Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

30.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54244

⸱

30 Haziran 2016

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

Bu makalede

Özet

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Protokol, monositlerin makrofajlara toplu farklılaşması ile birlikte dondurularak saklanmasını kullanır. Daha sonra hasat edilen makrofajlar daha sonra deneyler yapmak için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına ekilebilir.

Özet

Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşmış insan monosit türevi makrofajların hücre kültürü için bir protokol sunulmuştur. Deneylerin başlatılması için, taze veya donmuş monositler, makrofajlara farklılaşmalarını indüklemek için M-CSF ile 1 hafta boyunca şişelerde kültürlenir. Daha sonra, makrofajlar hasat edilebilir ve deneylerin yapılması için gerekli hücre yoğunluklarında kültür kuyularına tohumlanabilir. Deneyler için makrofaj kültürlerini başlatmak için tanımlanmış sayıda monosit yerine tanımlanmış sayıda makrofajın kullanılması, istenen hücre yoğunluğunun daha tutarlı bir şekilde elde edilebileceği makrofaj kültürlerini verir. Dondurularak saklanmış monositlerin kullanılması, donör mevcudiyetine olan bağımlılığı azaltır ve daha homojen makrofaj kültürleri üretir.

Giriş

Kültürlenmiş makrofajların incelenmesi, aterosklerotik plaklarda olduğu gibi inflamasyonda bu hücrelerin işlevini anlamak için yararlı bir modeldir. Araştırma odağı makrofajları içeren insan hastalıkları üzerine olduğunda, tür farklılıklarından kaçınmak için insan olmayan makrofajlar yerine birincil insan makrofajlarını incelemek yararlıdır. Ayrıca, hücre dönüşümünün etkileri, makrofaj hücre hatları yerine birincil makrofajlar kullanılarak önlenebilir. Bu amaçla, insan kanından izole edilen monositlerden farklılaşan makrofajlar, birincil insan makrofajlarının elde edilmesinin bir yolu olarak hizmet eder.

Doku makrofajları dokular içinde yerleşik olabileceği gibi, dokuya göç eden ve makrofajlara farklılaşan monositlerden türetilmiş olabilir 1. Sadece morfoloji açısından değil, aynı zamanda gen ekspresyonu ve hücre fonksiyonu açısından da farklılık gösteren iki tür insan monosit türevi makrofaj tanımlanmıştır 2. Bu iki tip, M-CSF + fetal sığır serumu (FBS) varlığında makrofajlara farklılaşan monositlerden ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) + FBS 2-6 varlığında makrofajlara farklılaşan monositlerden elde edilir. Deneyimlerimize göre (yayınlanmamış gözlem), FBS yerine insan serumunun kullanılması, farklılaşma ortamına M-CSF veya GM-CSF'nin dahil edilip edilmediğine bakılmaksızın GM-CSF tipini oluşturur. M-CSF tipi makrofajlar, morfolojilerinde kızarmış yumurtaya benzeyen GM-CSF tipi makrofajlardan daha uzun olma eğilimindedir. Araştırmacılar, insan M-CSF ve GM-CSF monosit kaynaklı makrofajların, M1 ve M2 fare kemik iliği kaynaklı makrofajlar 6 ile aynı olmadığını kabul etmelidir.

İnsan monositinden türetilmiş M-CSF farklılaşmış makrofajlar kullanılarak yapılan araştırmalar sırasında, monositlerin makrofajlara farklılaşması sırasında makrofajların elde edilen hücre yoğunluklarında deneyler ve varyasyonlar başlatmak için monositlerin mevcudiyeti ile ilgili zorluklar yaşadık. Bu sorunların üstesinden gelmek için, monositlerin kullanım için gerekli olana kadar dondurulduğu ve monositlerin toplu olarak makrofajlara ayrıldığı, daha sonra kültür şişelerinden çıkarılabildiği ve deneyden deneye daha homojen kültürler elde etmek için istenen hücre yoğunluklarında kaplanabildiği aşağıdaki protokolü geliştirdik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Lökoferez Sağlık kurumsal inceleme kurulu Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından onaylanmış bir insan öznenin araştırma protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. İzolasyon ve Monositler Kryoprezervasyon

