Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

9.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54269

⸱

8 Haziran 2016

 ,  , 
1Centre for Advanced Macromolecular Design (CAMD), The University of New South Wales, 2Australian Centre for NanoMedicine (ACN), The University of New South Wales, 3School of Chemical Engineering, The University of New South Wales

Bu makalede

Özet

Bu makale, görünür ışık aracılı dispersiyon polimerizasyonu kullanılarak polimerik kendi kendine monte nanopartiküller üretmek için bir süreci açıklamaktadır. Polimerizasyonu kontrol etmek için düşük enerjili görünür ışığın kullanılması, yüksek katı madde içeriğinde kendi kendine monte edilen solucan benzeri misellerin tekrarlanabilir oluşumuna izin verir.

Özet

Burada sunulan, görünür ışık aracılı dispersiyon polimerizasyonu ile solucan benzeri misellerin kolay sentezi için bir protokoldür. Bu yaklaşım, tersinir ekleme-parçalanma zincir transferi (RAFT) polimerizasyonu kullanılarak hidrofilik bir poli (oligo (etilen glikol) metil eter metakrilat) (POEGMA) homopolimerinin sentezi ile başlar. Hafif görünür ışık ışınlaması altında (λ = 460 nm, 0.7 mW/cm2), rutenyum bazlı bir fotoredoks katalizörü, Ru (bpy) 3Cl2 varlığında bu makro zincir transfer ajanı (makro-CTA), Fotoindüklenmiş Elektron Transferi RAFT (PET-RAFT) olarak bilinen bir işlemde iyi tanımlanmış bir blok kopolimer oluşturmak için ikinci bir monomer ile zincir uzatılabilir. PET-RAFT, POEGMA'yı etanol (EtOH) içinde benzil metakrilat (BzMA) ile zincirleme uzatmak için kullanıldığında, polimerizasyona bağlı kendi kendine montaj (PISA) mekanizmasına göre yerinde farklı morfolojilere sahip polimerik nanopartiküller oluşturulur. Çekirdekte korona ve poli (benzil metakrilat) (PBzMA) zincirlerinde POEGMA zincirleri sunan nanopartiküller halinde kendi kendine montaj, PBzMA bloğunun etanol içinde artan çözünmezliği nedeniyle yerinde gerçekleşir. İlginç bir şekilde, oldukça saf solucan benzeri misellerin oluşumu, polimerizasyon sırasında meydana gelen nanopartikül dolaşıklıkları nedeniyle yerinde yüksek viskoziteli bir jelin başlangıcını gözlemleyerek kolayca izlenebilir. Böylece bu işlem, polimerizasyon sırasında çözelti viskozitesini basitçe izleyerek solucan benzeri misellerin daha tekrarlanabilir bir sentezine izin verir. Ek olarak, ışık uyaranı, nanoparçacık morfolojisi üzerinde zamansal kontrolü gösteren AÇIK / KAPALI bir şekilde aralıklı olarak uygulanabilir.

Giriş

Küresel olmayan (ve diğer) nanoparçacık morfolojileri sentezi geleneksel iyi tanımlanmış amfifil diblok (veya çoklu) kopolimerlerin sentezi ve saflaştırılması ile başlayan bir çok aşamalı montajı çok prosedür kullanılarak gerçekleştirilmiştir. En yaygın montajı çok tekniklerinden biri 1990'larda Eisenberg ve popüler blok 1-3 biri için bir solveni içinde yavaş yavaş ilave edilmiştir, her iki polimer blokları için ortak bir çözücü içinde, amfifilik blok kopolimerin çözünmesini içerir edildi . seçici bir çözücü (tipik olarak su) ilave edilir olarak, blok kopolimerin polimerik nano partiküllerin oluşturulması için kendi kendine montaj maruz kalır. Nihai morfolojisi (veya morfolojileri karışımları) nanopartiküllerinin gibi her polimer bloğunun, su ilave oranının ve ortak çözücünün doğasına göreceli uzunluklar gibi faktörlerin büyük sayısına göre belirlenir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, genellikle yalnızca nanopar üretimine olanak sağlarnispeten düşük katı içeriğine (en az 1 ağırlık% 'si) ticles ve bu pratik ölçeklenebilirlik 4 sınırlar. Buna ek olarak, bu tür solucan benzeri miseller olarak "orta" fazların tekrarlanabilir oluşumunun Küresel olmayan bir morfolojiye 5 stabilize etmek için gereken parametrelerin dar bir aralık nedeniyle zor olabilir.

