molekül bağlarının doğasında titreşim dayalı Tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) mikroskopi etiket ücretsiz kimyasal seçici canlı hücre görüntüleme izin verir. safir lazer ve bir OPO lazer: Bu çalışma femtosaniye Ti dayalı standart bir multiphoton lazer tarama mikroskobu tamamlayıcı mikroskopi tekniği uygulanmasını sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Bir femtosaniye Ti birleştirerek lazer tarama mikroskobu: Lazer çizgisini çoğaltmak için safir lazer ve optik parametrik osilatör (OPO) biyologlar için kullanılabilir hale gelmiştir. Bu sistemler, öncelikle çok kanallı iki foton floresan mikroskobu için tasarlanmıştır. Ancak, herhangi bir değişiklik olmadan, bu tür ikinci harmonik nesil (SHG) veya üçüncü harmonik nesil (THG) gibi tamamlayıcı doğrusal olmayan optik mikroskop da yapılandırılmış moleküller veya sulu Gelir Orta etiketi içermeyen görüntüleme sağlayan bu set-up ile yapılabilir lipit arayüzleri. Bu teknikler, in vivo gözlem için uygundur, ancak kimyasal özgüllük sınırlıdır. Kimyasal seçici görüntüleme Raman saçılması dayalı doğal titreşim sinyalleri elde edilebilir. Konfokal Raman mikroskobu 3D uzaysal çözünürlüğü sağlar, ancak yüksek ortalama güç ve uzun edinimi süresi gerektirir. Bu zorlukları aşmak için, lazer teknolojisindeki son gelişmeler devel izin vardoğrusal olmayan optik titreşim mikroskopi opment, özellikle tutarlı bir anti-Stokes Raman içinde (CARS) saçılma. ARABALAR mikroskopi Bu nedenle kimyasal eşleştirme (OH streç titreşimler yoluyla) (CH streç titreşim yoluyla) lipidler, su, proteinler veya DNA, biyolojik ve canlı hücre görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, standart bir OPO-birleştiğinde multiphoton lazer tarama mikroskobu CARS tekniğin uygulanmasını açıklar. Bu lazer ışını yolu birinin uzunluğunun ayarlanması ile iki lazer hatları arasında zamanlı senkronizasyon dayanır. Biz varolan multiphoton sistemi üzerinde bu tekniğin bir adım-adım uygulama mevcut. Deneysel optik bir temel arka plan yararlı ve sunulan sistem pahalı ek donanım gerektirmez. Ayrıca kemirgen siyatik sinirinin miyelin kılıflarının elde görüntüleme CARS göstermektedir, ve bu görüntü, standart t gibi doğrusal olmayan optik görüntüleme ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir göstermektedirwo-foton floresan tekniği ve ikinci harmonik nesil.
Giriş
Optik mikroskop bir hücre içi çözünürlük ile biyolojik sistemlerin canlı dinamik süreçlerin tahribatsız görselleştirme için önemli bir teknik haline gelmiştir. Floresan mikroskobu nedeniyle yüksek özgüllük ve duyarlılık 1 şu anda canlı hücrelerde kullanılan en popüler görüntüleme kontrast. flüoresan büyük bir palet (eksojen boyalar, genetik olarak kodlanmış proteinleri, yarıiletken nanopartiküller) ortaya çıkmıştır. Çeşitli örnek aydınlatma floresan tabanlı teknikler 3D görüntüleme gerçekleştirmek için ve 2 photobleaching bu tekniğin ana dezavantajı azaltmak için (örneğin konfokal veya iki foton mikroskopi gibi) gelişmiştir. Moleküler türlerin ç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Şekil 1. Genel set-up şematik görünümü Bu Ti içerir. Safir (680 - 1080 nm) ve OPO (1050 - 1300 nm) lazerler, (M 4 M 1) 4 aynalarla gecikme hattı, hızlı osiloskop, fotodiyot ve iki sabit iris diyaframlar Ben 1 ve 2. Aynalar M 2 ve M 3 mikrometre çözünürlük ile gecikme hattı uzunluğunu değiştirmek sağlayan bir doğrusal çeviri aşamasında sabitlenir. A 660 -. 685 nm bant geçiren filtre OTOMOBİLLER görüntüleme için kullanılan photomulti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Standart Ti darbe tren sıklığı: safir lazer, genellikle yaklaşık 80 MHz. lazer safir: OPO o Ti tarafından pompalanır beri aynı frekansa sahiptir. En az 200 MHz hızlı osiloskop nedenle gereklidir. aralığında hızlı bir fotodiyot 600 1100 nm de gereklidir. Safir ve OPO sinyalleri 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6.2 nanosaniye kaydırılır: Ti zaman maksimum zamansal kayma oluşur. Bu 1.9 M maksimum ışın yolu kaymasına karşılık gelen Ti 2 OPO lazer ışını (A) kayıt pals z.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
