İnsan deneklerin iç göz kapağı kenarının konjonktivasından hücreleri topladık, boyadık ve görüntüledik. Bu yöntem, hücre morfolojisini ve metabolik aktiviteyi karakterize ederek, kuru göz ve oküler yüzeyler arasındaki sürtünmenin oküler rahatsızlığı algılamada oynayabileceği rol hakkındaki anlayışımızı daha da geliştirebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kapak Silecek Area izlenim Sitoloji
Bu makalede
Özet
Özet
İç göz kapağının kapak sileceği (LW) alanının hücresel anatomisi hakkında az sayıda rapor mevcuttur ve sadece bir rapor sitolojik yöntemlerden yararlanır. Bu çalışmada, izlenim sitolojisi (IC) kullanılarak LW bölgesinden hücrelerin toplanması, boyanması ve görüntülenmesi için bir yöntemin optimizasyonu anlatılmıştır. Hücreler, hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) membranlar kullanılarak insan deneklerin üst göz kapağının iç yüzeyinden toplanır ve kadeh hücrelerinin, müsinlerin, hücre çekirdeklerinin ve çeşitli derecelerde ön ve para-keratinizasyonun varlığını ortaya çıkarmak için sitolojik boyalarla boyanır. İmmünositokimyasal boyalar, konfokal taramalı lazer mikroskobu kullanılarak hücre esteraz aktivitesini ve bozulmuş hücre zarlarını gösterir. Her numune için 100'e kadar mikroskobik dijital görüntü yakalanır ve tüm IC aralığının yüksek çözünürlüklü, büyük ölçekli bir görüntüsüne birleştirilir. LW alanındaki hücresel morfolojileri ve metabolik aktiviteyi tanımlamak için uygun, daha önce bildirilenden daha yüksek bir IC duyarlılığı gösteriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla, bu floresan boya seçimi, LW IC membranlarını görüntülemek için ilk kez kullanıldı. Bu protokol, kontakt lens kullanıcılarının veya kuru göz veya kapak silecek epiteliyopatisi olan hastaların hücresel özelliklerinin değerlendirilmesi gibi LW alanının belgelenmemiş ayrıntılarını ortaya çıkarmak için gelecekteki çalışmalarda etkili olacaktır.
Giriş
2 mm dar konjonktiva bölge göz küre karşı - insan üst göz kapağı sadece 1 ile 10,000 yanıp her gün yaklaşık 1 yürütür. Yanıp sırasında silme hareketi nedeniyle, göz kapağı kenarında bu bölümü "kapak silecek" bölgesini 2 olarak adlandırılmıştır. Sürtünme yüzünden dünya üzerinde silme kapak, alışılmış kırpma sırasında bu bölgede yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bu göz konfor önemli bir rol oynayabilir. Kontakt lens özellikle deneyim göz rahatsızlık kullananlar ve bu mercek 3 giymek durdurması için birincil nedenlerinden biridir. Bir kontakt lens göze yerleştirildiğinde, lens materyali ve göz yüzeyi arasındaki sürtünme katsayısı 4 değiştirme gösterilmiştir. Kuruluk belirtileri bu değiştirilmiş sürtünme 2,5,6 ilişkili olabileceğini gösteren kanıtlar vardır.
Bu ilişki aynı zamanda klinik olarak gözlemlenebilir olayların yansıması olabilir, özellikle kapak wiepitelyopati (LWE) da denilen üst kapak marjı boyama (ULMS) 6 başına. LWE oküler irritasyon erken bir belirtisi ve kuru göz hastalığı için potansiyel bir belirleyicisidir. Bu görülen üst ve alt kapak kenarında bölgelerinin önemli bir boyama ile ölçülür. Bu derecelendirme sistemi 2 ve klinik geçerliliği (yani öznel belirtiler ile korelasyon) tartışma halen iken, göz rahatsızlığı, hem doktorlar ve bilim adamları için bir bilmece kalır ve en önemlisi, hastalar için bir rahatsızlık.