Polimerizasyon kaynaklı montajı çok (PISA) yaklaşımı, kısmen nanopartikül sentezi için izin yerinde kendi kendine montaj sürücü polimerizasyon işlemi çok daha yüksek katı madde içeriğine kendisini kullanarak Eisenberg yaklaşımın dezavantajları ele (tipik olarak 10-30 ağırlık%) 6 -8. Tipik PISA yaklaşımda, canlı bir polimerizasyon işlemi, reaksiyon ortamı içinde, başlangıçta çözünebilir fakat çözünmez bir polimer oluşturan bir monomer ile bir çözücü çözünebilir makroinisiyatör (ya da makro-CTA) uzanan zincir için kullanılır. PISA yaklaşımı sistematik ex bir dizi test Sonsuz benzeri miseller sentezlemek için kullanılmıştır zenlenen parametreler ve sentetik "yol haritası" 5,9 olarak ayrıntılı faz diyagramlarını kullanarak.

onların zorlu sentez rağmen, nedeniyle küresel meslektaşları göre onların ilginç özellikleri solucan gibi nanopartiküller büyük ilgi var. Örneğin, bir PISA yaklaşımı kullanılarak sentez ilaç yüklü kısa ve uzun solucan gibi miseller küresel misellerin ya da 10 veziküller kıyasla in vitro sitotoksisite önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Diğerleri in vivo modellerde 11 nanoparçacık boy oranı ve kan dolaşımı zaman arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir. Diğer uygun PISA metodolojisi kullanılarak solucan gibi nanopartiküllerin sentezi nedeniyle nanopartikül filamanların nano ölçekli dolanması için makroskopik jel verir göstermiştir. Bu jeller termik olarak kendi sol-jel davranışı 12 bağlı sterilize jeller gibi potansiyel göstermiştir.

"ontent> Bu protokol, basit olarak polimerizasyon sırasında çözelti viskozitesine gözlemleyerek solucan gibi misellerin oluşumu yerinde izlenmesi için izin veren bir yöntemi tarif etmektedir. Benzer solucan gibi misel jellerin önceki çalışmalar bu kritik sıcaklığının üstünde, bu göstermiştir nanotanecikler geri solucan küre geçiş geçmesi ve bu nedenle yüksek sıcaklıklarda serbest akan dispersiyonlar oluşturur. bugüne kadar, bu sistem jelasyon hali hazırda bu sistemlerde görülen olabilir 13,14 ve bu kontrollü bir polimerizasyonu başlatmak için, termal olarak hassas azo bileşiği kullanmışlardır termal polimerizasyon. Bu çalışmalardan sırasında, daha düşük sıcaklıklarda PISA türetilmiş nanopartıküllerin sentez, yerinde, bu jelasyon davranışı gözlem için izin verebilir olduğu varsayılmıştır.

