Yöntem makalesi

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 Aralık 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, doku homeostazı muhafaza edildiği bir önemli arası bir süreçtir gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya transferi (SL-DT) tekniği açıklar. Vb toksik maddelerin, toksinler, ilaçlar, tarafından boşluk junctional arası iletişim (GJIC) kesilmesi çok olumsuz sağlık etkileri ile bağlantılı olmuştur. Birçok genetik temelli insan hastalıkları gap junction genlerdeki mutasyonlarla bağlantılı olmuştur. SL-DT tekniği hücrelerinin geniş bir popülasyonda GJIC eşzamanlı değerlendirilmesi için basit bir işlevsel tahlildir. Deney kısa hücre popülasyonu ile bir neşter ile hücre zarı bozucu bir floresan boya ile ön yükleme hücreleri içerir. floresan boya sonra belirlenmiş bir süre için hücreler komşu gap junction kanalları aracılığıyla çapraz izin verilir. Bundan sonra, tahlil hücrelere formalin ilavesi ile sona erdirilir. fluo yayılmasıhücre popülasyonu ile rescent boya Epifloresans mikroskop ile değerlendirilir ve görüntüler kamu malı bulunan ücretsiz yazılım paketleri de dahil olmak üzere mevcut morfometrik yazılım paketleri, herhangi bir sayı ile analiz edilir. Bu deney, aynı zamanda tedavi edilen hayvanlardan elde edilen çeşitli organlarda doku dilimleri kullanılarak in vivo çalışmalar için adapte edilmiştir. Genel olarak, SL-DT deneyi in vitro farmakolojik ve toksikolojik ihtiyaçlarını geniş bir hizmet edebilir, ve potansiyel olarak daha kısa bir süre içinde daha fazla örnek aydınlatmak için otomatik floresans mikroskobu görüntüleme ve analiz ile yüksek verim kurulum sistemleri için adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem genel amacı, bileşiklerin potansiyel toksisite değerlendirmek için basit, kapsamlı ve nispeten ucuz bir teknik sunmaktır. Bu, birden fazla hücre hatlarında kullanılan bir in vitro bir yaklaşımdır. Epifloresans mikroskopları ile donatılmış standart hücre biyoloji laboratuarları bu testi kullanılarak araştırma yapabilir.

Hücre fonksiyonlarının temel bilgi, in vitro biyoanalizlere son derece bağımlı olmuştur ve ilaç, çevresel kirleticiler ve gıda doğan kirleticilerin toksikolojik değerlendirmeler önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Ne yazık ki, kapsamlı, tüm toksikolojik değerlendirmeler için taleplerini karşılayacak tek in vitro biyoassay sistemi vardır. In vitro deneyler birçok tasarlanmış ve değerlendirmek ve aynı zamanda özel bir biyokimyasal ve moleküler uç noktasını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Bunlar oldukça sık bir bir pertürbasyon yansıtmak için kurulmuş bir yüksek verimlilik birleştirilirBu östrojen reseptörü 1 sinyal belirli bir sinyal iletim yolu,. Bu strateji çok başarılı olmuştur, ama gen sentezlenmesine katılan sinyal transdüksiyon yollarının fazla sayıda oldukça karmaşık değerlendirmek için özel bir sinyal yolunu seçmek görevi yapar. Yüksek verimlilikte bir protokoller şu anda geliştirilen ve aynı anda tek tahlillerin bazı zayıf taraflarını bertaraf etmek bir yaklaşım olmuştur sayısız sinyal yolları, ölçmek için kullanılmaktadır. Ancak, tüm sinyal yolları başarıyla daha kapsamlı yaklaşımlar içine dahil edilmiştir, artı yeni sinyal yolları sürekli ileri daha karmaşık hale getirmektedir bu değerlendirme sürecini tespit edilmektedir. Özellikle yüksek verimlilikte bir sistemlerde, in vitro yaklaşımların geniş numaralarını kullanarak, kapsamlı toksikolojik değerlendirmeler de çok pahalı ve en tek araştırmacı için elverişli değildir için araştırma projeleri yürüttü.