To-date, küçük kapak silecek alanının 7 (alt), hücresel anatomi ve fizyoloji klinik-alakalı varyasyonları hakkında bilinmektedir ve sadece tek bir rapor sitolojik yöntemler 8 kullanmaktadır. Gösterim sitoloji (IC) bir zar 9,10 uygulanması ile bulber veya tarsal konjonktiva epitel yüzeyinden hücreleri toplamak için 40 yıldır istihdam edilmiştir. çıkarılması üzerine, yapışan hücreler c geçmesiytological boyama ve mikroskopik görüntü. Nedeniyle kapak silecek bölgedeki anatomik ve hücresel farklılıkları, bu teknik optimizasyon gerektirir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik deyimi: Ön insan denekler hücreleri toplamak için, aydınlatılmış onam ve etik onayı alınmalıdır.
1. Leke hazırlayın
NOT: Deney günü boya hazırlayın.
- 15 ml santrifüj tüpü içinde 2.5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 5 ul Etidyum (veya 4 uM) ve 5 ul Calcein AM (veya 4 uM) ilave et; karıştırın. kullanılana kadar oda sıcaklığında hafif ve deposundan korumak için alüminyum folyo ile sarılır.
2. Toplama Hücreler
- kendi paketinden hücre kültürü ekler çıkarın ve her göz kapağı numune alınacak için etiket. kalıcı bir kalem kullanarak zar plastik tutucu tarafında hücre toplama Mark yönelimi. Davranış IC geçmesi bölgenin uygun sağlığını onaylamak için orta büyütme (yaklaşık 20X) Lambanın denetim yarık.
- ea alt konjunktival kesesine topikal anestezi (% 0.5 proparacaine hidroklorür) bir damla dağıtınch göz ve gözleri korumak için katılımcıyı talimat bir dakika süreyle kapattı.
- Evert üst göz kapağı ve kirpik tarafından yerinde tutun; kapak silecek alanı ile herhangi bir temastan kaçının.
İsteğe bağlı: İkincil araştırmacı yardım Bu adımı gerçekleştirmek gerekebilir. - minimal basınç ile kapak silecek bölgenin orta kısmında dik olarak membran uygulayın.
- 5 saniye - 3 yerine membran tutun. iletişim alanında saydam hale membran gözlemleyin. Bu noktada, hafifçe membran kaldırmak ve yerine geri "çevirmek" için katılımcının kapağını izin verir.
- Derhal kurumasını önlemek için, örnek PBS bir damla uygulanır. Membran saydam dönecek ve bu kurumayı belirttiği gibi, herhangi bir zamanda opak dönmemelidir. İkincil araştırmacı örneklerinin işlenmesi (bölüm 3) ile hemen devam var.
- konjonktiva bütünlüğünü sağlamak için nihai göz kontrolü yapıyoruz. oküler yağlayıcılar koyun ve katılımcıyı talimatanestetik etki kapalı giyer kadar gözlerini ovuşturarak önlemek için (yakl. 15 dk).
3. Örnek İşleme
- mikro-makas kullanılarak, dikey hücresi ile toplama ortasından ikiye (alt analizler her biri için bir adet yarım) membran kesti. plastik tutucu ayırmak için bir membran yarısının dış kenarı boyunca kesme; membran kendi üzerine kat etmemesini sağlamak da dahil olmak üzere membran üzerinde toplanan hücreleri ile etkileşimi önlemek.
- tamamen sahibinden ayrılmakta önce cımbız kullanarak membran sabitleyin. % 95 (h / h) ihtiva eden bir 500 ul ihtiva eden ve (Bölüm 4.2) işleme önce 2 saat, en fazla 20 dakika içinde en az düzeltmek için terk etiketli 2 ml santrifüj tüpüne yer membran.
- (Bölüm 3.2'de anlatıldığı gibi) ve derhal bölüm 4.1 ile devam membran hemen ayrı ikinci yarısı.
4. Numune Boyama
- Immunocytochemical Boyama
- Dikkatle toplama yüzü aşağı bakacak şekilde 35 mm cam alt kültür çanak membran yerleştirin; Membran düz olduğundan emin olun.
