Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Çeşitli raporlar, herkes için ulaşılabilir zarif duyarlılığı ve moleküler tanı özgüllüğünün yapma hedefiyle noktası-bakım (POC) aygıtları ^1-5 kullanım için, kağıt veya membran bazlı ekstraksiyon yöntemleri geliştirilmesini ele aldık. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Tanı Girişimi POC (Ekonomik, Hassas, Özgül, kullanıcı dostu, hızlı ve sağlam, Ekipman-özgür ve ihtiyacı olanlara teslim) tanımlamak için idealdir özellikleri ASSURED terim icat Test ^6. Bu yönergelerin, ekipman gerektirmeyen karakteristik moleküler teşhis için elde etmek özellikle zordur. Bununla birlikte, sahada her yenilik en çok ihtiyacı olanlara ulaşma hedefine ilerlemek olacak ve umut mevcut teknoloji ⁷ adapte test performansında yakın vadeli iyileştirmeler için vardır.

Burada kandan DNA ayıklamak için basit bir protokol açıklarkarmaşık kimya veya laboratuar aletleri gerekli değildir. FINA (nükleik asitlerin filtrasyon izolasyon) örnek hazırlama yöntemi ilk olarak, bir örnek-yanıt noktası bakım (POC) bir parçası nicel PCR HIV-1 provirüsü tespit etmek için tam kan lökosit DNA elde etmek için geliştirilmiştir sınırlı kaynak ayarlarını ^8-11 kullanılmak üzere (qPCR) erken bebek teşhis (EID) platformu. FINA ekstraksiyon tersine çevrilebilir kaotropik ajanların ¹² varlığında DNA bağlama silika membranlar veya silis kaplı paramanyetik parçacıkları kullanan geleneksel saflaştırma yöntemleri farklıdır. Bunun yerine, FINA doğrudan tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı üzerinden dikey filtrasyon kullanır. Yakalanmış DNA içeren zar bir PCR tüpü içinde doğrudan yerleştirilmiş ve ya hemen sonraki amplifikasyon ⁹ kurutuldu bir PCR reaksiyonunda veya hava da kullanılabilir. Resim kaotropik maddeler, fenol ya da alkoller, numûne alma kullanılır, Eliminating çıkarma işlemi ^13,14 türetilen güçlü qPCR inhibitörleri kaldırmak için gerekli geniş yıkama adımları.

FINA Membran örneği, zara ilave edilmeden önce, hücre lizizi ¹¹ tarafından serbest ya hücrelerinin ⁹ ya da genomik DNA yakalayabilir. hücre yakalama için, tam kan membranına doğrudan ilave edilir. Hücreler daha sonra 10 mM NaOH eklenerek zarda lizlenir. Bu yöntemin avantajı, sadece 3 etapları kapsar: 1) Örnek ilave; qPCR tüpünde 2) hücre parçalama / yıkama ve 3) filtre diski yerleştirme. Bu yöntemin dezavantajı, membran yalnızca membran diskin çapı ile doğrudan orantılı bir hücre belirli sayıda basılı olabilir. Eid gerekli saptama limitini ulaşmak için, tam kan, 100 ul qPCR tüp yerleştirilmesi için çok büyük bir filtre gerektirir Örnek girişi için gereklidir. koleksiyonuna örneğini uygulamadan önce bir deterjanla kan hücrelerinin lizeMembran, bir işlem adımını ekler, aynı numune boyutu için daha küçük bir filtre kullanımına izin verir. Biz yüksek tekrarlanabilirlik, tek kopya algılama ve bu test konfigürasyonu ¹¹ kullanılarak kanın 100 ul HIV-1 proviral DNA kadar az 10 kopya ölçümünü göstermek başardık.

Bu yazıda, başlangıçta laboratuar kullanımı için geliştirilen FINA protokol açıklar. FINA örnek hazırlama modülü olarak bilinen membran / filtre sandviç büyük gruplar halinde hazırlanmış ve daha sonra kullanılmak üzere stoklanmış edilebilir. örnekler, bu işlem 2 dakika sürer ve boyut toplu değişen gerçekleştirilebilir ekstre edilmesi. qPCR hemen çalıştırılabilir veya qPCR gerçekleştirmek için uygun kadar gömülü DNA içeren filtreler saklanabilir. Bu yöntem, düşük ve yüksek kaynak ayarlarında hem numunelerin rutin analizler için çok uygundur.

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan tam kan örnekleri insan denekleri araştırma olarak kabul edilmez. örnekler memnun edildi klinik tanı amaçlar için elde edilmiş ve bu örneklerin kalan kısmı FINA araştırma deneyi için sağlanmıştır. Numuneler araştırmacılar kolayca bireylerin kimliğini tespit etmek mümkün değildi böyle kodlanmıştır.

