Yöntem makalesi

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

10K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54276

⸱

25 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Özet

araştırma, hastalık modelleme, farmasötik ve klinik uygulamalar için insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) yararını en üst düzeye çıkarma kardiyomiyositlerde dahil fonksiyonel hücre tipleri, büyük ölçekli üretim için güçlü bir yöntem gerektirir. Burada WNT, TGF-p, ve SHH'nin zamansal manipülasyon sinyal yolları statik asma ve karıştırılan süspansiyon, biyoreaktör sistemleri hem de tek bir hücrenin yüksek verimli kardiyomiyosit farklılaşma geçişli hPSC hatları yol açtığını göstermektedir. Bu stratejiyi kullanarak sürekli olarak çok sayıda hPSC çizgilerle doğrulanmış kültür 15 gün sonra> 80% cTnT'nin-pozitif hücrelerin, içeren, ~% 100 dayak parçacıklarının ile sonuçlanmıştır. Biz de şu anda 42 hPSC hatlarında doğrulandı başarı olan tek hücre pasajlarının, adapte olmayan hücre hatları ile kullanım için bu protokolün bir varyasyonu sunuldu. Bu protokolleri kullanılarak oluşturulan kardiyomiyositlerde soy-spesifik belirteçleri ve gösteri beklenen electrophys ifademalarla işlevleri. Bizim protokol insan kardiyomiyositlerde büyük ölçekli üretim için, basit, verimli ve sağlam bir platform sunuyor.

Giriş

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreler (hPSCs), üç embriyonik germ 1,2 hücrelerine ayırt etmek için kendini yenileme ve kapasite yeteneği var. Bu özelliklerinden dolayı, hPSCs klinik uygulamalar 8 için potansiyel yüksek verimli ilaç tarama ve toksisite deneyleri 6,7 insan hastalık 3-5, modellemek için hastalık ilgili hücre tiplerinin üretimi ve ölçeklenebilir üretim için değerli ve sınırsız kaynağı sağlamak ve . hPSCs gelen kardiyomiyositlerinin nesil nedeniyle ilgili hayvan modellerinin olmaması ve / veya etkilenen birincil dokuların durumu özellikle daha önce bizim yetenekleri kapsamı dışındadır karmaşık insan kalp ve damar hastalıkları mekanizmaları ve bunların olası tedaviler, araştırmak için fırsat sağlar.

hPSCs n yukarıda belirtilen tüm uygulamalarzenginleştirilmiş ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde ve çok sayıda üretim ecessitate. Böylece, kullanılabilirlik önemli çoklu hPSC hatları için, verimli, tekrarlanabilir ve uygun in vitro kalp farklılaşma protokolde ölçeklenebilir bir. Konvansiyonel kardiyomiyosit farklılaşma protokolleri gibi sitokinler 11 ve protein transdüksiyon yöntemleri 12 kokteyl ile embriyoid vücut oluşumu 9, ko-kültür teknikleri 10, indüksiyon gibi farklı stratejiler istihdam var. Bu tekniklerin içinde ilerlemelere rağmen, çoğu hala, yoksul verimlilik muzdarip pahalı büyüme faktörlerini gerektiren veya birden fazla hPSC hatlarını kullanmaya çalışırken sınırlı evrenselliğini sunuyoruz. Bugüne kadar, bu zorluklar hayvan modellerinde hücre tedavisi çalışmaları için hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerinin üretimine sınırlarını yanı sıra ilaç keşfi 13 ilaç endüstrisi belirledik. Bu nedenle, büyük için sağlam ve uygun fiyatlı tekniklerin geliştirilmesiölçeklenebilir kültür sistemlerinde fonksiyonel hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerinin ölçeğindeki üretim büyük ölçüde ticari ve klinik uygulamaları kolaylaştıracaktır.