işin en zorlu kısmı lazer ışınları zamansal eşitleme olduğunu. Bu hızlı bir osiloskop ile birlikte hızlı bir fotodiyot gerektirir, ancak zaman içinde sadece kaba bir örtüşen ilk başta yapılabilir. Sonra birkaç cm daha ayarlaması gerekmemektedir. Son olarak, bir lineer çeviri aşamasında tarafından mikrometre hareket OTOMOBİLLER sinyali tetiklemek için gecikme hattı uzunluğunun nihai ince ayar yapmak mümkündür. yapıldı aşaması mikrometre sürücü ayarlanması sureti ile gözlemlenen Bu sinyal, yaklaşık 20 mikrometre arasında .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, hızlı osiloskopun ödünç verilmesi için Dr. Philippe Combette'e (IES, UM, Montpellier, Fransa) teşekkür etmek ve Montpellier RIO Görüntüleme'nin (MRI) mali desteklerini kabul etmek istiyor. İK, ANR'nin tutarlı Raman görüntüleme geliştirmeleri için France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) ve France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) altyapı ağlarını hibe ettiğini kabul etti. Bu çalışma esas olarak bir Avrupa Araştırma Konseyi hibesi (FP7-IDEAS-ERC 311610) ve NT'ye bir INSERM - AVENIR hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Osiloskop | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Fotodedektör | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Safir lazer Chameleon Ultra Family II | Tutarlı | ||
| Optik parametrik osilatör OPO Kompakt Aile | APE Berlin | ||
| Axio Examiner mikroskobu LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorlu periskop | Newport | ||
| Objektif W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Işın birleştirici | Carl Zeiss | ||
| Akusto-optik modülatör | Carl Zeiss | ||
| OPO güç zayıflatıcı | Carl Zeiss | ||
| Fotoçoğaltıcı tüp | Carl Zeiss | ||
| ZEN yazılımı | Carl Zeiss | ||
| Bant Geçişi filtreler | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 Nm; 465 - 610 nm |
| Dikroik ayna | Carl Zeiss | Kesme dalga boyu 760 nm | |
| Gümüş aynalar | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20.000 nm, Miktar 4 |
| Standart mikrometre ile tek eksenli çeviri aşaması | Thorlabs | PT1/M | Miktar 1 |
| Alüminyum breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Miktar 1 |
| Ayna montajlı | Thorlabs | KMSS/M | Miktar 4 |
| ø için ayna tutucu; 1" Optik | Thorlabs | MH25 | Adet 4 |
| İris diyaframı | Thorlabs | ID8/M | Miktar 3 |
| Koruyucu kutu | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Miktar 1 |
| Optik direkler | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Miktar 8 (kuruluma bağlı olarak uzunluklar) |
| 661 - 690 nm bant geçiren filtre | Semrock | 676/29 nm BrightLine® tek bantlı bant geçiren filtre | Miktar 1 |
| Floresan boncuklar | ThermoFisher | TetraSpeck ve ticaret; Floresan Mikro Küreler Boyut Kiti | |
| Lazer görüntüleme kartı | Thorlabs | IR lazer görüntüleme kartı | |
| Lazer güvenlik camı | Newport | LV-F22. P5L07 | |
| FloroMiyelin ve ticaret; Kırmızı Floresan Miyelin Boyası | ThermoFisher | F34652 |
Kaynaklar
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
