek için boru sistemleri sonunda kullanılabilir. In vivo atıksu değerlendirmelerde kullanmak için hangi tür göz önüne alındığında nispeten hızlı ve kontrollü test kullanarak laboratuvar türler arasında bir değiş tokuş karşılaştırıldığında varuzun alan bazlı, ama yerli türler kullanılarak test daha çevreyle ilgili. Bununla birlikte, in vivo değerlendirmelerde yüksek maliyetli ve sadece kimyasal analizi kullanılarak değerlendirmeler, aşağıdaki testler nihai grubu olarak ve in vitro deneylerde dikkate alınmalıdır.

Açıklanan protokoller dahilinde kritik adımlar hazırlanması ve örnekleri ve cam işleme dahil plastik ve örneklerin temas sınırlayıcı dahil olmak üzere çevresel kirleticilerden örneklerin kirlenmesini önlemek için (yani, şişeler ve örnekleme ekipmanları uygun yüzeye aktif temizlik maddesi ile ön tedavi edilmelidir) yanlış pozitif üretebilir diğer malzemeler. tasarımı ve aquaria ve balık pozlama sistemleri bina bu da aynı derecede önemlidir. İdeal akvaryumlar (konut stokları ve pozlama sırasında) en az kontaminasyon riski düşük adsorpsiyon 32 malzemelerden inşa edilmelidir. Paslanmaz çelik çıkış maddesi ya da bir su tutma tankı kullanılabilir.Bir cam yapım tanklar balık tankları için tercih edilir ise (bu da balığın kolay gözlem sağlar gibi). Düşük dereceli plastik boru ya da boru kullanımı, yani, kullanımdan önce en az 12 saat için seyreltme suyu altında herhangi bir kirletici süzülmeye bırakılır, 'doğru görmüş' ise 32 PVC 34 ve ABS kullanılabilir kaçınılmalıdır. Tıbbi grade silikon boru tanklarına kimyasal ve atık su / seyreltme suyunun peristaltik pompa teslimat için tesisimizde başarıyla istihdam edilmiştir. Yanı sıra inşaat östrojenik kirlenmeyi dikkate ve su sporları sisteminin çalışan olarak, balıkların beslenme düşünmek de önemlidir; Birçok uygunluk balık yemleri balık östrojenik olduğu tespit edilmiştir. Nedenle önceki çalışmaların bu tür bunları kullanarak (Beresford ve ark. 14 Bkz, Maya Östrojen Ekranında, örneğin) faaliyet için herhangi bir yiyecek test edilmesi önemlidir.

Sorun gidermekalite güvence örnekleri çoklu seyahat, laboratuvar dahil ve çözücü boşlukları yanlış pozitif ve yanlış negatif sonuçlara ortadan kaldırmak için pozitif kontroller ve gerçek örneklerin yanında analiz edilirse, basitleştirilmiş açıklanan kimyasal analiz veya EVET tahlil protokolleri. Pozitif (örneğin, EE2) ve negatif (seyreltme suyu sadece) kontrolü her zaman tespit edilecek herhangi bir beklenmedik kirlenme beklenen biyolojik belirteç veya son nokta (yani, VTG veya histopatoloji) hassasiyetini teyit ve izin in vivo deneylerde de kullanılması gerektiğini ( örneğin, deneysel seti yukarı, diyet ya da seyreltme suları) dan. protokolünde herhangi bir değişiklik herhangi bir çalışma yürütmektedir önce valide edilmelidir.