Bu yazıda, yüksek büyük ölçekli üretimi için bir yöntem de dahil olmak üzere kaynak ve kültür yöntemleri, çeşitli oluşturulan HESC ve hiPSCs yüksek etkinlik, tekrar üretilebilirlik ve uygulanabilirliği olan bir düşük maliyetli ve entegre kalp farklılaşma sisteminin gelişimi sunulmuştur bir biyoreaktör kullanılarak hPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde zenginleştirilmiş popülasyonları. Buna ek olarak, bu tür yeni kurulan hiPSCs veya hastalık mekanizmasının analizi ile ilgili hPSC hatlarının büyük bir kohort serbest ve / veya tek bir hücre kültürü besleyici üzere uyarlanmış olup hPSC hatları, bu protokol optimize ettik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kültür ortamları, ayrım hPSCs Hücre kültür levhaları, kaplanması ve Bakım hazırlanması 1.

  1. Medya Hazırlık
    Not: 4 hafta süreyle ışıktan korunmuştur, 4 ° C de 0.22 mikron süzme cihazı ve mağaza kullanarak ortam sterilize edin. Reaktif isimleri, tedarikçiler ve katalog numaraları Malzeme tabloda listelenmiştir.
    1. Fare embriyonik fibroblastlar (MEF) Orta için 445 ml DMEM, 50 ml cenin sığır serumu (FBS) ve 5 ml hücre kültür ortamı (örneğin, glutamax) ile birleştirir.
    2. HESC Ortama için, 390 mi Nakavt DMEM (KO-DMEM), 100 mi nakavt Serum Replacement (KO-SR) 5 ml hücre kültür ortamı, 5 mi MEM minimum temel amino asitler çözeltisi ve 0.5 mi 55 mM β-merkaptoetanol birleştirir.
      DİKKAT: β-merkaptoetanol toksiktir. inhalasyon, yutulması ve deri ile temasından kaçının.
    3. RPMI-B27 (RB) Orta için 475 ml RPMI 1640 birleştirmek, 10 ml B27 eksiinsülin, 5 mi hücre kültür ortamı, 5 mi MEM minimum temel amino asitler çözelti 5 ml penisilin / streptomisin ve 0.5 ml 55 mM β-merkaptoetanol.
    4. Ayrışma çözeltisi (DS) için, 10 mi,% 0.05 tripsin, 4 mi KO-SR, 1 mi kolajenaz tip IV (1 mg / ml), 5 mi KO-DMEM ve 20 ul CaCl2 (1 M) bir araya getirir.
    5. Besleyici hücre koşullu ortam için bir T75 kabına (bFGF olmadan) 15 mi HESC orta ekleyin con fl uent önce ya mitomisin C veya ışıma yoluyla işlenerek inaktive edilmiş besleyici hücreler (fibroblastlarından MEF veya insan). Hasat 24 saat sonra orta klimalı ve taze hESC orta ile değiştirin. Hücreler, 2 hafta için kullanılabilir.
  2. Hücre kültür levhaları, kaplanması
    1. ECM Jel Kaplama:
      1. üreticinin talimatlarına göre, bir eşit kıvamlı sıvı durumuna gelene kadar satın alma üzerine, 4 ° C'de ECM jel özü Çözülme. oranında seyreltin-20 ° C'de soğuk bir KO-DMEM ortamı, tablet ve deposunda 2: 1.
        Not: ECM jel hazırlanması sırasında, aliquotting ve kaplama işlemi soğuk kullanım için gerekli olan tüm maddeleri tutar. ECM jel konsantrasyonu parti numarası ile değişir. konsantrasyon alikotları belirtildiği olduğundan emin olun. Alikotlar en fazla 6 ay süreyle -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      2. 4 ° C'de bir ECM jeli kısım çözülme. eritildiğinde, 0.34 mg / ml'lik bir son konsantrasyona soğuk KO-DMEM ortamı ilave edin. Pipet de ve 6 oyuklu plakanın bir oyuk başına 0.75 ml ekleyin. 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
