Kornea Epitel Yara İyileşmesi sırasında Isı Şoku Protein 27 Fonksiyon RNA Girişim tabanlı İncelenmesi

Özet

Burada, kornea epitel yara iyileşmesi sırasında HSP27'nin işlevini değerlendirmek için ısı şoku proteini 27'ye (HSP27) özgü küçük enterferans yapan RNA'yı kullanmak için bir protokol sunuyoruz. RNA interferansı, çeşitli hücre tiplerinde protein fonksiyonunu araştırmak için gen ekspresyonunu etkili bir şekilde yıkmak için en iyi yöntemdir.

Özet

Küçük enterferans yapan RNA (siRNA), protein kodlayan genlerin kısa süreli susturulması için en yaygın kullanılan RNA girişim yöntemleri arasındadır. siRNA, bozunmasını indüklemek için bir mRNA transkriptini spesifik olarak hedeflemek üzere oluşturulmuş sentetik bir RNA duplekstidir ve çeşitli hücresel süreçlerde yeni yolları tanımlamak için kullanılmıştır. Kornea epitel yara iyileşmesinde fosforile ısı şoku proteini 27'nin (HSP27) rolü ile ilgili az sayıda rapor bulunmaktadır. Burada, kültürlenmiş insan kornea epitel hücreleri, karıştırılmış bir kontrol-siRNA transfekte edilmiş gruba ve HSP27'ye özgü siRNA transfekte edilmiş bir gruba ayrıldı. Daha sonra çizik kaynaklı yönlü yaralama testleri, western blotlama ve akış sitometrisi yapıldı. HSP27'nin kornea epitel hücre apoptozu ve migrasyonunu içerebilecek kornea epitelyal yara iyileşmesinde rolleri olduğu sonucuna varıldı. Burada, numune hazırlama ve çalışma protokolü ile ilgili adım adım açıklamalar verilmektedir.

Giriş

Aynı anda limbusta ve kornea epitel bazal tabakadan hücreler tarafından değiştirilir ise kornea epitel hücreleri (kurulları) sürekli gözyaşı içine dökülürler. ¹ Çeşitli dışsal stres CDKÖ apoptozunu ve deskuamasyon uyarabilir. ² ısı şok proteinleri (HSPler) yüksek ölçüde korunmuş ve molekül büyüklüğüne göre iki aile ayrılabilir. ³ büyük HSP ailesi HSP90, HSP70 ve HSP60, ve daha küçük bir aile Hsp27 içerir içerir. ^4. Hsp27 fosforilasyon hücre canlılığı ile önemli bir rol oynadığı bilinmektedir çünkü aktin yeniden bu proteinin rolü hücre göçü için gereklidir. ^5-7 Bu nedenle, epitel yara iyileşmesi bir in vitro modelinde MSK göç ve apoptoz Hsp27 fosforilasyonunun potansiyel rolünü test etmek için çalışmıştır.

RNA enterferans (RNAi), küçük veya kısa müdahale RNA'lar kullanılarak (siRNA) ge sahiptirpotansiyel verir gibi hem temel ve uygulamalı biyoloji nerated ilgi, ilgi herhangi bir genin ifadesi çaldı aşağı olmak. ⁸ Burada, MSK yara iyileşmesi ve apoptoz ile Hsp27 katkısını değerlendirmek için Hsp27 özel siRNA kullanılır. hücrelerinde gen knock-down Geleneksel RNAi yöntemler siRNA'lar oluşturmak için monte edilebilir, iki modifiye edilmemiş 21-mer oligonükleotitlerin de dahil olmak üzere, sentetik RNA çiftleri kullanmak. Bu, bu çalışmada kullanılan RNAi siRNA hücreleri transfekte etmek üzere, basit ve oldukça etkili bir yöntem olup, bu reaktif, çeşitli ölümsüz hücre çizgileri ile birlikte çalışır. Bu bu çalışmada, bir çizik kaynaklı yönlü yara deneyi, batı blot, siRNA transfeksiyon deneyinde, immunfloresans yöntemi de dahil olmak üzere, bu analiz için kullanılan yöntemler, göstermek ve akım sitometri.

Protokol

1. Hücre Hattı

1. 6-çukurlu plaka içinde kültürü 10 ⁶ telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri (HCECs) bronşiyal epitel büyüme ortamı (Begm) kullanılarak% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde (yoğunluk 1039,9 hücre / ^mm2 kadar) onlar% 95 izdiham ulaşmak.

