Method Article

İnsan pluripotent kök hücrelerin Süspansiyon tabanlı Kardiyak Farklılaşma için mikro Agrega boyutu Optimizasyon

DOI:

10.3791/54308

⸱

September 25th, 2016

 ,  , 
1Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel yöntemler, insan pluripotent süspansiyon toplam bazlı kalp farklılaşma hücreleri (hPSCs) agrega boyutu ve şekli açısından kültür heterojenite ile rahatsız edilir kaynaklanıyor başlatmak için. Burada, boyut kontrollü hPSC kalp teşvik koşullar altında kültüre agrega üretmek için mikro istihdam kalp farklılaşma için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) kardiyak farklılaşması tipik olarak süspansiyon hücre agregatlarında gerçekleştirilir. hPSC'lerin konvansiyonel agrega oluşumu, hücre kolonilerinin daha küçük kümelere ayrılmasını içerir ve kümelerin boyut kontrolü, istenen küme boyutu elde edilene kadar hücre süspansiyonunun pipetlenmesiyle kabaca kontrol edilir. hPSC'lerin konvansiyonel agrega bazlı kardiyak farklılaşmasının ana zorluklarından biri, kültür heterojenliği ve mekansal düzensizliğin değişken ve verimsiz kardiyomiyosit verimine yol açmasıdır. Biz ve diğerleri daha önce insan embriyonik kök hücresi (hESC) agrega boyutunun kardiyak indüksiyon verimliliğini optimize etmek için modüle edilebileceğini bildirmiştik. Agrega oluşumunun fiziksel parametrelerini, özellikle agrega boyutunu ve şeklini kontrol etmek için ölçeklenebilir, mikro kuyu tabanlı bir yaklaşım kullanarak bu zorluğun üstesinden geldik. Burada tarif ettiğimiz yöntem, tanımlanmış hPSC sayılarının mikrokuyularda zorla toplanmasından ve bu agregaların doğrudan kardiyak indüksiyonu yönlendiren koşullarda müteakip kültüründen oluşur. Bu protokol, kullanılan kuyuların boyutuna ve sayısına bağlı olarak kolayca ölçeklendirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, %70'ten daha yüksek kardiyomiyosit frekanslarına sahip kültür çıktılarını tutarlı bir şekilde elde edebiliriz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro hücre kültüründe bir yöntemleri numarası altında gerçekleştirilebilir, ancak tipik olarak, iki boyutlu bir yapışkan koşullarda veya daha tam bir şekilde in vivo sistemlerde özetlemek üç boyutlu süspansiyon koşullarında ya da gerçekleştirilir. Sonuç olarak üç boyutlu doku yapıları oluşturmak için sağlam yöntemler geliştirmek için araştırma birçok alanda artan bir eğilim vardır. Hücre tipleri ve süreçleri destekleyici hücre dışı matriks (ECM) yüzey ve yapışma sinyallerini gerektiren senaryolarda, üç boyutlu kültür hücreleri veya matrisi 1 destekleyen bir dışsal kültürlenmiştir sorularla desteklenen yapıları aracılığıyla etkin olabilir. Destekleyici bir matrise yapışma gerektirmeyen hücreler ve işlemler esasen ve özel olarak 2,3 (daha sonra kendi endojen matrisler oluşturmak için devam edebilir) hücrelerden oluşan unscaffolded sistemleri gibi süspansiyon içinde gerçekleştirilebilir. Burada, kalp farklılaşma o için bir protokol mevcutf insan pluripotent kök hücreleri - boyut kontrollü, üniforma, unscaffolded büyüklüklerdeki (hPSCs embriyonik ya da diğer kaynaklardan vücutta herhangi bir hücre tipi olma yeteneğine sahip hücreler, ister kök).