    2. Mitoz İnaktif Fare Embriyonik fibroblast Besleyici Hücre (MEF) Kaplama
      Not:. MEF besleyici hücrelerin hazırlanması daha önce tarif edilmiş 14
      1. Kat Bağlanma Faktörü (AF) ya da 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 jelatin (adım 1.2.3) (6-çukurlu plakanın bir oyuk başına 0.75 mi) ile bir 6-yuvalı hücre kültürü plakasının.Çıkarın ve kuruması için biyogüvenlik kabini (BSC) plaka bırakın.
      2. 3 dakika - yaklaşık 2 için bir 37 ° C su banyosu için dondurulmuş şişesinden aktarılarak MEF çözülme.
      3. 15 ml'lik bir tüpe 7 mL MEF orta ekleyin. hücre şişe eritilir, bunu yavaş yavaş 15 ml tüp içeriğini aktarın. 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve MEF ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon.
      4. Hücreleri saymak ve 6 plaka (~ 1.7 x 10 5 hücre / kuyu) başına 1 × 10 6 hücre plaka. 37 ° C /% 5 CO2 inkübatöründe transfer ve hücreler, O / N kullanımdan önce eklemesini sağlar.
    3. Jelatin Kaplama:
      1. çözeltisi (ağ / hac)% 0.1 yapmak için, aşırı saf su içinde jelatin tozu, 1 g çözündürülür. daha sonra 15 dakika boyunca 121 ° C'da, çözelti otoklava, 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Soğuduktan sonra, kuyu gereken sayıda (6 çukurlu bir levhanın bir oyuk başına 0.75 mi) ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
        Not: Geri kalan% 0.1 jelatin çözeltisi kadar 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
    4. Laminin Kaplama:
      1. çözülmüş kadar 4 ° C 'de laminin (1 mg / ml) çözülme. Laminin çözeltisi 5 ul için, soğuk PBS 1 ml. Pipet de daha sonra kuyu gereken sayıda (6 çukurlu bir levhanın bir oyuk başına 0.75 mi) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
    5. Spinner Flask İç Yüzey Silikon Kaplama:
      1. İyice herhangi bir toz ve / veya kültür kalıntılarını temizlemek için bir temizleme fırçasını kullanarak, damıtılmış su ile (1 bardak sarkaç ile) 100 ml'lik dönücü şişesi yıkayın. % 70 etanol ile ve damıtılmış su ile 30 dakika çalkalama sonrasında doldurun. 5 M NaOH ilave edin ve O / N bırakın.
      2. NaOH çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca akan su altında balon yıkayın. 1 M HCI ile balon doldurun ve 15 dakika boyunca bırakın. tam çift damıtılmış su ile iki kez daha sonra 5 dakika için su ile balon yıkayınHCl herhangi bir iz çıkarın. BSC tamamen kuruması için şişeyi bırakın.
      3. şişeye silikonlaştırma çözeltisi 1.5 ml ekleyin ve tüm yüzeyleri kapsayacak şekilde yatay olarak döndürün. Cam sarkaç için aynı işlemi tekrarlayın.
      4. 1 saat süre ile, 100 ° C 'de kuru bir fırın içinde kaplanmış balon ısı ya da oda sıcaklığında O / N kurutun. 60 dakika - bir fırın içinde ısıtılmıştır durumunda, 30, oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
      5. 15 dakika için her şişe, deiyonize su ile 3 kez yıkayın daha sonra 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavda sterilize edilir.
  3. Ayrım hPSCs Bakım
    Not:     özel olarak belirtilmedikçe, burada açıklanan protokollerin hücreler büyütülmüş ve 6 oyuklu kültür plakaları ve hacim oyuklarında kültürlenir bu biçimi için uygun verilecektir.