GJIC bir işlem tıg olduğuhtly zarı ve hücre iskeletinin proteinleri 2,3 ile önemli hücre içi sinyal iletim yolları ve etkileşimler tarafından düzenlenir voltaj değişiklikleri, kalsiyum konsantrasyonu, pH, redoks dengesinin tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, GJIC inhibisyonu farklı hücresel stres tipleri, farklı hücresel fonksiyonları kesintiye uğraması ya da farklı sinyal iletim yollarının düzensizlikler yansıtabilir. Sınırlı sinyal iletim biyoanalizlere kullanımını aşmak için başka bir yaklaşım değil, en takdirde, sinyal iletim yolları daha gap junction kanalları 4-8 ile kooperatif arası sinyalizasyon sistemleri tarafından pek modüle edilir biyolojik olayların yararlanmak etmektir. arası sinyal sistemleri de çok sayıda ve çok yolu kontrolü altında olmakla birlikte, boşluk birleşim kanallardan arası sinyal sonuçta kısmen kapalı ya da tamamen kapalı açılan kanalların bir fonksiyonudur. Bu kolayca çeşitli kullanılarak ölçülebilir bir bitiş noktası sağlarnitro biyo-tahlil sistemlerinde 7. Bir doku homeostatik ayar noktası boşluk junctional içi iletişim bileşiklerin etkisini belirleyen, açık kanallar gerektirdiğini düşünürsek (GJIC) bileşiklerin 4,8 potansiyel toksik etkileri belirlemede daha kapsamlı bir yaklaşımdır. Esas olarak, gen ekspresyonunu kontrol çoklu sinyal transdüksiyon olayları koordine merkezi bir rol oynamaktadır, bu kritik bir biyolojik fenomen toksik etkileri geniş bir değerlendirmesi için olanak sağlar. Böylece, GJIC değerlendirmek biyo-bileşiklerin toksik potansiyelini değerlendirmek için mükemmel bir başlangıç ​​noktasıdır.

GJIC değerlendirmek için kullanılan en geniş teknikler floresan prob hücreleri ön yükleme ve daha sonra komşu hücrelere yüklenen hücre veya hücrelerden boya geçişini takip dayanmaktadır. Boya önyükleneceği Teknikleri prob 11 yükleme 10, ve metil esterleri kazıyın, mikroenjeksiyon 9 yer var . Neşter yükleme-floresan boya transferi (SL-DT) yöntemi kazıma yükünün bir değişiklik - El Fouly 10 tarafından geliştirilen aktarım deneyi boya. Aksine daha invaziv scrape daha bu raporun neşter yükleme yöntemi invaziv zararı en aza indirmek hücreleri (Şekil 1) bir tek tabaka ile yuvarlak bıçak ile bir neşter hafif bir rulo içerir. Bu tekniğin avantajları hücreleri yerine mikroenjeksiyon tahlilinin tek hücrelerden oluşan bir popülasyonun toksikolojik değerlendirilmesi bulunmaktadır. Mikroenjeksiyon teknikleri ve fluoresan problar metil esterlerini kullanmak teknikler kullanılarak yöntemleri çok daha fazla zaman alıcı ve önemli ölçüde daha yüksek yetenek ihtiyacı olmasına rağmen Ayrıca, bu deneyde basitliği, kısa sürede çok sayıda levha hızlı tespiti için verir.

GJIC okuyan tüm ihtiyaçlarını karşılamak için tek bir yöntem olsa da; SL-DT tahlil o can, basit, oldukça ucuz ve çok yönlü bir testtirÇeşitli bileşiklerin toksisite ilk değerlendirmeler için birçok ihtiyaçlarını karşılamak. Önemli avantajları şunlardır: basitlik, (sıkı bağlamak) deneyi ve moleküler flüoresan prob deneyleri, büyük içinde GJIC arasında hızlı ve aynı anda değerlendirme lokal aktifleştirilmesi ile ışıkla ağartma sonra mikroenjeksiyon, floresan kurtarma gibi diğer yöntemler için gerekli olan ekipman veya beceri için özel bir ihtiyacı in vivo çalışmalar için otomatik floresans mikroskobu görüntüleme ve analiz, hem de kendi ile uyumlu olan bu yüksek işleme kapasiteli bir kurulumu için elverişli hücrelerin sayısı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için protokol sıçanlar insanca ve sıkıntılarını azaltmak için ilgili tedavi edildi sağlamak için Hayvan Bakım ve in vivo deneyler yapılmıştır nerede Japonya Sağlık Bilimleri, National Institutes Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. SL-DT Biyo