- Pipet zara bölüm 1 monte İmmünositokimyasal leke kompozisyon 20 ul. Örnek bukleler kadar, dikkatle kenarlarını bastırarak membran düzleştirmek için tek kullanımlık pipet uçları kullanın. Hücre toplama alanları ile temastan kaçının.
- Yavaşça cam kapak slip ile membran kapak. Numunenin gereksiz hareketini önlemek. Kapaklı çanak Kapak ve kenarlarda laboratuvar film ile kapatın. çanak (üstte ve altta) ve numunenin görünürlük şeffaflık engellemeyin. laboratuar işaretleyici ile etiketleyin.
- Hemen görüntüleme (bölüm 5.1) ile devam, sonra membran diğer yarısı sitolojik boyama ile devam etmek için bölüm 4.2 dönün.
- sitolojik Boyama
- Yavaş yavaş yavaş tüp u damıtılmış su, 500 ul ekleyerek membran hidratbölüm 3.4 tespiti için sed. pipet içine aspire içeriği defalarca sonra içeriğini kaldırmak, karıştırın.
- damıtılmış su, 500 ul ekle. Birkaç saniye için ayakta Izin, sonra çıkarın. Alcian blue 500 ul ilave edin ve 3 dakika boyunca bırakın. leke çıkarın ve 3 ardışık 500 ul damıtılmış su durular veya sıvı berrak durular kadar gerçekleştirin.
- Hematoksilen 1. leke 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve üç ardışık 500 ul distile su durulama gerçekleştirmek veya sıvı berrak durular kadar. berrak bir sıvı aspire (bölüm 4.2.1 tersini) kurutmak.
- Papanicolaou RG-6 leke 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve bir 500 ul% 95 (v / v) etanol durulama gerçekleştirin.
- Papanicolaou EA-65 boyasının 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve 3 ardışık 500 ul% 95 yerine (v / v) etanol durular.
- Tam üç ardışık 500 ul% 100 etanol durulama kullanarak kurutmak. TWE kullanarakezers, çözeltiden örneği kaldırmak; dokunaklı hücre toplama alanları kaçının.
- cam slayt membran yerleştirin; Bu hücre toplama hattı sağlamak paralel veya görüntüleme sırasında daha kolay uyum için marjını slayt dik olarak ayrılmaktadır.
- % 100 etanol bir damla uygulayın ve cam slip ile kaplayın. Hemen görüntüleme (bölüm 5.2) ile devam edin.
5. Numune Görüntüleme
- Görüntüleme Floresan İmmünositokimyasal Renklendiriciler
- Bir görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir dijital renkli kamera ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 11 veya floresan mikroskop 12, kullanın. örnekler kültür tabaklarına içinde bulunan kısmi olarak, bir inverted mikroskop gerekli olabilir.
- Etidyum homodimer-1 (DNA'nın mevcudiyetinde 528/617 nm örn / Em maxima) ve kalsein AM absorpsiyon ve emisyon spektrumu (494/517 nm e göre olan mikroskop 11,12 ayarlamax / Em maxima).
- (Örneğin, 2.5X objektif) mikroskop düşük büyütme seçin ve dijital görüntüleme sistemini aktive; bilgisayar ekranında görüntülenen örnek gözlemlemek.
- ilgi hücresel özellikleri için örnek olup olmadığını kontrol edin.
- İstenilen mikroskop büyütme seçin ve görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri kazanır.
- Yerli mikroskop dosya biçiminde veya sıkıştırılmamış bir dosya biçiminde (örneğin, * .raw, * .tiff) ya dosyaları kaydedin.
- Görüntüleme Sitolojik Lekeleri
- Bir görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir dijital renkli kamera ile donatılmış herhangi bir filtre standart bir laboratuvar parlak alan mikroskobu, kullanın.
- Yeri ve mikroskop sahnede (adım 4.2.8 itibaren) kilit cam slayt. gerektiği gibi tüm görüntüleme işlem boyunca,% 100 etanol ile örnek rehidrate.