AAT atıkları yoluyla çevreye giren östrojenik bileşiklerin sıkı düzenleme ile daha etkin atıksu arıtma teknolojileri geliştirilmesi gerektiğini canlandırmak olduğunu. Bu yazıda anlatılan testlerin pil iltifatekotoksikolojik ve kimyasal değerlendirme testleri normal atık su arıtma tesisi, atık su boşaltma başvurdu. Bu nedenle, atıksu teknolojisi geliştiriciler ve tesis operatörlerine imkan vermelidir testin bütünsel pilin bu tip gelecekteki uygulamaya özel düzenlenmiş östrojenik kimyasallar ve genel biyolojik aktiviteyi hem kaldırmak için en iyi yöntemler dikkate alınarak en ekolojik açıdan güvenli tasarımlar uygulamak.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu makalede sunulan projeler Severn Trent Water ve Brunel University London tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, saha ve laboratuvar yardımı sağladıkları için Alan Henshaw ve John Churchley'e teşekkür eder. T.J.C., Heinz Endowments'a desteği için teşekkür eder. M.R.M., Steinbrenner Doktora Bursu için Steinbrenner Enstitüsü'ne ve Başkanlık Bursu için Carnegie Mellon Üniversitesi'ne teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Wellwash Versa plaka yıkayıcıThermo Scientific5165010
Plaka okuyucuMoleküler CihazlarSpectraMax 340PC
İnkübatörMemmertINB 40037 & # 176; Sazan tahlili için C inkübasyonu gereklidir
Fisherbrand jakuzi FisherScientific13214789
Buz yapıcıScotsmanAF80
12 Kanallı F1 dijital çok kanallı pipetThermo Scientific Finnpipette4661070
ELISA kitleriBiosense LaboratuvarlarıV01018401-096 (Fathead minnow)
V01003402-096 (Sazan)
Mikrofuj tüpleri, 0.5 mlAlfa laboratuvarlarıLW2372
Mikrofüj tüpleri, 1.5 mlAlfa laboratuvarlarıLW2375
Sülfürik asit, %95-98Sigma-Aldrich258105
Histoloji
Doku işlemcisiLeica BiosystemsTP1020
Balmumu dağıtıcıThermo Scientific Raymond LambE66HC
Metal gömme kalıbıLeica BiosystemsÇeşitli
Sıcak plakaThermo Scientific Shandon3120063
Soğuk plaka (EG1150 C)Leica Biosystems14038838037
Isıtmalı forseps (EG F)Leica Biosystems14038835824
MicrotomeLeica BiosystemsRM2235
Parafin bölümü yüzdürme ve banyoElektrotermalMH8517
Slayt kurutma tezgahıElektrotermalMH6616
Stainmate otomatik boyayıcıThermo Scientific ShandonE103/S10L
Kasetler, Histosette II, biyopsiSimportM493
Parafin mumuThermo Scientific Raymond KuzuW1
Histo-Clear IIUlusal TeşhisHS-202
IMS (etanol karışımı), IDA99TennantsID440
Polisin yapışma kızaklarıThermo Scientific Gerhard MenzelJ2800AMNZ
Kapak kaymaları, 22x50 mmVWR631-0137
HistomountUlusal TeşhisHS-103
Hematoksilen Harris GURRVWR351945S
Eozin, %1, suluPiramit İnovasyonuS20007-E
Fisherbrand sürgülü kutular FisherScientific11701486
Mikrotom bıçakları, MB35Thermo Scientific Shandon3050835
Bouin' s çözümüSigma AldrichHT10132-1L
Maya ekranı
Akış kabiniLabcaire Systems LtdSC12R
Soğutmalı inkübatörLMS Soğutmalı İnkübatör303
İnkübatörMemmertINB 400
ÇalkalayıcıHibePSU-10i
Fisherbrand jakuziFisher Scientific13214789
Plaka çalkalayıcıHeidolph Titramax 100544-11200-00
12 Kanallı F1 dijital çok kanallı pipetThermo Scientific Finnpipette4661070
12 kanallı pipet, elektronikSartorius735441
96 kuyulu düz tabanlı mikroplakalarMP Biyomedikal
Thermo Scientific Nunc
Sarstedt		76-232-05
260860
82.1581.001		Bu çok kuyulu plakaların hepsinin düşük arka planlar ürettiğini bulduk
HPLC sınıfı suRathburnRH1020
Mutlak etanolHayman KimiaF200238
Potasyum fosfat monobazik susuzSigma-AldrichP-5655
Amonyum sülfatSigma-AldrichA-2939
Potasyum hidroksit, peletlerSigma-AldrichP-1767
Magnezyum sülfat, susuzSigma-AldrichM-2643
Demir (III) sülfatSigma-Aldrich307718
L-LösinSigma-AldrichL-8912
L-histidinSigma-AldrichH-6034
AdeninSigma-AldrichA-2786
L-Argenin,hidroklorür Sigma-AldrichA-6969
L-MetioninSigma-AldrichM-5308
L-TirozinSigma-AldrichT-8566
L-İzolösinSigma-AldrichI-7403
L-Lizin, hidroklorürSigma-AldrichL-8662
L-FenilalaninSigma-AldrichP-5482
L-Glutamik asitSigma-AldrichG-8415
L-ValinSigma-AldrichV-0513
L-serinSigma-AldrichS-4311
Tiamin, hidroklorürSigma-AldrichT-1270
PiridoksinSigma-AldrichP-5669
D-Pantotenik asit, hemikalsiyum tuzuSigma-AldrichP-5155
İnositolSigma-AldrichI-5125
D-BiotinSigma-AldrichB-4639
D-(+)-Glukoz susuz; karışık anomerlerSigma-AldrichG-7021
L-Aspartik asitSigma-AldrichA-4534
L-TreoninSigma-AldrichT-8441
Bakır(II) sülfat, susuzSigma-AldrichC-1297
Klorofenolred-β-D galaktopiranosid (CPRG)Sigma-Aldrich10884308001
GliserolSigma-AldrichG-2025
17 ve beta;-EstradiolSigma-AldrichE-8875
< güçlü > Steroidler< / güçlü >
AsetonRathburn
AsetonitrilRathburn
Amonyak çözeltisiRathburn
EtilasetatRathburn
Bakır (II) nitratSigma-Aldrich
AsetonRathburn
DiklorometanRathburn
2,4,16,16-d4-17β-estradiolCDN İzotopları
2,4,16,16-d4-estronCDN İzotopları
2,4,16,16-d4-17α-etinil östradiolCDN İzotoplar
17β-estradiolSigma-Aldrich
EstroneSigma-Aldrich
17α-etinil östradiolSigma-Aldrich
HekzanRathburn
Hidroklorik asitSigma-Aldrich
MetanolSigma-Aldrich
Sodyum hidrojen karbonatSigma-Aldrich
Sodyum hidroksitSigma-Aldrich
Stiren divinil benzen kartuşu (Çözünen ENV+) katı faz ekstraksiyon kartuşu (200 mg/6 ml)Biyotaj
Çözünen aminopropil katı faz ekstraksiyon kartuşu (500 mg/6 ml)Biyotage
Balık çalışması
Turuncu-Beyaz Silikon Manifold Boru 0.63 Delik Pk 6Watson Marlow982.0063.000
0.5 / 0.8 delik pk 20 için düz konektörlerWatson Marlow999.2008.000
pomsil silikon boru 0.8 delik 15 mWatson Marlow913.A008.016
200 serisi çok kanallı persitaltic pompaWatson Marlow205CA
Silikon boru x 15 m (dozaj tankları)VWRSFM1-3250
silikon boru x 15 m (giriş/çıkış için büyük)VWRSFM1-5450
2,5 L cam winchester pk 4Fisher ScienctificBTF-505-050B
manyetik karıştırma çubuğu 51 x 8 mm pk 10Fisher ScienctificFB55595 
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (MS222)Sigma AldrichE10521-10G
17&alfa;-EtinylestrodiolSigma AldrichE4876-100MG
Mutlak etanolHayman KimiaF200238
SPE
1/8 inç PTFE tüpler 'pipetler' renk kodlu pk 4Sigma Aldrich57276
manifold için tek kullanımlık gömleklerSigma Aldrich57059
fritsiz filtrasyon tüpleri 6 ml pk 30Sigma Aldrich57242
rezervuar adaptörleri pk 12Sigma Aldrich57020-U
manifold pk 4 için paslanmaz çelik ağırlıkSigma Aldrich57278
manifold pk 12için erkek Luer fişiSigma Aldrich504351
SPE Vakum ManifolduSigma Aldrich57265
ekstraksiyon ana kadı için durdurma muslukları (supelco) pk 12WatersWAT054806
Sep-Pak Plus C18 kartuş kutusu 50 SularWAT020515
Metanol HPLC sınıfı 2,5 LFisher ScientificM/4056/17
7 ml kapaklı cam şişeler (58 x 17 mm) pk 399Fisher ScientificTUL-520-031K
Mutlak etanolHayman KimiaF200238
vakum pompası, örn., VP Serisi Vakum PompasıCamlab1136915