    1. Statik Süspansiyon Sistemde ayrım yapılmamış sferoidler olarak Kültür hPSCs
      Not: Bu adımda kullanılan hücreler zaten adapte edilmelidirtek hücre kültürü. 15
      1. % 80 konfluent - hPSCs yaklaşık 6 oyuklu bir kültür plakasına ECM jeli üzerinde 70 kültürlenir deneyi başlatın. BSC Stereomikroskopta kullanarak herhangi bir farklılaşmış koloniler çıkarın. 10 uM ROCK önleyicisi Y-27632 ekleyin ve 1 saat 37 ° C'de inkübe edin.
        Not: farklılaşmış koloniler çıkarmak için, ayırmak için bir pipet kullanın ve nazikçe stereomikroskop altında elle tüm farklılaşmış parçaları kaldırmak. farklılaşmamış koloniler kaldırmak için dikkatli olun.
      2. kuvöz ve aspirat ortamından hücreleri çıkarmak. PBS, kaldırma ve 0.5 ml hücre ayrışma enziminin eklenmesine ml 1 hücreleri yıkayın. 37 ° C'de 5 dakika - 4 hücreleri inkübe edin.
      3. 1 ml HESC orta ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat. Bir p1,000 pipet kullanarak tek bir hücre içine hücreleri ayırmak. Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak.
      4. 2 × 10 5 canlı c süspanse edin hücreleriBesleyici-hücre koşullu ortam içinde arşın / ml, 100 ng / ml bFGF ve 10 uM ROCK inhibitörü Y-27632 ile takviye edilmiştir. 5 ml'lik bir pipet (6-çukurlu levha başına 3 mi) kullanılarak ultra-düşük tespit kalıpları hücreleri aktarın.
      5. 2 gün sonra, dikkatli bir şekilde ortamında (yaklaşık olarak 1.5 mi) kuluçka ve aspirat yarı hücreleri çıkarmak. 100 ng / ml bFGF ile desteklenmiş taze uygulanmış madde ile değiştirin.
      6. 5. günde Şimdi kadar 100 ng / ml bFGF ile takviye kıvamlandırılmış ortam, ya daha başka kültür hücreleri, sürekli ayrışmamış kültür kanalı (aşama 1.3.1.2 - 5) her gün ortamın yarısı değiştirme ya da kardiyak farklılaşma (Bölüm 2 için kullanımı ). devam eden kültür varsa, geçiş hücreleri her 4-8 gün.
    2. besleyici hücreler kültürlenmekte ve kollajenaz tip IV kullanılarak pasaj hPSCs
      1. hPSCs Pasajlanması önce, BSC stereomikroskopta kullanarak herhangi bir farklılaşmış koloniler kaldırın. orta aspire ve 1 ml yıkama hücrelerioyuk başına PBS ile yıkandı. Daha sonra 0.75 ml kolajenaz tip IV (1 mg / ml) ekleyin ve 5 37 ° C'de inkübe çıkarın - kalkmasına başlayan koloni kenarlara sahip için gereken, 15 dakika.
      2. Aspire kolajenaz ve oyuk başına HESC ortamının 1 ml. Daha sonra 15 ml tüp içine p1,000 pipet kullanarak hücreleri transferi, bir hücre kazıyıcı kullanarak küçük kümelere koloniler ayırın. Küçük parçalar halinde kümeleri kırmak için dikkatli olun.
      3. kalan hücrelerin toplanması ve 15 ml'lik bir tüp eklemek de 1 mi HESC orta yıkayın. 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüjleyin. 100 ng / ml bFGF ile takviye edilmiş ortam içinde HESC süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
      4. inkübatör bir MEF kaplı plakasını çıkarın ve MEF orta aspire. uygun olarak, 3 ve 1:10: 1 arasında bir oranda hücre transfer edin. 100 ng / ml bFGF ile desteklenmiş taze hESC orta orta günlük değiştirin. Passage hücreleri her 4-8 gün.