  1. İnsan donörlerin lökaferez tarafından mononükleer hücreleri elde, ve referanslar 7,8 açıklandığı gibi mononükleer hücrelerin sürekli karşı akım santrifüj elutrasyonun tarafından monositler zenginleştirmek. Üretici tarafından belirtilen sivili ayrıştırma tamponunda - (% 90 monositler yaklaşık 80) yaklaşık 100 x 10 6 elutriated hücre elde. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  2. 300 xg'de 15 mi polipropilen tüp içinde santrifüj monositler Oda sıcaklığında 5 dakika karıştırıldı.
  3. Bir son% 90 FBS /% 10 dimetil sülfoksit konsantrasyonu 50 x 10 6 hücre / ml elde etmek için, dimetil sülfoksit, ardından FBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe Süpernatantı ve.
  4. Hücre süspansiyonu t her ml ekleyinbağımsız bir cryovial O.
  5. Hücre dondurma kapta cryovials yerleştir ve transfer -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya 24 saat boyunca, uzun süreli depolama için bir sıvı azot depolama tankı cryovial aktarmadan önce.

Makrofajlar içine Monositler 2. Farklılaşma

  1. hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosuna transfer ve hücre süspansiyonu yaklaşık% 70 çözülmüş zaman derhal kaldırarak hücre cryovial çözülme.
  2. Hemen, oda sıcaklığında komple erime üzerine Cı Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 2 mM L-glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml 1640 ortamı ısıtıldı, 37 °, 50 ml 1 ml cryovial içeriğini aktarmak interlökin-10 (IL-10) ve% 10 FBS (tam ortam).
  3. Aktarım, iki 75 cm 2 Plastik hücre kültürü şişesinden her birine monosit süspansiyonu 25 mi.
  4. 48 saat boyunca% 5 CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü inkübatöründe kültürleri inkübe edin.
  5. cu durulayınRPMI 1640 ortamı yavaşça bir gevşek bağlı hücrelerin yerini değiştirmemek için, kültür ortamının çıkarılması, (37 ° C önceden ısıtılmış) mi, 10 ile ltures 3 kez.
  6. durulama sonrasında, monositler ayırt kadar ortam her 2 günde bir değişen, taze tamamlanmış besiyeri ekleyebilir ve konfluent hale gelmeye yeterli çoğalır. Bu kültürün yaklaşık bir hafta gerektirir.

3. Hasat Makrofajlar Deneyler Başlatacak

  1. 10 ml bir şişe içinde 3 kez ayırt makrofajlar durulayın önceden ısıtılmış 37 ° C,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 10 ml ilave edilmeden önce 2 + ve Mg2 +, Ca olmayan 37 ° C Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su önceden ısıtılmış.
  2. makrofajlar yaklaşık% 90'ı yuvarlak ve müstakil olması gereken zaman 15 dakika - 10 hücre kültürü inkübatör Yeri balon. Şişenin mikroskopik inceleme ile bu doğrulayın.
  3. % 10 FBS içeren RMPI 1640 ortamında 10 ml ŞÜst trypsinization.
  4. 5 dakika boyunca santrifüj 50 ml polipropilen tüpe şişeye 300 xg makrofaj hücre süspansiyonu aktarın ve süpernatant atılır.
  5. Yavaşça tam ortam içinde 1 ml makrofajlar yeniden süspanse edin.
  6. 10 ul Tripan Mavisi solüsyonu ile makrofaj hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın ve bir hemositometre kullanılarak makrofaj hücre sayısı ve canlılığı (tipik olarak>% 95) belirler.
  7. Hücre sayımına bağlı olarak (genel olarak yaklaşık 15-18 x 10 5 makrofajlar), arzu edilen tohumlama hücre yoğunluğu elde etmek için ek bir tam orta ekleyin. Not: 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için 1.5 ml ortam içinde 1 x 10 5 makrofajlar yakın bir Birleşik kültür üretecektir.
  8. Tohumlamadan sonra, hücre tutunmasını sağlar,% 5 CO2 /% 95 hava ile 37 ° C hücre kültürü gece boyunca inkübatör içinde makrofajlar inkübe edin. Sonra, istenen deneyleri başlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tripan mavi 9 boyama ile saptandığı haliyle, taze veya dondurulmuş monosit canlılığı Şekil 1.% 95'den daha fazla olan ve Şekil 2, alt ve üst büyütmelerde karşılaştırabilir sırasıyla makrofajlara taze ve dondurularak saklanmış (yani, donmuş) monosit farklılaşmasının ilerlemesi. Kriyoprezerve monositler yaymak ancak yuvarlak kalmaz monositler ayırt gösteren bir alt göstermektedir taze karşılaştırıldığında unutmayın....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

