Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Özet

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Özet

Son on yıl içinde, sinyal transdüksiyon yollarının, transkripsiyonel düzenleyici ağlar, gen ekspresyonu, genom düzenleme ve gen sessizleştirme analizi için, tür kırpmak için örnek türlerin arasında değişen bitki protoplastlarına kullanımında bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Ayrıca, önemli bir ilerleme bitki genomik için bu sistemlerin kullanımında bile daha fazla ilgi üretti protoplast bitkilerin rejenerasyonu, ilerleme kaydedilmiştir. Bu çalışmada, bir protokol bir robot platformu kullanılarak bir "açık san '2 (x 2), tütün süspansiyon kültüründen protoplast izolasyon ve dönüşüm otomasyonu için geliştirilmiştir. dönüşüm yöntemleri Karnabahar mozaik virüsü 35S promoteri (35S) kontrolü altında portakal renkli bir floresan protein (OFP) raportör geni (pporRFP) kullanılarak doğrulanmıştır. protoplastlarda OFP sentezleme epifloresans mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Analizler aynı zamanda propidiu kullanarak protoplast üretim verimliliği yöntemleri dahilm iyodür. Son olarak, düşük maliyetli bir yiyecek cinsi enzimler maliyet açısından çok pahalı protoplast izolasyon ve analizi otomatik yüksek verimli olan laboratuvar dereceli enzimler gerektiren gereksinimin ortadan kaldırılmasının, protoplast izolasyon prosedürü kullanılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen protokolüne göre, dönüşüm, protoplast izolasyon bütün yöntemi operatörün herhangi bir giriş olmadan 4 saat altında yapılabilir. Bu çalışmada geliştirilen protokol BY-2 hücre kültürü ile doğrulandı iken, prosedürler ve yöntemler ekin genomik araştırma ivmesini etkinleştirmeniz gerekir herhangi bir bitki süspansiyon kültürü / protoplast sistemine çevrilebilir olmalıdır.

Giriş

Son yıllarda, bitkisel beslenme ⁶ bilmek biyokütle verimi ⁷ geliştirmek, ve hücre duvarı rekalsitrantların azaltmak kuraklık ^3,4 ve tuz tolerans ⁵ iletmektedir, herbisite karşı direnç ² kavuşturulması, çeşitli hastalıkların ¹ üstesinden gelmek için transgenik bitkileri tasarım yerleştirilen önemli ivme olmuştur ^8. Bu eğilim dsRNA ^10, miRNA ¹¹ ve siRNA ¹² üzerinden susturma CRISPR ve Talens ⁹ kullanarak genom düzenleme ve gen dahil olmak üzere transgenik bitkiler, üretmek için yeni moleküler araçlar geliştirilmesi ile yardım görmüştür. Bu teknolojil....

Protokol

Süspansiyon Hücre Kültürleri 1. kurulması

1. BY-2 ortamı _PO4 4.43 g Linsmaier ve Skoog bazal ortamı, sukroz, 30 gr, 200 mg KH ₂ ekleyerek sıvı hazırlayın ve damıtılmış 200 ug ila 900 2,4-diklorofenoksiasetik asit (2,4-D) mi su ve 0.1 M KOH ile pH değeri 5.8'e. pH ayarlandıktan sonra damıtılmış su ve otoklav ile 1000 ml nihai hacim ayarlayın. Ortam, 4 ° C'de 2 hafta kadar saklanabilir.
2. % 1 ilave By-2 ortamı, 250 ml'lik bir Erlenmeyer bir katı İLE-2 ortamı üzerinde yetiştirilen 100 ile-2 ortamı sıvı ml x 2 yara dokusunun tek bir parça (> 1 cm çaplı) ile balonun (sıvı inoküle ağar) ve alüminyum folyo ile kapatın. 5 gün....