FINA Numune Hazırlama Modülü 1. Hazırlık

1. A 2.6 mm 35 x 35 mm ² kalınlığında% 100 pamuklu ped keserek pedi kurutma hazırlayın. örnek başına bir tane yastığı kesin.
2. ve daha sonra bir çekiç tahrik delik yumruk kullanarak bant merkezinde 7.14 mm çapında bir delik delme (50 (w) mm 25 mm (h)) parafin film kesme parça kağıt bant ile plastik parafin filmi hazırlayın. örnek başına bir bant hazırlayın.
3. Bir 8.35 mm çaplı daire delme bir bağlı cam kan ayırıcı membran (zar yakalama) diski hazırlayınBir çekiç tahrik delik kullanarak. örnek başına bir diski yumruk. Disk 2.3 um olan bir partikül tutma yeteneğine sahiptir.
4. forseps kullanarak lekeleme pad merkezinde yakalama diski koyarak FINA örnek hazırlama modülü monte edin. parafin bant delik maruz yakalama diskin merkezine bırakır, böylece yakalama disk üzerinde parafin filmi bandı yerleştirin.
5. lekeleme pedi kapsayacak şekilde hafifçe parafin bant germe ve diskin tüm kenarlarda blot pad sopa sıkıca parafin bant basarak disk ve lekeleme ped arasındaki maksimum temas sağlamak.
6. ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar modülleri yapın.

qPCR Tube 2. Hazırlık

1. çift ​​kaplamalı Polye bir daire delme ile floresan algılama engelleme zarın önlemek için qPCR tüpün yanına hücre yakalama zarını demir atacak 5.1 mm'lik bant diski hazırlayınbant sacdan bir çekiç tahrik yumrukla teşhis bant kayit yaptirilabilir. örnek başına bir bant diski hazırlayın.
2. Bandın etiket astarın bir tarafını kaldırın. bir yüzüne ve tüpün dibine doğru yapışmasını 200 ul PCR tüp içine bandı yerleştirin. İkinci etiket kaplamasını çıkartın. Tüp şimdi hazırlanmış diski almaya hazırdır.
3. ileride kullanmak üzere deney ya da stoku için gerektiği kadar tüpleri üretin.

3. contrive Kan Numune

Not: gerçek bir test numunesi hazırlanmaktadır ediliyorsa, 4. adıma geçin.

1. Viroloji Laboratuvarı Kalite Güvence elde edilen HIV-1 Provirüsün tek bir kopyasını barındıran Çözülme 8E5-LAV hücreleri ¹⁵ (MYK; Rush Presbyterian / St Luke Tıp Merkezi, Chicago, IL.).
   Not: / ml 4000 hücre konsantrasyonunda dondurulmuş hücre peletleri olarak depolanır. Daha önce tarif edildiği ^{gibi, 9} hücre sayısı kontrol edildi.
2. ser hazırlayın/ Ul 1 400 hücre arasında değişen konsantrasyonlara ortamı (% 90 fetal sığır serumu,% 10 dimetil sülfoksit) donma ial dilüsyon.
3. mikrosantrifüj tüpü içine seri sulandırmaların her birinin arasında pipetleyin 10 ul hücre. 8E5-LAV kopya sayılarının 10-4,000 bir standart eğri oluşturmak için her bir tüpe, taze, HIV-1 negatif EDTA tedavi tam kan örneği 100 ul ekle. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın.

4. FINA Ekstraksiyon gerçekleştirin

1. 110 ul tam kan ve aşama 3,3 hücreler)% 1 (11 ul,% 10 Triton-X100 içinde bir son konsantrasyona kadar Triton-X100) eklenerek lize kan hücreleri.
2. yavaşça tüpün 5 kez dibi hafifçe vurarak karıştırın. Kan saydam kırmızı renkte olmalıdır.
3. Pipetleyin yakalama diske kan örneğinin tüm.
   Not: parafin bant ve yakalama membranı arasında bir su geçirmez mühür kan zarından akan sağlar ve yakalama m arasında iyi temaszarı böylesine ve kurutma ped montaj hızlı numune fitilleme sağlar.
4. Örnek filtresinden bekletin.
   Not: kılcal eylemi lekeleme pedine kan lizatı fitilleri, yakalama diskin yüzeyi üzerinde genomik DNA yakalama. o mat göründüğünde lizat disk içine batırılmış gelmiştir.
5. yakalama diske 600-1,000 ul 10 mM NaOH damla damla ekleyin.
   Not: Yıkama tamponu, 600 ul bir hacim ilave olarak eklenebilir. tampon hidrofobik parafin kasete bir damlacık oluşturur ve yaklaşık 20 saniye içinde diske delikten fitil olacak. Filtre hemoglobin beyaz belirten temizlenmesi için kırmızı değişecektir.
6. forseps ile lekeleme pedi disketi ayırın ve hazırlanan PCR tüpünde bant diski uygulayın. Filtre üzerinde kalan herhangi bir kırmızı varsa tüp içinde yerleştirmeden önce filtreyi temizlemek için yıkama tamponu 50-100 ul ekleyin.
   Not: Nadiren, aşırı basınç hazırlanmasında kullanılanlekeleme pad ayrılma sırasında zar katmanlarının bölümleme FINA modülleri sonuçları. Bu diskleri atın ve taze bir örnek hazırlamak.
7. Filtre PCR tüpünde yerleştirildikten sonra, hemen numuneleri analiz. Alternatif olarak, bir kutu içeren kalsiyum sülfat kurutucu kuru bir gecede, daha sonra analiz için hazır olana kadar silis kurutucu ve mağaza ile bir folyo kese içinde kap ve yer.