2. differentiStatik Süspansiyon Sistemde sferoidler olarak hPSCs arasında tirme

  1. Bölüm 1.3.1 gibi hazırlanan GÜN 5 farklılaşmamış parçacıklarının kullanarak deney başlatın.
    Not: Bu aşamada, parçacıklarının ortalama büyüklüğü 175 ± 25 um olmalıdır. farklılaşma, deney başlamadan 50 ila parçacıklarının en az kullanılmalıdır.
  2. Transfer 5 ml pipet kullanarak 15 ml'lik bir tüp içine küremsilerin. Kalan parçacıklarının toplamak ve aynı 15 ml tüp eklemek için iyi 1 ml RB orta yıkayın. sferoidler gevşek bir pelet (santrifüj YAPMAYIN) oluşturmak için tortulaşmış kadar 5 dakika boyunca hücreleri bırakın. herhangi parçacıklarının almak için dikkatli olmak, süpernatant aspire.
  3. 3 ml 12 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş RB orta ekleyin. Lütfen 6 oyuklu ultra düşük bağlanma levhasının bir kuyuya hücreleri aktarın. 24 saat sonra, adım 2.2 tekrarlayın.
    Not: RB orta duyarlı ışıktır. RB orta ile çalışırken, BSC ışığı kapalı tutun.
  4. biraa 3 mi hücre pelletine RB araç. Lütfen 6 oyuklu ultra düşük bağlanma levhasının bir kuyuya hücreleri aktarın. 24 saat sonra, adım 2.2 tekrarlayın.
  5. (5 uM her biri) IWP2, purmorphamine ve SB431542 ile desteklenmiş 3 mi RB orta ekleyin. Lütfen 6 oyuklu ultra düşük bağlanma levhasının bir kuyuya hücreleri aktarın. 2 gün sonra adım 2.2 tekrarlayın.
  6. Hücreler takmak için izin vermek için bir jelatin kaplı plakaya RB orta ve transferi, 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
    Not: Bu aşamada hücreler, süspansiyon içinde muhafaza edilebilir. Statik süspansiyon kültürü ile devam ultra-düşük eki plaka geri hücreleri transferi için.
  7. 2 gün sonra 3 ml RB ortam ile orta değiştirin. kültürler ertesi gün yenmek için başlayacaktır. RB ortam ile 4 gün - ORTA her 3 değiştirin.