Süspansiyon agrega olarak hPSCs Farklılaşma bir çalışma içinde ve ishal arasında hem toplam boyutu büyük değişimler kurtulamadı. Bu değişkenlik hücre kolonilerinin mekanik ayrılma içerir genellikle bu agrega üretmek için kullanılan yöntem, bir sonucudur. Bu değişkenliği azaltmak için bir kısım yaklaşımlar, agrega başına hücre sayısı olarak toplam çapa ve bütünlüğü kontrol etmek için kullanılmıştır. Örnekler mikrosantrifüj tüpleri 4 agregatların oluşumunu içeren veya asılı 5 damla olarak micropatterning veya hücrelerin santrifüj U veya V-tabanlı çok oyuklu plakalar 7,8 sonra içine süspansiyona aktarılabilir iki boyutlu hPSC koloniler 6 tanımlanan 9. Ancak, tüm bu yakloaches agrega nesil düşük işlem hacmi ile sınırlıdır. İyi tabanlı sistemler V-alt plaka sistemlerine benzer bir yaklaşım, mikro ve ancak daha küçük boyutta istihdam de tek bir kültür plaka üniforma agrega büyük sayılar nesil sağlayan (bu protokolde her 400 um genişliğe sahip) bütün bir V-alt plaka 10 elde edilenden daha içeren (15.5 mm ~ 1200 mikro-~ standart çap). Peki tabanlı agregat oluşumu 11, Endodermal 12, mezodermal 13 ve extraembryonic 14 kaderi ektodermal için hPSCs farklılaşmasını da dahil olmak üzere bir takım ayarları kullanılmıştır; mezenkimal kök hücrelerin 15 den kondrogenezis; toksikolojik tarama 16 üniforma substratların nesil; ve mechanobiology 17 araştırmalar.

hPSC türetilmiş kardiyomiyopati üretimi için güçlü üretim protokolleri gelişmekte Bir büyük zorlukyocytes koşular arasında kalp farklılaşma verimliliği tekrarlanabilirliği eksikliği olmuştur. Biz daha önce bu değişkenliği endoderm ve nöral farklılaşma 6,18 ile ilişkili genleri ifade hem kendini yenileyen hPSCs ve farklılaşan hücreler oluşur başlayan hPSC nüfus, heterojenlikten isnat edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu ayırt hücreleri tarafından salgılanan sinyaller kalp indüksiyon etkisi. Sinir ataları kalp indüksiyon inhibe eder Özellikle, extraembryonic endoderm, kardiyak indüksiyonunu promote eder. HPSC agregasyonu üzerine, agrega farklılıklarını göz içindeki hücreler, ve böylece bu ayrışmamış hPSCs agrega yüzeyi 13 üzerinde gelişebilir extraembryonic endoderm hücrelerinin bir tabakası ile çevrilidir düzenleyin. Agrega boyutunun kontrol ederek, farklılaşmamış hPSCs (hacim oranı yüzey alanı) için kalp-uyaran endoderm hücrelerinin oranını modüle ve maksimum kalp indüksiyon 13 bu oranı optimize edebilirsiniz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta Bileşenleri 1. Hazırlık