Kaynaklar

  1. Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals. Toxicol. Lett. 211, (2012).
  2. Rodgers-Gray, T. P., et al. Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development. Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).
  3. Jobling, S., et al. Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).
  4. Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish. J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).
  5. Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. Widespread sexual disruption in wild fish. Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).
  6. Jobling, S., et al. Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations. Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).
  7. Baynes, A., et al. Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments. Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).
  8. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
  9. Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade. Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).
  10. The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).
  11. Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol. Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).
  12. Mills, M. R., et al. Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment. Sci. Rep. 5, 10511(2015).
  13. EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods. , British Standards Institute. London, UK. (2006).
  14. Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas). Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).
  15. Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. A histological description of intersexuality in the roach. J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).
  16. Dascenzo, G., et al. Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities. Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).
  17. Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).
  18. Metcalfe, C. D., et al. Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes). Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).
  19. Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity. Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).
  20. Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol. Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).
  21. Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents. Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).
  22. Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish. Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).
  23. Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species. Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).
  24. Collins, T. J. TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems. Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).
  25. Collins, T. J. Designing Ligands for Oxidizing Complexes. Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).
  26. Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts. Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).
  27. Murk, A. J., et al. Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays. Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).
  28. Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  29. Kolle, S. N., et al. In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays. Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).
  30. Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos. BMC Biotechnology. 12, 32(2012).
  31. Brian, J. V., et al. Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals. Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).
  32. Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).
  33. Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , OECD Publishing. Paris. (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

strojenik Aktivite De erlendirmesiKimyasal Analiz Y ntemleriEkotoksikoloji Y ntemleriLC MS MS AnaliziMaya strojen TaramasKat Faz EkstraksiyonuGran ler Aktif KarbonHormon Bozucu Bile iklerevre M hendisli i Testleri

İlgili makaleler