içinde karıştırılmış bir Biyo-reaktördeki sferoidler olarak hPSCs 3. Farklılaşma

  1. farklılaşmamış spheroids kültürü ile denemeyi başlatmaken az 3 geçişleri için statik süspansiyonda d (Bölüm 1.3.1 bakınız). 10 uM ROCK önleyicisi Y-27632 ekleyin ve 1 saat 37 ° C'de inkübe edin.
  2. inkübatör hücreleri çıkarın ve 5 ml'lik bir pipet kullanılarak 15 ml tüp içine tüm parçacıklarının aktarın. Kalan parçacıklarının toplanması ve aynı 15 ml tüp eklemek de 1 mi HESC orta yıkayın. sferoidler gevşek bir pelet (santrifüj YAPMAYIN) oluşturmak için tortulaşmış kadar 5 dakika boyunca hücreleri bırakın. herhangi parçacıklarının almak için dikkatli olmak, süpernatant aspire.
  3. 1 ml PBS ilave edilerek hücreler yıkanır. sferoidler gevşek bir pelet (santrifüj YAPMAYIN) oluşturmak için tortulaşmış kadar 5 dakika bekletin. Süpernatantı ve 0.5 ml% 0.05 tripsin artı 0.53 mM EDTA ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika - 4 hücreleri inkübe edin.
  4. inkübatör hücreleri çıkarın ve 1 ml HESC orta ekleyin. Bir p1,000 pipet kullanarak, Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı, tek hücre içine hücreleri ayırmak. 2 × 10 5 viab için tekrar süspansiyonkıvamlandırılmış ortam içinde Le hücre / ml, 100 ng / ml bFGF ve 10 uM ROCK inhibitörü Y-27632 ile takviye edilmiştir.
  5. 1 sarkaç ile silikonlu biyoreaktör balona hücre süspansiyonu 100 ml aktarın (Bölüm 1.2.5 bakınız). 35 rpm'de çalkalanarak 40 rpm'de 24 saat artıştan sonra başlayın.
  6. Tüm sferoidler şişenin altına yerleşen kadar, 10 dakika - 48 saat sonra, 5, ajitasyon dur. 100 ng / ml bFGF ile takviye kıvamlandırılmış ortamı ile orta yarısı değiştirin. 5 gün kadar aynı işlemi, her 24 saat tekrarlayın.
    Not: Bu aşamada, 175 ± 25 um arasında bir ortalama boyuta sahip farklılaşmamış sferoidler oluşturulmalıdır.
  7. tüm Sferoidler şişenin dibine çökene kadar 10 dakika - 5 için ajitasyon durdurun. ortam (az 50 mi) içindeki bir minimum miktarda 50 ml'lik bir tüp tüm parçacıklarının aktarın. dikkatli hiçbir Sferoidler kabında kalan garanti altına alarak, biyoreaktör balonuna kalan orta atın.
  8. leave 5 için - tüm sferoidler 50 ml tüp dibinde yerleşmiş kadar 10 dakika sonra dikkatlice gevşek hücre pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. Tüm sferoidler daha gevşek bir topak oluşturmak için 50 ml tüp altındaki çökene kadar, 10 dakika - sonra 5 tekrar terk, kalsiyum ve magnezyum ya da RB ortam ile 25 ml PBS ile yıkayın.
  9. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 40 mL 12 uM CHIR99021, 10 uM kaya inhibitörü ve% 0.1 polivinil alkol (PVA) ile takviye edilmiş RB orta ekleyin. parçacıklarının tekrar süspansiyon ve biyoreaktör balona geri tüm hücreleri aktarın. toplam hacmi 100 ml yapmak için orta ekleyin. 24 saat boyunca 40 rpm'de çalkalama başlatın.
    Not: RB orta duyarlı ışıktır. ışık BSC tutmak RB orta çalışırken modunu kapalı.
  10. Tekrarlayın 3.7 Basamaklar - 3.8.
  11. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve orta% 0.1 PVA ile desteklenmiş 40 ml RB ekleyin. parçacıklarının tekrar süspansiyon ve t geri tüm hücreleri transferiO şişesi Biyoreaktör. toplam hacmi 100 ml yapmak için orta ekleyin. 24 saat boyunca 40 rpm'de çalkalama başlatın.
  12. Tekrarlayın 3.7 Basamaklar - 3.8.
  13. Dikkatle (5 mcM her biri) süpernatant kaldırmak ve 40 ml IWP2, purmorphamine ve SB431542 ile desteklenmiş RB orta ekleyin. parçacıklarının tekrar süspansiyon ve biyoreaktör balona geri tüm hücreleri aktarın. toplam hacmi 100 ml yapmak için orta ekleyin. 2 gün boyunca 40 rpm'de çalkalama başlatın.
  14. Yineleyin 3.7-3.8 adımları tekrarlayın.
  15. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 40 ml RB orta sadece ekleyin. parçacıklarının tekrar süspansiyon ve biyoreaktör balona geri tüm hücreleri aktarın. toplam hacmi 100 ml yapmak için orta ekleyin. 40 rpm'de çalkalama başlatın. 72 saat sonra - Dayak sferoidler 48 uyulmalıdır.
  16. tüm Sferoidler kabın dibine çökene kadar 10 dakika - sadece 5 için ajitasyon durdurarak 4 gün RB orta - her 3 orta yarısı değiştirin. Dikkatle sferoidler ve Dikkatli bozmadan ortamı 50 ml kaldırmaUlly taze RB ortamı 50 ml ile değiştirin.

Kültür Kullanımının hPSCs 4. Farklılaşma Tek hücre pasajlarının Uyarlanmış değil

Not: Bu yaklaşım tek hücre kültürü teknikleri, aşırı derecede emek yoğun ve zaman alıcı bir işlem uyum kalmadan hPSC hatları sayısının yüksek hızlı farklılaşması için özellikle yararlıdır. Bu teknik, yeni kurulan hPSC hatları gibi enzimatik hücre ayrılma son derece duyarlı olan hücre hatları, için de geçerlidir.