  1. Yıkama Orta hazırlayın. DMEM / F12, 100 ml başına 1 100X Penisilin / Streptomisin (pen / strep) ml 100x L-glutamin, 1 ml ve serum yerine 5 ml ekleyin.
  2. üreticinin talimatlarına göre bir kimyasal olarak tanımlı bir bazal Kardiyak indüksiyon ortamı hazırlar.
  3. Bu protokolde kullanılacak ortam Aşağıdaki stok reaktifler hazırlayın.
    1. L-askorbik asit: konik bir tüp içinde, 4 ° C'de steril ultra saf damıtılmış su içinde, ml başına 5 mg bir stok çözelti hazırlayın.
      1. Buz üzerinde bu çözüm bırakın ve çözünen tamamen eriyene kadar periyodik tüp vorteks. -Filtre sterilize 0.22 mikron şırınga filtre kullanılarak Askorbik Asit çözümü.
      2. askorbik asit çözeltisi, 1 ml hacimde hazırlayın ve -20 ° C'de bu alikotları saklayın. her ortamı hazırlanır taze buzları çözülmüş bir alikotu kullanın.
    2. Orta hazırlama gününde, Bazal Kardiyak İndüksiyon Orta 1 ml monotiyogliserol (MTG) 13 ul sulandırmak. Kullanılmayan, seyreltilmiş MTG atın.
    3. -20 ° C'de saklamak için transferin (30 mg / ml) 1 ml'lik eş payları hazırlayın. Mağaza 3 aya kadar 4 ° C 'de alikotları çözülmüş.
    4. % 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden, 4 mM hidroklorik asit (HCI) hazırlayın. Bir duman başlığı içinde, ultra saf damıtılmış su, 50 ml 6.0 N HCI çözeltisi 30 ul ekle. -Filtre sterilize 0.22 mikron şırınga filtre kullanarak çözüm. 50 mi HCI çözeltisine% 25 BSA çözeltisi 2 ml ilave edilir.
    5. % 0.1 BSA ihtiva eden fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlayın. ml PBS başına 25% BSA çözeltisi 20 ul ekle.
    6. İnsan kemik morfogenetik protein 4 (BMP-4) stok çözeltisi (10 ng / | il) hazırlayın. % 0.1 BSA içeren, 4 mM HCl tampon çözeltisi, 1 ml BMP-4 liyofilize 10 ug çözülür. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın.
    7. İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (bFGF) stok çözeltisi hazırlayın(10 ng / | il). % 0.1 BSA içeren fosfat tamponlu salin içinde 1 ml (PBS) içinde 10 ug liyofilize bFGF eritin. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın.
    8. Insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) stok çözeltisi (5 ng / ml) hazırlayın. % 0.1 BSA içeren 1 ml PBS içinde 5 ug liyofilize VEGF çözülür. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın.
    9. Aktivin bir stok solüsyonu (10 ng / ul) hazırlayın. % 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden 1 ml PBS aktivin liyofilize bir 10 ug çözülür. -20 ° C'de saklamak için 50 ul alikotları hazırlayın.
    10. Wnt Üretimi-2 (IWP-2) stok çözeltisi (10 mM) inhibitörü hazırlayın. 429 ul dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 mg IWP-2 içinde çözülür. -80 ° C de saklamak için 10 ul alikotları hazırlayın.
  4. Komple Kardiyak İndüksiyon Orta hazırlayın. Bazal Kardiyak Ortamına 100 ml için 1 100X Pen / Strep ml 100x L-glutamin, 1 ml, transferrin 500 ul, 1 ekleyinTaze çözülmüş bir askorbik asit ml ve MTG 300 ul. Kullanılmayan ortamı atın.

Microwell Plate 2. Hazırlık

Not: Tüm adımlar, biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır.

  1. plaka kullanılacak her bir çukuruna 0.5 ml yıkama çözeltisi (kit bileşeni) ekleyin. Çözelti iletişim Her kuyucuktan içindeki tüm yüzeyi, 2 dakika boyunca 840 x g'de santrifüj plaka sağlamak.
  2. Oda sıcaklığında 30 ile 60 dakika boyunca inkübasyona bırakılır.
  3. Kuyulardan Durulama Çözüm aspire. Aşağıdaki gibi her bir kuyunun iki kez yıkayın: Her bir oyuğa PBS 1 ml ekleyin, santrifüj plakasını 2 dakika süreyle 840 xg'de ve sonra PBS aspire.

hPSC 3. oluşumu Microwell Plate agregatlar

Not: Tüm adımlar, biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır.