2. Western Blot Analizi Epitel Scratch yaralar oluşturma sonra

1. Streak steril 200 ul pipet konfluent kültürlü HCECs bir kuyunun yüzeyi boyunca ucu biyolojik güvenlik kabini çanak başına dört kez (Sınıf II, Tip A2) ve% 5 CO ₂ atmosfer ile 37 ° C inkübatör ayrı ayrı HCECs inkübe 1, 5, 10, 30, 60 ve 120 dakika karıştırıldı.
2. korneal epitelyal yaralama sonra inkübasyon süresine göre altı farklı numuneler için, bir 6-yuvalı plaka kullanınız.
3. 1X PBS ile yaralandı HCEC mono tabakalar üç kez yıkayın ve daha sonra her kuyuya 2.0 mi Begm ekleyin.
4. 2 kullanılarak HCECs ayırınmi,% 0.25 tripsin etilendiamintetraasetik 5 dakika boyunca oyuk başına asit (EDTA), 15 ml'lik bir tüp içinde 5 dakika için 900 x g'de santrifüj ve aspire tripsin-EDTA 1 ml pipet kullanarak.
5. PBS 1X 1 ml HCECs askıya alma ve bir 1.5 ml'lik tübe transfer edin.
6. 15 sn için 10,000 x g'de santrifüjleyin HCECs ve aspirat 1X PBS, 1 ml pipet kullanarak.
7. 100 ul buz gibi soğuk lisis tamponunda yeniden süspanse HCECs (10 mM Tris, 10 mM NaCI, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF], proteaz inhibitörleri [pepstatin A 1 uM, 1 uM löpeptin ve 0.1 uM aprotinin] ve% 0.5 Triton X-100 [pH 7]) ve iyice karıştırın.
8. Hücre lizizi uyarılması için, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
9. Santrifüj 15 dakika boyunca 10,000 x g'de 4 ° C'de lizatları, ve sonra taze 1.5 ml tüpler (90 ul tümbölenler) süpernatantlar transferi ve -80 ° C'de saklayın.
10. Bradford pr kullanılarak hücre lizatlarının toplam protein konsantrasyonunu belirlemekotein deneyi. ⁹
11. daha sonra, sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve bir% 10 ya da% 12 akrilamid jel yükle 30 ug toplam hücre proteinleri elektroforetik transferi 4 ° 'de 1 saat süre ile, bir 200 mA akım ile nitroselüloz filtreler protein bantları ayrıldı Cı Western blot deneylerinde kullanım.
12. % 5 blok nitroselüloz filtre zarları fosforilatlanmamış Hsp27 karşı birincil tavşan poliklonal antikor ekleyin, 1 saat süre ile, Tween 20 (TBST) Tris-tamponlu tuzlu su içinde yağsız süt (1: 1000 seyrelti) veya fosforile Hsp27 karşı birincil tavşan poliklonal antikoru (1 : 1,000% 5 bovin serum albümini seyreltme) (BSA) ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe membranlar.
13. TBST ile 10 dakika süre ile 3 kez yıkandıktan sonra,% 5 BSA (10,000 seyreltme 1) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan antikorları kullanılarak immünoreaktif bantlar algılar.
14. Western lekeleme luminol reaktifler membran inkübe (6-7 mOda sıcaklığında 1 dakika boyunca 5 cm'lik membran x 10 cm) başına l.
15. reaktif çözeltisinden membran kaldırmak, bir plastik levha koruyucusu aşırı emici bir havlu ile sıvı ve yer çıkarın.
16. güvenli bir ışık ile karanlık bir odada çalışan protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kaseti kaplı membran yerleştirin.
17. zarın üzerine X-ışını filmi yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır.

3. siRNA Transfeksiyon Deneyi ¹⁰

1. Kültür 5 x 10 ⁵ hücre HCECs / oyuk bunlar% 95 izdiham ulaşana kadar Begm kullanılarak% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu plaka.
2. 10 ya da 50 nM oluşturmak için azaltılmış serum orta transfeksiyon (seyreltme faktörü 41 veya 14.3 idi) için 100 ul azaltılmış serum orta transfeksiyon ayıracı (2.5 veya 7.5 ul) sulandırmak ve Hsp27 özel çözülür ve 100 ul kontrol siRNA şifreli Hsp27 özgü ve kontrol siRNA şifreli.
3. 100 mikron Mix100 ul seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile l siRNA çözeltisi (1: 1 oranında) ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe karışımı.
4. hücrelere siRNA lipid kompleksleri ekleyin. Daha sonra 4 saat değiştirme ortamı sonra 37 ° C'de 2 gün boyunca hücrelerle Begm doldurup kuluçkalanması.
5. 4.7 bölümler 4.1 altında tarif edildiği gibi, western blotting ile transfekte edilmiş hücrelerin analiz.

