Method Article

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

DOI:

10.3791/54307

⸱

August 7th, 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuantum nokta (QD) nanopartiküllerinin epoksi gömülü insan patoloji dokusunun korelasyon immünositokimyasal çalışmaları için kullanılabileceği bir yöntem tanımlanmıştır. Geniş alan floresan ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirilen ticari antikor fragmanı konjuge QD'ler kullanıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kuantum noktası (QD) nanopartiküller Geniş açılı, floresan ışık mikroskopisi ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile insan patolojisinde doku bağıntılı immünositokimyasal çalışmaları için kullanılabilir ve böylece bir yöntem tarif edilmektedir. streptavidin konjüge 585 nm kadmiyum selenyum (CdSe) kuantum noktaları (QDS) ile biyotinlenmiş sekonder antikor ve görüntüleme ile, takiben de somatostatin birincil antikor kullanılarak, insan somatostatinoma tümör ultra-ince epoksi bölümleri immunolabeled olan protokolü, göstermek için. Kesitler daha sonra Geniş açılı, floresan ışık mikroskopisi ile, gözlem için bir cam lam üzerine yerleştirilir TEM numune ızgara üzerine monte edilmiştir. Işık mikroskopisi tümör hücre sitoplazması içinde bir zerre desen oluşturan parlak turuncu floresan gibi 585 nm QD etiketleme ortaya koymaktadır. ışık mikroskobu ile orta menzilli büyütme düşük at etiketleme desen kolayca kabul edilebilir ve non-spesifik ya da arka plan etiketleme düzeyi değerlendirilir. Bu kritikmorfolojik bağlamda sonraki TEM ile immün desen yorumlanması ve değerlendirilmesi için adım. Aynı bölüm daha sonra kuru lekelenen ve TEM tarafından görülüyor. QD problar bireysel ifrazi tanecikler içerisinde bulunan şekilsiz malzemeye bağlı olmak görülmektedir. Görüntüler bağıntılı analizi için ışık mikroskobu ile görülen faiz (ROI) aynı bölgeden elde edilir. Her modalite görüntüleri mukabil sonra ilgili bölgenin TEM ultrastrüktürü floresan verilerini bindirmek için karışık olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) geçici dinamik olaylara 1, nadir olaylar 2, 3 ve karmaşık sistemler 4 analizi için güçlü bir yaklaşımdır. Sorusuna bağlı olarak 5 mevcuttur birçok farklı teknik permütasyon isteniyor vardır ancak ortak bir gereksinim tek bir örnek 6 aynı yapı birden mikroskopi modaliteleri tarafından görüntülenmiş olmasıdır. Clem bizim özel yaklaşım, arşiv insan patolojisinde dokusunun çalışma ve iyi karakterize edilmiş ve 7, daha önce yayınlanmış olan burada kullanılan durum için geliştirilmiştir. Amaç ultrastrüktürel düzeyde görülen İmmünositokimyasal etiketleme desen bağl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Doku Diseksiyon ve Fiksasyon

  1. doku Diseksiyon
    1. Bir cerrahi rezeksiyon tümör örneği veya doku biyopsisi doku parçaları incelemek.
      Not: Bu çalışmada kullanılan doku rutin formalin içinde sabitlendi, ancak taze doku da uygundur. Bu rutin histolojik boyama ve anti-somatostatin immün (gösterilmemiştir) sonra, somatostatinoma tümör içeren, anatomik bir patolog tarafından teyit bildirilen bir alan seçilmiştir.
    2. Yaklaşık 1,0 mm 3 daha büyük doku parçaları kullanın.
  2. Kakodilat tampon hazırlanması
    1. sodyum kakodilat 21.4 g eklenerek stok tampon çözeltisi (1 M) hazırlama ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için kullanılan somatostatinoma tümör örnek kollajen stoma dokusu ile karışık duktal yapılar oluşturan tümör hücrelerini oluşmaktadır. floresan ışık mikroskobu ile, bol salgı granülleri içeren bireysel tümör hücreleri somatostatin hormonu pozitif etiketleme gösterdi. Çekirdekler az spesifik olmayan etiketleme tespit (Şekil 1) ile birlikte koyu delikler ortaya çıktı. Düşük büyütmelerde, değişken yoğun granül-turuncu flüoresansın bu da iyi karakterize edici özel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma CLEM çalışmaları için evrensel prob olarak QDS potansiyel yarar göstermiştir. Geniş açılı ışık mikroskobu ile inceledi ve kolayca TEM gözlendi kullanılan 585 nm QD nanopartiküller parlak ve istikrarlı floresan gösterdi. Mevcut yazarlardan birinin bir önceki çalışmada da süper çözünürlük ışık mikroskobu 7 için uygun olduğu QD'lerin göstermiştir. Onların fotostabilite genişletilmiş izleme süreleri ve uzun görüntüleme pozlama için özellikle yararlı oldu. QDS farklı büyüklükte probları, aynı eksita.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Xiao Juan Wu (İmmünohistokimya Laboratuvarı) ve Anatomik Patoloji Bölümü, Sidney Güney Batı Patoloji Servisi (SSWPS), NSW Sağlık Patolojisi, Liverpool, Yeni Güney Galler, Avustralya'nın desteğini kabul etmek isterler.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sodyum kakodilatProscitechC0205Zararlı kimyasal
Osmiyum tetroksitProscitechC010Sadece çeker ocakta kullanın
Uranil asetatUnivar-Ajax569Tehlikeli kimyasal
Etanol %100FronineJJ008
Aseton %100FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
Sodyum metaperiyotAnalar BDH10259
anti-somatostatin antikoruDakoA0566
Antikor seyrelticiDakoS3022
Qdot 585 Streptavidin Konjugat İnvitrojenQ10113MP
Biyotinile keçi anti-tavşan IgG antikoruSigmaB7389-1ML
Glutaraldehit% 50EMS16320
Normal keçi serumuInvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid & nbsp;
BSAc (%10)Aurion900.022
ParafilmPechiney PPM
pH indikatör şeritleri (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
Mikro kalıplarProscitechRL063
Elmas bıçakDiatomeUltra 45
Transmisyon elektron mikroskobuFEIMorgagni 268D
Floresan ışık mikroskobuCarl ZeissAxioscope A1
Izgaralar 300 mesh nikel (ince çubuk)Agar ScientificG2740N
UltramicrotomeRMCPowertome
TEM kamera kontrol yazılımıSoft Imaging SystemAnalySISVersion 3.0
Görüntü işleme yazılımıAdobe Systems DahilPhotoshop CS2
BR0014G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron micr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Correlative Light Electron MicroscopyQuantum Dot NanoparticlesImmunocytochemical StudiesTransmission Electron MicroscopyWidefield Fluorescence MicroscopySomatostatinoma Tumor TissueStreptavidin Conjugated QDsNickel Grid PreparationAntibody Labeling ProtocolFluorescence TEM Overlay

Related Articles