- (Örneğin, 2.5X objektif) mikroskop düşük büyütme seçin ve inci etkinleştirmekE dijital görüntüleme sistemi; bilgisayar ekranında görüntülenen örnek gözlemlemek.
- Emin olun hücre toplama mikroskop sahne kontrolü X veya Y ekseni ya uyumludur. kapak kayma kaldırarak ve bir pipet veya cımbız kullanarak örnek çevirerek, gerekirse ayarlayın.
- görüntüleme yazılımı, en düşük mikroskop büyütme ile tüm numunenin yakalama resim (ler) kullanma.
- Orta mikroskop büyütme geçin (örneğin, 10 - 20X objektif) ve mikroskop ışık kaynağı ve yazılım görüntüleme parametrelerinin (pozlama, kontrast, beyaz dengesi, vs.) ayarlayabilir ve onların otomatik yazılım ölçüm devre dışı bırakın. ileride kullanmak için bu ayarları kaydedin.
- Tarama (örneğin, sol üst ve hücre koleksiyonu sağ alt köşelerinde) başlangıç ve bitiş noktalarını belirleyin.
- görüntüleme yazılımı, başlangıç ve bitiş noktaları içinde tüm hücre toplama alanının yakalama resim (ler) kullanma. % 20 yan-yana ve üst-to-alt üst üste betw sağlamaktüm bitişik görüntüleri een.
- Yerli mikroskop dosya biçimini veya sıkıştırılmamış dosya biçimi (örneğin, * .raw, * .tiff) kullanarak dosyaları kaydedin.
- (Örneğin, Adobe Photoshop Elements) seçim otomatik dikiş yazılımını kullanarak nihai panoramik görüntü oluşturun. Son görüntüde otomatik dikiş doğruluğunu onaylamak için adım 5.2.5 alınan referans görüntüleri) kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
plastik tutucu üzerine yayılmış hücre kültürü membran kapak silecek konjonktiva epitel hücrelerinin el toplanması için uygun bir araçtır. Bu yöntem genellikle hazırlamak ve IC membranlar işlemek için kullanılan ek sterilize aletler için gereğini ortadan kaldırır. 1 hücre kültürü eki kullanarak kapak silecek alanının IC tasvir Şekil. Biz yeni bir moda kapak silecek alanından epitel hücreleri karakterize etmek için birbirini tamamlayan iki farklı boyama pr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Gösterim sitoloji genellikle karışık selüloz ester membranlar kullanılarak, konjonktivada üzerinde gerçekleştirilir. Numuneler, dökme malzeme levhalar boyutta kesilir sterilize forseps kullanılarak konjunktival yüzeye uygulanan ve kaldırılır. Aynı membran malzeme kullanarak, bir piston kontrollü IC cihaz son zamanlarda uygulamalar 13 arasında tutarlı bir baskı bulber konjonktiva yüzey geometrisini maç ve korumak için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımlar bölge silecek dar, belirgin kavisli kapağı verimsizdir
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak ilgili bir finansmanı veya çatışması yoktur.
Teşekkürler
Kapak sileceği konusunda içgörü ve uzmanlık sağlayan ve bu araştırmaya büyük ölçüde yardımcı olan meslektaşımız Dr. Jalaiah Varikooty'ye teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alcian Mavisi, %3'te %1 Asetik Asit | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoksilen, Solungaç 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou boyası, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou boyası, Modifiye EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Canlı/Ölü Canlılık/Sitotoksisite Kiti | Yaşam Teknolojileri | L-3224 | etidyum homodimer-1 ve Calcein boyaları |
| Alcaine (% 0.5 proparakain hidroklorür) | Alcon | ||
| Millicell Hücre Kültürü Eki, 12 mm, hidrofilik PTFE, 0.4 &mikro; m | EMD Kırlangıç | PICM01250 | |
| 35 mm Cam Alt Tabaklar | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Kaynaklar
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. Confocal microscopy. , Academic Press. London. 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