SiRNA transfekte hücreleri ¹¹ 4. Batı Benek tahlili

1. Hsp27 özgü ekstrakte ve 100 ul buz gibi soğuk lisis tamponu (10 mM Tris, 10 mM NaCI, 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabini kontrol siRNA transfekte HCECs karıştırılmış _4, 1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), proteaz inhibitörleri, ve% 0.5 Triton X-100, pH 7).
2. Hücre lizizi uyarılması için, buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
3. 10,000 x g'de Pelet lizatları, 15 dakika ve daha sonra da yeni bir 1.5 ml'lik küvet süpernatantlar aktarmakes (90 ul alikotları) ve -80 ° C'de saklayın.
4. Bradford protein deneyi kullanılarak hücre lizatlarının protein konsantrasyonlarını belirlemek. ⁹
5. % 10 ya da% 12 akrilamid jel üzerinde toplam hücre Proteinlerin eşit miktarları ile Numuneleri, SDS-PAGE jelin maruz ve elektroforetik olarak 4 ° C 'de, 1 saat boyunca 200 mA akım ile nitroselüloz filtrelerine Ayrılan protein bantları aktarmak Western blot deneylerinde kullanımı.
6. : (1000 sulandırma 1): (1000 sulandırma 1), fosforilatlanmış Akt% 5 blok nitroselüloz filtre zarları fosforillenmiş ve fosforilatlanmamış Hsp27 karşı birincil antikor ekleyin, 1 saat süre ile, Tween 20 (TBST) Tris-tamponlu tuzlu su içinde yağsız süt Akt fosforilatlanmamış (1: 1000 seyreltme, bir hücrelerin hayatta kalma belirteci olarak kullanılır) Bcl-2 ile ilişkili X proteini (1: 1000 seyreltme, bir pro-apoptotik protein olarak kullanılır) ve gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH 1; :% 5 büyükbaş hayvan serumu albümini bir yükleme kontrolü olarak kullanılan 200 seyreltme) (BSA) vebir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe membranlar.
7. yıkamadan sonra TBST ile 3 kez 10 dakika her yıkama% 5 BSA (10,000 seyreltme 1) yabanturpu peroksidaz-konjuge keçi anti-tavşan antikorları kullanılarak immünoreaktif bantlar algılar.
8. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca Western lekeleme luminol reaktifler membran (6-7 mi başına 10 cm x 5 cm zarı) inkübe edin.
9. reaktif çözeltisinden membran kaldırmak, bir plastik levha koruyucusu aşırı emici bir havlu ile sıvı ve yer çıkarın.
10. güvenli bir ışık ile karanlık bir odada çalışan protein tarafı yukarı bakacak şekilde bir film kaseti kaplı membran yerleştirin.
11. zarın üzerine X-ışını filmi yerleştirin ve 1 dakika boyunca maruz kalmaktadır.

5. Scratch kaynaklı Hücre Göç ¹² Yönlü Yaralama Deneyi Değerlendirilmesi

1. Bir biyolojik güvenlik kabini, bir birleşik kültürlerin bir kuyu yüzeyi boyunca steril bir pipet sürükleyerek bir yara yapmakHsp27 özgü siRNA transfekte veya karıştırılmış kontrol siRNA transfekte HCECs.
2. Hemen yaralama sonra, yaralama sonrası 24 saat boyunca bir% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde Begm kültürlerinde bunları 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkama hücreleri ve bakımı.
3. 24 saat yaralama sonra 100X büyütmede dik bir mikroskop kullanılarak HCEC görüntüleri fotoğraflamak ve arka plan Filtre kullanarak düzleştirme gerçekleştirmek görüntü analiz yazılımı komut.
4. Seç Ölçümler komutunu kullanarak, ilk yara uçtan uca dik kapağı aynı büyüklükteki çokgen şekli ile İlgi (AOI) ait Alan tanımlamak ve her numunenin yaralı alanda üç farklı AOI belirler.
5. Otomatik olarak Kont / Boyut Ölçüm menü seçeneklerini kullanarak her alanda hücre sayısını.