tanımlı makrofaj türlerini üreten makrofaj biyoloji okuyan zaman araştırmacılar tarafından elde edilen çelişkili sonuçların bazılarını şöyle açıklamak mümkündür. çeşitli kültür koşulları ve farklılaşma faktörleri kullanımı primer insan makrofaj farklı makrofaj türlerine neden olabilir araştırmacı tarafından takdir olabilir bir gerçeği üretir. Örneğin, makrofajlar bazen serum tek başına insan serumu, FBS başına M-CSF, ya da M-CSF veya GM-CSF ihtiva eden FBS ile takviye edilmiş insan serumu kullanılarak insan monositlerin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Transfüzyon Tıbbı Bölümü, Klinik Merkez, Ulusal Sağlık Enstitüleri, aydınlatılmış monositler sağladı. Bu çalışma İntramural Araştırma Programı, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cellbind 12 oyuklu kültür plakasıCorning3336
CELLSTAR, T-75 şişesi, doku kültürü ile muamele edilmişGreiner Bio-One Kuzey Amerika658157
RPMI 1640 kültür ortamıCellgro Mediatech15-040-CM37 °C'ye ısıtıldı;
CL-Glutamin CellgroMediatech25-005-CI
Fetal sığır serumuGibco16000-036
M-CSFPeproTech300-25
GM-CSFPeproTech300-03
IL-10 PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
Kriyoviyal Termo Bilimsel 
Ca 2 + < / sup> ve Mg < sup>2 + < / sup> olmayan DPBS & nbsp;Corning cellgro21-031-CV
%0.25 Tripsin-EDTA Gibco25200-056
50 ml polipropilen konik boruFalcon352070
Trypan BlueLonza17-942E
Neubauer tarafından geliştirilmiş parlak ışık hemositometresiPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX hücre dondurma konteynerBioCisionBCS-405diğer dondurma kapları da bu adım için yeterli olmalıdır 
Sıvı Azot Depolama Sistemi, CryoPlus 1Thermo Scientific 7400herhangi bir sıvı azot tankı yeterli olmalıdır
375418

Kaynaklar

  1. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
  2. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  3. Akagawa, K. S. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).
  4. Akagawa, K. S., et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages. Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).
  5. Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).
  6. Lacey, D. C., et al. Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models. J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).
  7. Strasser, E. F., Eckstein, R. Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture. Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).
  8. Kim, S., et al. Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator. Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).
  9. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).
  10. Anzinger, J. J., et al. Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF). J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).
  12. Freeman, S. R., et al. ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains. J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).
  13. Kruth, H. S. Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles. Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).
  14. Jin, X., et al. ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol. J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).
  15. Ong, D. S., et al. Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport. J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).
  16. Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  17. Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages. J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).
  18. Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).
  19. Weiner, R. S., Normann, S. J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes. J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).
  20. Hansen, J. B., et al. Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes. J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).
  21. Seager Danciger, J., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).
  22. Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale. Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

M CSF DiferansiyasyonuKriyoprezerve MonositlerH cre K lt r ProtokolStromal Vask ler FraksiyonAk SitometrisiHemositometre Say mTrypsinizasyon Prosed rRPMI 1640 BesiyeriH cre Ekim Yo unlu u
Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.