Son zamanlarda biz nanopartiküller elde etmek için PISA süreci aracılık etmek, basit bir oda sıcaklığı fotopolimerizasyon tekniğin kullanımını bildirdiFarklı morfolojileri 15. Burada, bir görsel protokol polimerizasyon esnasında çözelti viskozitesi davranışını gözleyerek solucan gibi misellerin tekrarlanabilir sentezi için sunulmuştur. Dispersiyon polimerizasyon ilerlerken hali hazırda ticari olarak temin edilebilen ışık yayıcı diyotlar (LED'ler) kullanan (λ = 460 nm, 0.7 mW / cm2).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Sentezi ve POEGMA Karakterizasyonu Makro-CTA

  1. Oligo (etilen glikol) metil eter metakrilat (OEGMA) (12 g, 4 x 10 -2 mol), 4-siyano-4- (phenylcarbonothioylthio) pentanoik asit (CPADB) (0.224 g, 8 x 10 -4 mol) ilave edin 2,2'-azobis (2-metilpropionitril) (AIBN), 100 ml yuvarlak tabanlı bir şişeye (16.4 mg, 0.1 mmol) ve 50 mi asetonitril (MeCN).
  2. uygun büyüklükte bir kauçuk septumu ve çelik tel ile balon kapatılır ve bir buz-su banyosu içinde <4 ° C, oda sıcaklığı ila balon soğutulur.
  3. Bir delik ikinci bir 21 G iğne (0.8 mm x 38 mm), hareket eden bir 21 G iğnesi (0.8 mm x 120 mm) ile, reaksiyon karışımı içine doğrudan nitrojen kabarcıklanarak 30 dakika süreyle balon oksilenlendirilmesi.
  4. bir buz-su banyosunda immersiyon ile polimerizasyonu söndürülmesi ve hava içeriği maruz kalmadan önce 5.5 saat süre ile 70 ° C'de bir yağ banyosunda tutulur,.
  5. ac altında ajitasyon ile MeCN kaldırbasınçlı hava ve ontinuous akışı 40 ml tetrahidrofuran (THF) ~ ham karışım tekrar çözülür.
  6. hızla karıştırılmış bir petrol menşeli karışımı (bp 40-60 ° C) ve dietil eter, 400 ml bir şişeye damla damla içeriğini ekleme (70:30, h / h) ve süpernatan, artık bulutlu kadar karıştırmaya devam edin.
    Not: Bir buz banyosu içinde soğutma çöktürme sürecini hızlandırmak için kullanılabilir.
  7. Süpernatant boşaltacaktır ve ~ 40 mi THF içinde, polimer bir tortu yeniden çözülür.
  8. Kalan OEGMA monomer tümüyle kaldırılmasını sağlamak için (1.5-1.7 adımlar), en az iki kez daha yağış işlemi tekrarlayın. 4 saat boyunca vakumlu bir fırın (20 ° C, 10 mbar), sıkıştırılmış hava ve kurutma sürekli bir akışı altında ilk çalkalama ile saflaştırılmış POEGMA makro CTA den fazla olan çözücüyü yok.
  9. Daha önce bildirilen yöntem kullanılarak nükleer manyetik rezonans ile POEGMA makro CTA (NMR) (M, N, NMR) sayısal ortalamalı moleküler ağırlığı belirlemek 15 kadar. Polimer dağıtma özelliği (Ð) hesaplamak jel sızdırma kromatografisi 15 (GPC) (mobil faz ve kalibrasyon için uygun standartlar olarak dimetilasetamid) kullanma.
    Not: Bir POEGMA M n makro-CTA, NMR = 9.000 ve Ð <1.15 boyun eğmek zorundadır yukarıdaki sentez (1.1-1.8 adımlar) kullanma. Sentezlenmiş POEGMA makro CTA moleküler ağırlığı (ve dispersitesi) burada sunulan sentez farklıysa (7,000 arasında - 1000 g / mol), (in situ jelleşmesi ile belirtildiği gibi), solucan gibi misellerin oluşumu hala kullanılarak oluşabilir biraz değişmiş reaksiyon süresi de olsa (bölüm 2) sunulan sonraki PISA yöntemi.