  1. Eagles ihtiva eden tohum 3 x 10 5 DB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleri 35 üzerine mm çaplı kültür plakaları 37 ° C,% 100 nispi nem (RH),% 5, bir kuluçka makinesi içinde ortam artı% 5 fetal sığır serumu ve kültür hücreleri modifiye CO 2.
  2. Kültür hücreleri% 100 izdiham (tipik olarak 2 gün) ulaşmak ve aşağıda tarif edildiği gibi hücre istenen deney işlem yürütmek kadar.
    1. Doz Tepki Deneyler Davranış
      1. 10 ul% 100 asetonitril ve 4 ul, 6 ul fenantren bir 2 mM stok çözeltisi 20 ul ve phenan bir 20 mM stok solüsyonu 8 ul ekleStok çözeltisinin eklenen her birim için büyüme ortamının 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril threne.
      2. 4 ul, 6 ul, 8 ul, 10 ul ve araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere asetonitril çözeltisi eklenen her birim için büyüme ortamının 2 ml ihtiva eden üç hücre plakaları asetonitril% 100 çözeltisi 20 ul ekle.
      3. 37 ° C'de,% 100 nem ve% 5 CO2 ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca inkübe edin.
      4. 1.3 adıma geçin.
    2. Davranış Zaman Tepki Deneyleri
      1. Her bir zaman noktası (yani, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 dakika) için büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril fenantren bir 20 mM stok solüsyonu 7 ul ekle.
      2. Her bir zaman noktası, araç kontrolü olarak hizmet etmek için büyüme ortamının 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 7 ul ekle.
      3. Her belirlenen zaman p inkübe37 ° C'de bir inkübatör içinde birleştirme yeri,% 100 nem ve% 5 CO2.
      4. 1.3 adıma geçin.
    3. Zaman Kurtarma Deneyler Davranış
      1. 15 dakika boyunca büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril fenantren bir 20 mM stok solüsyonu 7 ul ekle.
      2. Araç kontrol olarak hizmet etmek için 15 dakika boyunca büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 7 ul ekle.
      3. fenantren veya asetonitril ya da ihtiva eden bir ortam süzün ve fosfat tamponlu tuzlu su, 3 ml (PBS) ile 3 kez her durulama.
      4. Istenen iyileşme süreleri (yani, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 dak), 37 ° C'de bir inkübatörde, 100, her bir plaka taze büyüme ortamına 2 ml ilave edilir ve kuluçkaya % RH ve% 5 CO2.
      5. 1.3 adıma geçin.
    4. Davranış Mekanizması Deneyleri
      1. Sinyal transdüksiyon inhibitörü ekleme örneğin,
      2. Araç kontrol olarak hizmet etmek için 15 dakika boyunca büyüme ortamına 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 5 ul ekle.
      3. ilave bir 15 dakika boyunca büyüme ortamı artı D609 2 ml ihtiva eden üç hücre plakalarına, 100% asetonitril fenantren bir 20 mM stok solüsyonu 7 ul ekle.
      4. araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere bir 15 dakika daha büyüme ortamı artı% 100 2 ml asetonitril ihtiva eden üç hücre plakalarına% 100 asetonitril 7 ul ekle.
      5. 1.3 adıma geçin.
  3. Ya yavaşça orta kapalı dökerek veya vakum emme ile kültür ortamı atın.
    Not: Uygun tehlikeli atık içeren kültür ortamı bertaraf edin.
  4. 3 PBS ml ve betwee tortusundan ayırma veya aspirat ya hücreleri üç kez her durulayınn durular.
  5. Pipet 1 1 mg / ml Lucifer sarı boya her hücre plaka PBS (LY) içinde çözüldü ml.
  6. hafifçe plaka, üç farklı alanlarda hücre popülasyonu ile yuvarlatılmış kenarı ile 20. Cerrahi çelik bıçak haddeleme ile hücreler içine boya önceden yükle.
    1. Dik neşter (90 ° açı) ve kültür plakasının kenarından 5 mm yerleştirerek başlayın ve 15 ° (Şekil 1 e bakınız) bir açı yaklaşık Bu dik açıdan neşter döndürün.
      Not: Bu parmağı ve başparmak arasında neşter kısma elde edilir. (Yuvarlak bıçak sadece hücreler üzerinde rulo gibi) neşter yavaşça 15 ° pozisyona 90 ° gitmek için izin yerçekimi kullanın. Bu hareket bir görsel fark girinti hattını bırakacaktır.
  7. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca LY çözeltisi ile inkübe hücreleri.
  8. Süzün ve LY aspirat ve extrace uzaklaştırmak için PBS 3 ml ile üç kez yıkayınllular hücre dışı arka plan floresan ortadan kaldırmak için boya.
  9. hücrelerin tespit edilmeleri için,% 10 fosfat tamponlu formalin çözeltisi 0.5 ml ilave edilir.
    Not: formalin giderdikten sonra, hava hücrelerini kurutmak ve LY minimum boya photobleaching ile iki yıla kadar süreyle karanlıkta saklayın. Gerektiğinde, floresan boya ön görselleştirmek için% 10 formalin solüsyonu ile rehidrate.
  10. 200X büyütmede 428/536 nm uyarım / emisyon tepe için dikroik küp ile donatılmış bir epifluorışıma mikroskop kullanılarak tespit hücreleri gör. girinti hat görme yatay alanına paralel olacak şekilde tüm plakaları aynı hizaya getirin.
    Not: Bir FITC dikroik küp iyi çalışıyor.
    1. bir CCD kamera ve destekleyici yazılım ile görüntü yakalamak.
      1. CCD kamera için destek yazılımı açın ve otomatik pozlama ayarlarını kullanın. dijital görüntü elde etmek için "yakalama" düğmesini kullanın. "Kaydet" düğmesini kullanarak dosyaları tif olarak görüntü kaydetme.