5. qPCR Reaksiyon

1. Daha önce ^9,11 açıklandığı gibi HIV spesifik primer ve problar kullanılarak reaksiyon başına 100 ul qPCR master karışımı hazırlayın. Bir iç amplifikasyon kontrolü amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı izlemek için ve negatif örnek bir gerçek negatif olduğunu doğrulamak için ekleyin. Filtre tamamen ana karışımı ile ve filtre reaksiyon boyunca tüpün yanına sabitlenmiş kalmasını kaplı olduğundan emin olun.
2. Daha önce ⁹ tarif edilen bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak amplifikasyon gerçekleştirin.

8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kandan proviral DNA çıkarmak için iş akışı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. 2 FINA örnek modülü göstermektedir qPCR tüp hazırlanır Şekil. Zoraki örnekleri (Şekil 3) standart eğride gösterildiği gibi bu yöntem, farklı kopya numaraları de 8E5-LAV hücrelerinden, HIV-1 provirüs verimli amplifikasyonu için izin verir. PCR Verimliliği = -1 + 10 (-1 / eğim) hesaplanan,% 103 bir etkinliği vardı. Doğrunun denklemi r² = 0,996 bir korelasyon ile = -3.25x + 27.95 y oldu. HIV proviral DNA standart eğri Tablo 1 'de görüldüğü gibi, aynı zamanda, yüksek ölçüde tekrarlanabilir amplifikasyon sahip çoğaltır. Buna ek olarak, hidroksipiruvat Redüktaz sayısından bağımsız FINA ile kan ekstrakte bir sonucu olarak ortaya PCR inhibisyonu olduğunu göstermek için mevcut olan 500 kopya bir iç kontrol mevcut HIV-1 provirüsün kopya (Şekil 4). IC amplifikasyonu verimli 21.92 ± 0.25 ortalama Cq ve% 1 bir CV ile, test edilen tüm 18 numune elde edildi.

Şekil 1: tam kandan proviral DNA tespiti için iş akışı qPCR için 8E5-LAV hücreleri ile çivili. Kan yakalama zara ve yıkama tamponu ilave edildikten sonra ilave edildikten sonra (A), sağdaki hazırlanan FINA modülü yaptı. QPCR Master karışımı ile çift kaplamalı bant yapışmış yakalama disklerle (B) qPCR tüpleri eklendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: FINA içi modülü ve qPCR tüp hazırlanması. (A) Bir 8.35 mm çaplı yakalama membran disk kare 707 lekeleme pedi ve merkezi bir 7.14 mm çapında bir delik içeren parafin bant ince bir tabaka arasında sıkışmış olan bu tür parafin bant delik merkezli olduğunu pipet ile parçalanmış kan doğrudan uygulama için yakalama diski. (B) 5,1 mm çift kaplamalı polyester tanı bant 200 ul qPCR tüp tarafında kalmış. Bandın ikinci astar hazır olduğunda yakalama diski uygulamak için yapışkan yüzeyi açığa çıkarılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:., HIV-1 proviral DNA uydurulmasının örneklerin standart eğrisi 4 100 ul elde edilen (A), amplifikasyon çizimini, HIV-1 KD çoğaltır500 kopya / iç kontrol Katı hatlar = amplifikasyon araziler reaksiyonu ile 4,000, 400, 40 ve 10 8E5-LAV hücreleri ile çivili tam kan gatif; Noktalı çizgi eşiğini =. Y ekseni floresans birimleri ve X ekseni qPCR döngü sayısı. Cq değerleri (B), standart eğriler 100 ul tam kan başına 8E5-LAV hücre günlük kopya sayısı karşısında amplifikasyon grafiğinden hesaplanmıştır. Doğrunun denklemi: y = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; PCR verimi = 103,23% Verimliliği hesaplanan = -1 + 10 (-1 / eğim) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. İç kontrol hidroksipiruvat Redüktaz Amplifikasyon kontrol plazmid reaksiyon başına eklenmiş qPCR inhibisyonu 500 kopya gösterir. Katıçizgiler = amplifikasyon araziler; Noktalı çizgi eşiğini =. IC Ortalama Cq 21.92 ± 0.25 =. CQS 21.21 den 22.32 arasında değişmektedir. varyasyon (% CV) katsayısı% 1 =; N = 18. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4000 Ortalama Cq, standart sapma (SD) ve değişim katsayısı (% CV), 400, 40 ve FINA çıkarma ve HIV-1 spesifik primerler ile 8E5-LAV standart eğrinin 10 kopya: ge = "1"> Tablo 1 sondalar. N = 4 WB = tam kan.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.