PISA kullanarak -PBzMA Nanopartiküller b POEGMA- 2. Hazırlık

  1. Ru (bpy) 3Cl 2. 6H 2 O, etanol (EtOH) 'in bir 1 mg / ml stok çözelti hazırlayın. Solvent buharlaşmasını en aza indirmek için buzdolabında stok solüsyonu saklayın.
  2. pamuk küçük bir tomar sıkıca paketi yardımcı olmak için ikinci bir pipet kullanarak bir Pasteur pipeti takın. yaklaşık olarak 5 sm bir sütunu elde pamuk tapa ile pipet içine bazik alüminyum oksit dökün. kolonu boyunca ~ BzMA 3 ml geçen ve deinhibited BzMA eluent toplayarak ticari BzMA monometil eter hidrokinon inhibitörü çıkarın.
  3. POEGMA macroCTA (~ 9.000 g / mol; 76.9 mg, 8.5 x 10 -6 mol) ilave edin. (0.301 g, 1.71 x 10 -3 mol) BzMA deinhibited, Ru (bpy) 3Cl 2 6H 2 O (128 ug, 1.71 x 10 -7 mol, 4 ml bir cam şişeye, 1 mg / ml etanolik stok çözeltisi 128 ul), 0.383 mi MeCN ve 1.402 mi EtOH (1,913 ml toplam çözücü 80 ağırlıkça% 20 hac / hac% MeCN) .
  4. adımlarda 1.2-1.3 belirtildiği gibi deoksijenasyon prosedürü uygulayın.
  5. 2.000 ml'lik bir cam kabın içinde flakon yerleştirin (Şekil 2) mavi LED şeritleri ile kaplı (λ max = 460mil, 0.7 mW / cm2) ve manyetik karıştırma ile, oda sıcaklığında ışın tedavisi. Rutin olarak 20 saat sonra, reaksiyon şişesine izlemek ve şişe (Şekil 3) ters çevrildiğinde, yüksek viskoziteli solüsyon serbest duran jel oluşturan reaktöre çıkarın.
    Not: Burada sunulan koşulları kullanarak mavi ışık ışınlama yaklaşık 24 saat olmalıdır serbest duran jel elde etmek için toplam süreyi. Işık uygulaması reaktörlerde küçük farklılıklar (fiziksel boyutları, yoğunluğu, vb) solucan benzeri miseller in situ oluşumu elde etmek için biraz değişmiş koşulları (özellikle, reaksiyon süresi) gerektirir.
  6. Reaktörden çıkarıldıktan sonra, bir kaç dakika için havaya nanoparçacık jel tatbik edilmiş ve karanlıkta dik kapalı bir şişede depolanmasıyla polimerizasyonu söndürme.

Nanopartikül Morfoloji 3. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) Görüntüleme

  1. Ham nanopa yaklaşık 40 mg koyun4 ml bir cam şişe içinde (bölüm 2) MADDE jeli.
  2. Sürekli bir vorteks mikser kullanılarak nano partiküler jel ajite ve en az 5 dakika civarında bir süre boyunca, EtOH damla damla 4 ml. Jel bir çözücü ekleme sırasında serbest akan çözelti, olmalıdır.
    Not: Jel çok hızlı bir şekilde veya yeterli çalkalandı EtOH ile seyreltilir ise, nanopartiküllerin bir çökelme meydana gelebilir. adım 3.3'e bakınız.
  3. cam yünü süzülerek seyreltilmiş nanopartiküller herhangi makroskobik agrega çıkarın.
  4. Daha önce rapor edilen prosedüre göre seyreltilmiş numunenin (uranil asetat boyama) TEM görüntüleme gerçekleştirin. 15