Karaciğer Dokusu SL-DT Testi 2. Adaptasyon

  1. 5 haftalık, erkek Fischer 344 sıçan kullanarak diseksiyon makas yaklaşık bir karaciğer sol lob 2 x 2 cm dilim çıkarın ve plaka ıslak bir gazlı bez 12 ile kaplı tartmak plastik üzerine yerleştirin.
  2. Pipet 0.5 ila 1 mg içeren bir PBS çözeltisi / ml Lucifer sarı ve rodamin-dekstran (RD) plastik karaciğer dilimi yüzeyi üzerine ağırlığı plakanın her.
    Not: RD gap junction kanalları çapraz edemez ve yüklenen hücreleri işaretlemek bir boyadır.
  3. keskin bir bıçak ile tartın plaka boya çözümü vardır karaciğer dilim yüzeyinde yaklaşık 1 cm uzunluğunda üç beş kesiler yapmak ve daha sonra kesi doldurmak için yeterli ek boya ekleyin.
  4. plaka ağırlık plastik, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca doku inkübe edin.
  5. 5 ml PBS ile üç kere yıkayın.
  6. Doku ove Fixoda sıcaklığında karanlıkta bir 50 mL konik santrifüj tüpü içinde% 10 fosfat tamponlu formalin 30 ml rnight.
  7. Ertesi gün, su ile dilimleri yıkayın 1 x 1 x 0.5 cm 3 şeritler halinde makas diseksiyon ile kesi çevresinde doku Döşeme ve daha sonra parafin 13 dilimleri gömmek için standart teknikleri kullanın.
  8. Bölüm hazır olana kadar karanlıkta 5 mikron kalınlığına insizyon hattına dik dilimleri ve depolamak numuneler mikrotom 13 standart kesit teknikleri kullanarak görüntülü edilecek.
  9. Bölüm 1.10 7'ye göre floresan boya cephede görüntüleri görselleştirmek ve yakalamak için bir CCD dijital kamera ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop kullanın.