  1. % 80 birleşen - yaklaşık 70 olan (Bölüm 1.3.2 gibi) MEF kültüre hPSCs ile deneme başlayın. BSC Stereomikroskopta kullanarak herhangi bir farklılaşmış koloniler çıkarın.
  2. orta çıkarın ve 0.5 ml ayrışma Çözüm (DS) ekleyin. MEF hücreleri yuvarlanır ve hPSCs kolonilerinin kenarları açık olana kadar 1 dakika - 0.5 inkübe. Çabuk DS çıkarın ve 0.75 mL kolajenaz tip IV (1 mg / ml) ekleyin.
  3. tasarlamak37 ° C'de 15 dakika - için 5 hücreleri. Bütün koloniler kaldırın ve ayırmak, kaldırmak kollajenaz ve 1.5 ml HESC orta eklemek için ne zaman başlıyor kuluçka döneminde mikroskop altında hücrelerin kontrol edin ve.
    Not: 15 dakika kolonilerinin çoğu hala bağlı sonra, inkübatör geri hücreleri koyarsanız. mikroskop her 5 dk altında hücreleri kontrol edin. fazla 30 dakika boyunca kollajenaz hücreleri bırakmamaya özen gösterin. kollajenaz çözüm birçok yüzen koloniler varsa, kollajenaz çıkarmayın; sadece 1 mi HESC orta ekleyin.
  4. Bir p1,000 pipet kullanarak, yavaşça koloniler bütün koloniler ayırmak için pipetle. Küçük parçalar halinde koloniler bozmayın. 5 ml'lik bir pipet kullanılarak 15 ml tüp içine hücreleri aktarın. aynı tüp eklemek için kalan hücreleri toplamak için 1 ml HESC ortamı ile kuyu yıkayın. Tüm koloniler (santrifüj YAPMAYIN) tortulaşmış kadar 5 dakika bekletin.
  5. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 2 ml HESC medi eklemekum, 100 ng / ml bFGF ile takviye edilmiştir. 5 ml pipet (24 oyuklu plakanın her bir 1 ml ve 6 oyuklu plakanın her oyuğuna 3 mi) kullanılarak, bir ultra-düşük bağlanma plakası içine hücreleri aktarın. En az 6 saat (12 saat) maksimum 37 ° C /% 5 CO2 inkübe edin.
  6. Bu süre boyunca, aşama 4.7 laminin kaplı oyuklar / levha gerekli sayıda hazırlar. Tavsiye edilen hücre transferi oranı, 24 oyuklu plaka (veya yüzey alanı başına eşdeğer miktarda) 2 oyuklara 6-plaka 1 konfluent da vardır.
  7. 6 saat sonra, dikkatli bir şekilde 5 ml pipet kullanarak 15 ml'lik bir tüp içine koloni agrega aktarın. Kalan agrega toplamak ve aynı 15 ml'lik bir tüp (24 oyuk için oyuk başına 0.5 mi, 6-çukurlu levhalar için oyuk başına 1 mi) eklemek RB orta plaka yıkanır. sonra dikkatlice süpernatant aspire, agrega sediment kadar 5 dakika bekleyin. gevşek pelet rahatsız etmemek için dikkatli olun.
  8. 2 mi RB ortamı 12 uM CHIR99021 ile takviye edilmiş ve dikkatli bir şekilde transferi ekleyin(Bölüm 1.2.4 gibi) önceden hazırlanmış laminin kaplı çukurlara 5 ml pipet ile hücreleri takmak için izin vermek.
  9. 24 saat sonra, dikkatli bir şekilde her bir hazne içinde orta kaldırmak ve 1 ml RB orta yalnızca ekleyin.
    Not: agrega bazıları sadece kültür plakasına çok zayıf bağlı olacak; Bu nedenle orta değişim işlemi sırasında gevşek gelmiş olabilir herhangi bir büyük agrega kaldırmak değil önemlidir. Önemli olan, ancak, mümkün olduğu kadar küçük hücre kalıntılarının kadar kaldırın.
  10. 24 saat sonra, dikkatli bir şekilde (5 uM her biri) orta kaldırmak ve IWP2, purmorphamine ve SB431542 ile takviye edilmiş RB orta ekleyin.
  11. RB ortamı sadece 2 gün sonra orta değiştirin. Hücreler ertesi gün yenmek için başlayacaktır.
  12. RB ortamı yalnızca 4 gün - her 3 orta değiştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

HPSCs gelen kardiyomiyositlerde büyük ölçekli farklılaşması için basit bir yöntem kurma amacıyla, 16 ve daha sonra WNT önleyicileri olan hücreler, bir Wnt / β-katenin aktivatörü (CHIR99021) başlangıçta tedavi edildiği bir protokol oluşturulur / β- katenin ve transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β) yolları (IWP2 16 ve SB431542 17 sırasıyla) ve sonik dikenli protein (Shh) yolunun (purmorphamine) son olarak bir aktivatör 17 (Şekil 1A).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

hPSCs türetilen kardiyomiyositlerinin, gelecekte, rejeneratif tedaviler, insan hastalığı modelleme, ilaç tarama / toksisite testinde kullanılmak üzere son derece çekici bir kaynağıdır ve. Bununla birlikte, bu hücreler kullanılarak başlıca engellerden biri, bunların etkili bir kullanım için yeterince yüksek kaliteli malzeme sağlamak yeteneğidir. Bizim açıklanan protokolü kullanarak, bu sınırlama ortadan kaldıran bir yöntem sunuyoruz.