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, iki aşamalı polimerleştirme protokolü PISA yaklaşımı (Şekil 1) kullanılarak solucan gibi miseller sentezi için kullanılır. İlk adım olarak, OEGMA polimerizasyonu daha sonraki polimerizasyon aşamasında bir stabilize edici olarak kullanılabilecek bir POEGMA makro-CTA elde gerçekleştirilir. sonuçta nanoparçacık oluşumuna yol açar etanol PBzMA çözülemediği bağlı dispersiyon koşullar altında PET RAFT polimerleşme devam eder. Polimerizasyon sırasında, başlangıçta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu görsel iletişim kuralı, sadece jel benzeri davranış başlamasını gözlemleyerek solucan gibi misellerin oluşumunu izlemek için kabiliyetini gösterir. Bu yaklaşımın faydası, diğer yöntemlere göre polimerizasyon esnasında sonsuz oluşumunu izlemek için yatmaktadır. Bu prosedür, kendi kendine bir araya POEGMA- B -PBzMA amfifilik diblok kopolimerler elde etmek üzere, iki ticari olarak temin edilebilir monomerler (OEGMA ve BzMA) 'in bir, iki aşamalı polimerizasyonunun uygulandığı gerçekleştirilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

CB, Avustralya Araştırma Konseyi (ARC-FT12010096) ve UNSW Avustralya'dan Gelecek Bursu için minnettardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-Siyano-4-
(fenilkarbonotiyoyltio)pentanoik asit (CPADB)		Sigma-Aldrich722995-5G
Oligo(etilen glikol) metil eter metakrilat (OEGMA)Sigma-Aldrich447935-500MLOrtalama Mn 300, 100  içerir; inhibitör olarak ppm MEHQ, 300 & nbsp; inhibitör olarak ppm BHT
2,2 & prime;-Azobis (2-metilpropionitril) (AIBN)Sigma-Aldrich
Ru (bpy) < sub>3< / sub>Cl < sub > 2 < / sub>.6H < sub>2< / sub>OSigma-Aldrich544981-1G
Benzil metakrilat (BzMA)Sigma-Aldrich409448-1Lİnhibitör olarak monometil eter hidrokinon içerir
Alüminyum oksit ( Temel)Chem-Supply Pty Ltd AvustralyaAL08371000
%95 Etanol (EtOH)Sucrogen Bio Ethanol80889
Asetonitril (MeCN)Chem-Supply Pty Ltd AvustralyaRP1005-G2.5L
Tetrahidrofuran (THF)Chem-Supply Pty Ltd AvustralyaTA011-2.5L
Petrol Ruhları (40-60 < ° C)Chem-Supply Pty Ltd AvustralyaPA044-2.5L
DietilEter Chem-Supply Pty Ltd AvustralyaEA0362.5L
Dimetilasetamid (DMAc)VWR International AustraliaALFA22916. M1GPC analizi için
Pasteur pipetleri (230  mm)Labtek355.050.503
Cam beherlerLabtek025.01.902 (2L) / 2110654 (1L)2 & L beher, dairesel reaktörü oluşturmak için LED şeritleri takmak içindir
Ticari LED şeritEcoLabn/aλ = 460 nm, 4,8 W/m
4 ml Cam ŞişelerLabtekAPC502214B
0,9 ml Kuvars KüvetStarna Scientific Ltd21/Q/2
İğne (0,8 mm x 38  mm)Beckton Dickson302017Oksijensizleştirme reaksiyonları için
İğne (0,8 mm x 120  mm)B Braun Türkiye4665643Oksijensizleştirme reaksiyonları için
Kol durdurucu septa (kauçuk septum)Sigma-Aldrichz564680/z564702
Karıştırma ocaklarıVWR International Australia/In Vitro Technologies97018-488/RADRR91200
Vorteks karıştırıcıVWR International Australia412-0098
Vakumlu fırınIn Vitro TeknolojilerMEMVO200