3. ükler GJIC

  1. (Örneğin, ImageJ) morfometrik yazılım paketi kullanarak floresan boya yayılmasını ölçün.
    1. "Dosya" sekmesini tıklayın ve ardından açmak için "açık"kaydedilen görüntü.
    2. boya ön hatlarını izlemek için Araç Çubuğu Tab "Ücretsiz Hand Tool" üzerine tıklayın.
    3. "Analiz" sekmesini tıklayın ve ardından "Ölçü" butonuna tıklayınız.
      Not: Bu istenirse diğer tablolama programları içine kopyalanabilir bir tablosunu, bir alan değeri üretecektir.
  2. Bir tablo programı kullanarak, boya aşağıdaki denklem kullanılarak kontrol plakasında, seyahat alanında deneysel plaka boya yayılması alana bölünmesi kontrol (FOC) bölümünü hesaplamak:
    figure-protocol-1
    Bir E = Örneğin, belirli bir dozu veya bir zaman bir kimyasal ile muamele edilen hücreler gibi bir deney değişken maruz kalan hücrelerin, boya yayılması alanı
    Ilgi kimyasal çözünmesi için kullanılan araç ile tedavi edilen hücreler kontrol boya yayılması, bir c = alan
    Not: Aracın etkisini belirlemek için,Bir E araçla tedavi edilen hücrelerde, boya yayılması alanı olacak ve bir C araç ile işleme tabi tutulmamış hücreler, boya yayılması alanı olacaktır. aracın etkisi tercihan% 10 daha az olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GJIC kesilmesi yoğun olumsuz sağlık etkileri 14 uyarmaktadır gen kontrolünün nongenotoxic, epigenetik düzeyde toksik bileşiklerin belirlenmesi için bir biyolojik belirteç olarak kullanılmıştır. Örneğin, poliaromatik hidrokarbonlar (PAH), çevrenin yerde kirletici maddelerdir, ancak molekül yapıları 15 bir fonksiyonu olarak epigenetik toksisite olarak değişir. Düşük molekül ağırlıklı PAH tipik olarak, sigara dumanı 15,16 edilene kontamine Nehri çökeltilerin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SL-DT tahlil GJIC ölçmek basit ve çok yönlü bir tekniktir, ancak uygun deneysel protokolleri tasarlama göz önüne alınmalıdır birçok kritik endişeler vardır. SL-DT tahlili kullanılarak GJIC sağlam ölçümler için hücrelerin gap junction aracılığıyla LY iyi bir boya yayılmış olması gerekir. En azından, uygun bir zaman boya her iki yönde de neşter yüklü hücrelerden hücre sekiz ya da daha fazla sıra yayılır sağlamak için seçilmelidir. Ayrıca, boya neşter yüklü hücrelerin göç mesafesi ölçme kolaylığı için, kontrol levhaları bo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIEHS hibeleri #R01 ES013268-01A2 tarafından desteklenmektedir ve içerikler yalnızca yazarın sorumluluğundadır ve NIEHS'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir ve CETOCOEN UPgrade proje No. tarafından desteklenmektedir. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
WB-F344 sıçan karaciğer epitel hücreleriKuzey Carolina Üniversitesi'nden (Chapel Hill, NC) Dr. J. W. Grisham ve M. S. Tsao'danhiçbiriKuzey Carolina Üniversitesi-Chapel Hill-NC tarafından sağlandı
35 mm Kültür PlakalarıCorning430165
25 cm2 kültür şişeleriCorning430639
75 cm2 kültür şişeleriCorning430641
D-medium, bir Eagles modifiye besiyeri ThermoFisher/GIBCO Formül No. 78-5470EF
fetal sığır serumuThermoFisher/GIBCO 10437
%0.25 tripsin-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
fosfat tamponlu tuzlusu ev yapımımalzeme için aşağıya bakın kedi #137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2< / sub>PO4< / sub>, 2 mM KH2< sub>PO4< / sub>
KCl JTBaker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Fırıncı - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
Lucifer Sarı CH, lityum tuzuSigma-Aldrich KimyasalL0259
rodamin-dekstranSigma-Aldrich KimyasalR9379
1-metilantrasenSigma-Aldrich Kimyasal
fenantrenSigma-Aldrich KimyasalP11409
resveratrolSigma-Aldrich KimyasalR5010
D609Tocris Biyobilim 1437
asetonitrilEMDAX0145-1
%37 çözelti formaldehitJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
# 20 cerrahi bıçakGüzel Bilim Araçları A.Ş.  10317-14
50 ml konik steril tüpThermo Scientific 
Nikon epifloresan mikroskobu Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC dikroik küpNikon -Mager Scientific96107
CCD fotoğraf makinesiNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ CCD
görüntüleme sistemiNikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2 görüntüleme sistemi.
ImageJUlusal SağlıkEnstitüsü http://imagej.nih.gov/ij/
339652

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130(2013).
  3. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  4. Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).
  5. Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
  6. Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
  7. Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
  8. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  9. Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
  10. El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
  11. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
  12. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
  13. Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
  14. Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
  15. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
  16. Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
  17. Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
  18. Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
  19. Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
  20. Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
  21. JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
  22. Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).
  23. Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
  24. Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
  25. Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
  26. Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
  27. Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Scalpel Loading Fluorescent Dye TransferLucifer Yellow Dye TransferEpifluorescence MicroscopyPhenanthrene Toxicity AssayCell Membrane PerturbationDye Migration AnalysisToxicant Effects AssessmentIn Vitro ToxicologyFunctional Biomarker Assay

İlgili makaleler