Sonuçlar

Bu çalışmada, x 2 iki katına çıkma oranı 15 saat bir ortalama hücre döngüsü uzunluğu bir önceki raporlar ile uyumludur kültürleri inkübe edildi sıcaklığa bağımlıdır 14-18 saat arasında değişmiştir. Bu katlama oranı ile, 1: 100 Başlangıç ​​aşı 5-7 günde% 50 bir paketlenmiş hücre hacmi (PCV) kültürlerin neden kültürlerini başlatmak için kullanılmıştır. Kültürler ortam 200 ml içinde büyütülmüştür içinde mevcut protokolde dokunun bütünleşmesi, 100 ml'lik bir PCV 33 6 oyuklu plakalar dold.......

Tartışma

Yukarıda açıklanan protokol başarıyla protoplast izolasyon, numaralandırma ve dönüşüm BY-2 tütün süspansiyon hücre kültürü kullanarak valide edilmiştir; Ancak, protokol kolayca herhangi bir bitki süspansiyon kültürü için uzun olabilir. Şu anda, protoplast izolasyon ve dönüşüm mısır (Zea mays), ^10, havuç (Daucus carota) ^32, kavak (Populus euphratica) ^33, üzüm (Vitis vinifera) ^34, palmiye yağı (Elaeis guineensis) ³⁵ de dahi.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Orbitor RS Mikroplaka taşıyıcı	Thermo Scientific
Bravo Sıvı İşleyici	Agilent
Synergy H1 Çok Modlu Okuyucu	BioTek
MultiFlo FX Çok Modlu Dağıtıcı	BioTek
Teleshake	Inheco	3800048
CPAC Ultra Düz Isıtıcı / Soğutucu	Inheco
7000190 Vworks Otomasyon Yazılımı	Agilent Bravo için protokolleri kontrol etmek ve yazmak için kullanılan	Agilent
Yazılımı Momentum Yazılımı	Orbiter		Görev zamanlama yazılımı
	için protokolleri kontrol etmek ve yazmak için kullanılan Biotek Yazılımı
	Olympus
Zyla 3-Tap mikroskop kamera	Andor
ET-CY3/TRITC Filtre Seti	Chroma Technology Corp	49004
Rohament CL	AB Enzimler	numune şişesi	düşük maliyetli selülaz
Rohapect UF	AB Enzimleri	numune şişesi	düşük maliyetli pektinaz
Rohapect 10L	AB Enzimleri	numune şişesi	düşük maliyetli pektinaz/arabinaz
Linsmaier & Skoog Bazal Orta	Fitoteknoloji Laboratuvarları	L689
2,4-diklorofenoksiasetik asit	Fitoteknoloji Laboratuvarları	D295
propidyum iyodür	Sigma Aldrich	P4170
Poli (etilen glikol) 4000	Sigma Aldrich	95904-250G-F	Eski adıyla Fluka PEG
Propidium İyodür	Fisher Scientific	25535-16-4	Acros Organik
CaCl2	Sigma Aldrich	C7902-1KG
Sodyum Asetat	Fisher Scientific	BP333-500
Mannitol	Sigma Aldrich	M1902-1KG
Sükroz	Fisher Scientific	S5-3
KH2PO4	Fisher Scientific	AC424205000
KOH	Sigma Aldrich	P1767
Gelzan CM	Sigma Aldrich	G1910-250G
6 oyuklu plaka	Thermo Scientific	103184
96 kuyulu 1.2 ml derin kuyu plakası	Thermo Scientific	AB-0564
96 kuyulu optik alt plaka	Thermo Scientific	165305
Finntip 1000 Geniş Çaplı Pipet uçları	Thermo Scientific	9405 163
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Sigma Aldrich	P4504-1KG
MES	Fisher Scientific	AC17259-5000
MgCl2	Fisher Scientific	M33-500

RS Liquid Handling Control 2.17 Yazılımını kontrol etmek için kullanılan Thermo Scientific MultiFlo FX IX81 Ters Mikroskop