Son zamanlarda, cardiogenesis katılan özel sinyal yolları h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Victor Chang Kalp Araştırma Enstitüsü meşgul değil, ne de araştırma için insan embriyolarının imha affetmek yok. Bu çalışmada katkısı, insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üzerinde çalışmak için sınırlı kalmıştır.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var beyan.

Teşekkürler

Bu çalışma, Royan Enstitüsü, İran Kök Hücre Araştırma ve Teknoloji Konseyi, İran Ulusal Bilim Vakfı (INSF), Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC; 354400), Avustralya Ulusal Kalp Vakfı/Heart Kids Australia (G11S5629) ve Yeni Güney Galler Kardiyovasküler Araştırma Ağı'ndan sağlanan hibelerle finanse edilmiştir. HF, Avustralya'daki New South Wales Üniversitesi'nden bir Üniversite Uluslararası Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmiştir. RPH, bir NHMRC Avustralya Bursu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu araştırmaya katılan insan deneklere şükranlarını sunarlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nakavt DMEMYaşam Teknolojileri10829018
Nakavt Serum Değişimi (KO-SR)Yaşam Teknolojileri10828028
GlutamaxYaşam Teknolojileri35050061
MEM Esansiyel Olmayan Amino AsitlerYaşam Teknolojileri11140-050
β-MerkaptoetanolYaşam Teknolojileri21985-023
Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)Miltenyi Biotec130-093-843
RPMI1640Yaşam Teknolojileri11875093
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokYaşam Teknolojileri14190144
DPBSYaşam Teknolojileri14287072
Bağlanma Faktörü (AF)Yaşam TeknolojileriS006100
ECM JelSigma-AldrichE1270
LamininInvitrogen23017-015
DMEMYaşam Teknolojileri11965-092                                                                                                                                                                                                             
Ölümcül Sığır Serumu (FBS)Yaşam Teknolojileri16140-071
B27 eksi insülinGibcoA18956-01
Penisilin / StreptomisinYaşam Teknolojileri15070063
% 0.05 Tripsin / EDTAYaşam Teknolojileri25300-054
Kollajenaz Tip IVYaşam Teknolojileri17140-019
Kalsiyum Klorür (CaCl2)Sigma-AldrichC7902
Mitomisin CBioaustralisBIA-M1183
CHIR99021Miltenyi Biotec130-104-172
IWP2Miltenyi Biotec130-105-335
SB431542Miltenyi Biotec130-095-561
PurmorfaminMiltenyi Biotec130-104-465
ROCK inhibitörü Y-27632Miltenyi Biotec130-104-169
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Poli Vinil Alkol (PVA)Sigma-Aldrich363073
JelatinSigma-AldrichG1890
Tripan MavisiBio-Rad145-0013
Accumax Yenilikçi Hücre Teknolojileri A.Ş.AM105
Sigmacote Sigma-AldrichSL2 
CELLSPINIntegra Biosciences183 001
1 sarkaçlı topaç şişesi, 100 ml Integra Biosciences182 023
Fare Embriyonik Fibroblastları (MEF)Şirket içinde hazırlanır (veya ticari olarak temin edilebilir)
İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) hatlarıŞirket içinde hazırlanır (veya ticari olarak temin edilebilir)

Kaynaklar

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577(2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kardiyomiyosit DiferansiyasyonuBiyoreakt r K lt rK k Molek l ProtokolWNT TGF beta SinyallemeKardiyak Troponin TTek H cre PasajlamaStatik S spansiyonKar t rmal S spansiyonhPSC Hatlar

İlgili makaleler