Kaynaklar

  1. Yu, Y., Eisenberg, A. Control of Morphology through Polymer−Solvent Interactions in Crew-Cut Aggregates of Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 119 (35), 8383-8384 (1997).
  2. Zhang, L., Eisenberg, A. Thermodynamic vs Kinetic Aspects in the Formation and Morphological Transitions of Crew-Cut Aggregates Produced by Self-Assembly of Polystyrene-b-poly(acrylic acid) Block Copolymers in Dilute Solution. Macromolecules. 32 (7), 2239-2249 (1999).
  3. Zhang, L., Eisenberg, A. Multiple Morphologies of 'Crew-Cut' Aggregates of Polystyrene-b-poly(acrylic acid) Block Copolymers. Science. 268 (5218), 1728-1731 (1995).
  4. Yu, K., Zhang, L., Eisenberg, A. Novel Morphologies of "Crew-Cut" Aggregates of Amphiphilic Diblock Copolymers in Dilute Solution. Langmuir. 12 (25), 5980-5984 (1996).
  5. Blanazs, A., Ryan, A. J., Armes, S. P. Predictive Phase Diagrams for RAFT Aqueous Dispersion Polymerization: Effect of Block Copolymer Composition, Molecular Weight, and Copolymer Concentration. Macromolecules. 45 (12), 5099-5107 (2012).
  6. Ladmiral, V., Semsarilar, M., Canton, I., Armes, S. P. Polymerization-induced self-assembly of galactose-functionalized biocompatible diblock copolymers for intracellular delivery. J. Am. Chem. Soc. 135 (36), 13574-13581 (2013).
  7. Sugihara, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Ryan, A. J., Lewis, A. L. Aqueous Dispersion Polymerization: A New Paradigm for in Situ Block Copolymer Self-Assembly in Concentrated Solution. J. Am. Chem. Soc. 133 (39), 15707-15713 (2011).
  8. Wan, W. M., Hong, C. Y., Pan, C. Y. One-pot synthesis of nanomaterials via RAFT polymerization induced self-assembly and morphology transition. Chem. Comm. (39), 5883-5885 (2009).
  9. Semsarilar, M., Jones, E. R., Blanazs, A., Armes, S. P. Efficient Synthesis of Sterically-Stabilized Nano-Objects via RAFT Dispersion Polymerization of Benzyl Methacrylate in Alcoholic Media. Adv. Mater. 24 (25), 3378-3382 (2012).
  10. Karagoz, B., et al. Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA) - control over the morphology of nanoparticles for drug delivery applications. Polym. Chem. 5 (2), 350-355 (2014).
  11. Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nat Nano. 2 (4), 249-255 (2007).
  12. Blanazs, A., et al. Sterilizable gels from thermoresponsive block copolymer worms. J. Am. Chem. Soc. 134 (23), 9741-9748 (2012).
  13. Pei, Y., Thurairajah, L., Sugita, O. R., Lowe, A. B. RAFT Dispersion Polymerization in Nonpolar Media: Polymerization of 3-Phenylpropyl Methacrylate in n-Tetradecane with Poly(stearyl methacrylate) Homopolymers as Macro Chain Transfer Agents. Macromolecules. 48 (1), 236-244 (2015).
  14. Fielding, L. A., Lane, J. A., Derry, M. J., Mykhaylyk, O. O., Armes, S. P. Thermo-responsive Diblock Copolymer Worm Gels in Non-polar Solvents. J. Am. Chem. Soc. 136 (15), 5790-5798 (2014).
  15. Yeow, J., Xu, J., Boyer, C. Polymerization-Induced Self-Assembly Using Visible Light Mediated Photoinduced Electron Transfer-Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization. ACS Macro Lett. 4 (9), 984-990 (2015).
  16. Xu, J., Jung, K., Corrigan, N. A., Boyer, C. Aqueous photoinduced living/controlled polymerization: tailoring for bioconjugation. Chem. Sci. 5 (9), 3568-3575 (2014).
  17. Pei, Y., et al. RAFT dispersion polymerization of 3-phenylpropyl methacrylate with poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] macro-CTAs in ethanol and associated thermoreversible polymorphism. Soft Matter. 10 (31), 5787-5796 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

G r n r I k PolimerizasyonuPET RAFTPolimerizasyon Kaynakl Kendi Kendine D zenlenmeRAFT PolimerizasyonuBlok Kopolimer SenteziNanopar ac k MorfolojisiJelle me zleme
Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.