Apoptoz 6. Akım Sitometri Analizi

1. Kültür Hsp27 özgü siRNA transfekte edilmiş ve kontrol sistemHücreler Begm bir% 5 _CO2 atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde% 95 kaynaşmaya eriştikten kadar / oyuk 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 ⁵ hücre konsantrasyonunda her biri 10 nM siRNA içeren HCECs IRNA-transfekte edildi.
2. 1 ml pipet kullanılarak 5, 15 ml tüp içinde dakika ve aspirat tripsin-EDTA 900 x g'de 5 dakika santrifüj için oyuk başına 2 mi% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak HCECs ayırın.
3. Soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve daha sonra 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda bir tampon (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ve 25 mM _CaCI2) bağlanma 1x hücreleri tekrar süspansiyon.
4. 5 ml'lik bir kültürden tüp içine hücre süspansiyonu (1 x 10 ⁵ hücre) ul transfer 100.
5. 5 ul flöresin izotiyosiyanat-konjuge Annexin V ve 5 ul propidyum iyodür ekleyin.
6. Yavaşça hücreleri girdap ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe.
7. bir akış c hücreleri her tüpe 1x bağlayıcı tampon 200 ul ekleyin ve analiz1 saat içinde ytometer.

Sonuçlar

Fosforile Hsp27 ifadesi anlamlı 5, 10 arttı ve sıfırdan 30 dakika sonra yaralı olmayan HCECs ¹³ ile karşılaştırıldığında yaralama. Western blot analizi, Bax ekspresyonu anlamlı Hsp27 özgü siRNA transfekte HCECs (Şekil 1A-D) 'de artmıştır, oysa fosforile Hsp27 ve fosforile Akt ekspresyon hem de önemli ölçüde azalır olduğunu göstermiştir. Fosforile Hsp27 sentezleme% 30 ve 40 10 nM ve% Hsp27 özgü 50 nM siRNA transfekte edilmiş hücreler, sırasıyla kontrol siRNA tr...

Tartışma

Bu çalışmada, HSP27'nin kornea epitel yaralanmasındaki potansiyel rolünü in vitro yaklaşımlar kullanarak değerlendirdik. Kritik adımlar, strese maruz kalan hücrelerde HSP27'nin işlevini gözlemlemek için HSP27'nin yıkılması için siRNA transfeksiyonunu içeriyordu. Özellikle, bu deneyler ile kornea epitelyal yara iyileşmesi sırasında epitel hücre göçü ve apoptozda HSP27'nin bir rolü ortaya çıkmıştır. Vasküler düz kas hücrelerini transfekte etmek için sıçan HSP27'ye özgü siRNA kullanan önceki çalışmalardan¹⁰

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyolojik güvenlik kabini	CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Kore Cumhuriyeti	CHC-777A2-06	Sınıf II, Tip A2
Gizli RNAi ve ticaret; siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; şifreli kontrol-siRNA ve HSP27'ye özgü siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Bronşiyal epitel büyüme ortamı
Proteaz inhibitörü	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340 ,P7626	1 & # 956; M Pepstatin A, 1 & # 956; M Leupeptin, 0.1 & # 956; M Aprotinin
Bradford protein tahlili	Bio-Rad Laboratuvarları, Hercules, CA	# 500-0001	Bradford protein tahlili
Nitroselüloz filtreler	Amersham, Little Chalfont, Birleşik Krallık	RPN3032D	Batı kurutma
membranı Fosforile edilmemiş HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	1: 1.000 seyreltme (Toplam HSP27)
Fosforile HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	1: 1.000 seyreltme HSP27, Ser85
Lifofiktamin ® < / sup>RNAiMAX reaktifi ve nbsp;	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Transfeksiyon reaktifi
Fosforile Akt (Ser473)	Hücre Sinyal Teknolojisi, Danvers, MA	No. 4060	1: 1.000 seyreltme Akt, Ser473'te (hücre sağkalım belirteci) fosforile edilmedi
Fosforile olmayan Akt	Hücre Sinyalleme Teknolojisi, Danvers, MA	No. 4061	1: 1.000 seyreltme (Toplam Akt)
Bcl-2 ile ilişkili X proteini	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi, Danvers, MA	No. 4062	1: 1.000 (anti-apoptotik protein belirteci)
GAPDH	Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA	No. 4063	1: 1.000 yükleme kontrol belirteci (ev tutma geni)
Yaban turpu peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan antikorları	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	1:10.000 seyreltme
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	transfeksiyon için azaltılmış serum ortamı
Görüntü analiz yazılımı	Olympus, Inc., Tokyo, Japonya	Image-Pro Plus 5.0
Skimed süt tozu	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Almanya	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0497
Sodyum Klorür	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Altı kuyulu kültür plakası	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35.00 mm çap / kuyu
24 kuyulu culuture çanak	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Orbital çalkalayıcı	N-Bioteck, Inc., Seul, Güney Kore	NB1015
Sığır serum albümini	Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, Kaliforniya	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Akış sitometrisi
X-Işını Filmi	Kodak, Rochester, Yeşil	400 Ekranlı NY Tıbbi X-Ray Kaseti
batı blotting luminol reaktifi	Santa Cruz Biyoteknoloji, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Annexin V Apoptoz Tespit Kiti I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547