  1. 37 ° C su banyosu içinde yıkama ortamında yerleştirin.
    NOT: hacimli HP kuyu = 1 ml x gerekli sayıdaayrışmış olacak SC.
  2. tek hücrelere hPSCs ayrıştırmaları
    Not: Bu adımlarda 6 kuyu plakalar üzerinde kültür hücreleri ayrışma açıklar - reaktif hacimleri farklı kültür biçimleri için orantılı ölçeklendirilebilir.
    1. Her hPSC kültüründen de ayrılma için kültür ortamı aspire. ayrışma enzim 1 ml de her durulama ve hemen, her bir oyuktan ayrılma enzimi aspire.
      NOT: Artık ayrışma enzim hücreleri ayırmak için yeterli olmalıdır.
    2. 3 dakika için 37 ° C'de inkübe plakası.
    3. her iyi yıkama ortamında 1 ml ilave edilir ve mekanik olarak doku kültürü yüzeyi üzerinde P1000 mikropipetöre ile yıkayın Orta pipetleme doku kültürü yüzeyinden hücreleri ayırmak. ayrışma eksik ve hücre kümeleri kalır gibi görünüyor, bu noktada bir süzgece süspansiyon geçmektedir.
    4. 15 ml konik tüp ve saklamak için hücre süspansiyonu aktarıninkübatör boru hücre sayısı bir sonraki aşamada gerçekleştirilir ise.
    5. Bir hücre sayımı gerçekleştirin:
      1. Önceki adımda elde hücre süspansiyonu, 10 ul numune alın. Tripan Blue 30 ul ekleyin ve pipetleme tarafından iyice süspansiyon karıştırın.
      2. Bir hemasitometre her odasına Tripan Mavisi lekeli hücrelerin 10 ul aktarın ve 10X amacı ile ters mikroskop altında görselleştirmek. hücreleri saymak.
    6. Hücre sayımı sonuçlarından, mikro tepsinin bölmesi başına 1.2 x 10 6 hücre tohumlanır kaç kuyu hesaplar. Hesaplamak Toplama Orta kuyu başına 1 ml hücreleri tohum için gerekli.
    7. toplama ortamı hazırlayın. Tam Kardiyak Ortamına 10 ml başına BMP4 stok çözeltisi 0.5 ul (nihai konsantrasyon = 0.5 ng / ml) ve Y-27632 ROCK inhibitörü (son konsantrasyon = 10 uM) ilave edilir.
    8. inkübatör ve Santrifüj gelen hPSCs içeren konik tüp kaldırmakge 5 dakika 200 x g'de tüpü. Yıkama ortamı aspire ve ml başına 1.2 x 10 6 hücre yoğunluğunda agregasyon ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
    9. Mikro plakanın her bir PBS yıkama solüsyonu aspire. homojen bir şekilde dağılması ve de mikro plaka üzerindeki her bir hücre süspansiyonu tohumu 1 mi, P1000 micropipettor kullanılması. kuyu sayıda tohum, periyodik olarak çökelmeyi önlemek hücre süspansiyonu girdap.
    10. 5 dakika boyunca 200 x g'de plaka santrifüjleyin. Hücreler her kuyucuklarda altına bükülmüş olan onaylamak için mikroskop altında plaka uyun.
    11. % 5 CO2,% 5 O2 (hipoksik) kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe levhasını.

4. Kardiyak İndüksiyon Aşama 1

  1. birikmesini takiben bir gün (gün 1), (kuyu, hacim = 1 mi x sayıda 24 plaka için) Aşama 1 İndüksiyon ortamı gerekli hacmi hazırlar. tam 1 mlKalp endüksiyon ortamı, BMP4 stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 10 ng / ml) 1 ul, bFGF stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 5 ng / ml), 0.5 ul ve Aktivin A 0.6 ul (nihai konsantrasyon = 6 ng / mi). En az 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde orta yerleştirin.
  2. inkübatör Mikro plakasını sökün. mikroskop altında agrega kontrol edin. hemen sonrası santrifüj toplama ile karşılaştırıldığında, onlar düzgün kenarlara (daha yuvarlak ve önceki günden daha az bir kare) ile sağlam görünmelidir.
  3. mikro içindeki agrega bozmadan süpernatantı:
    1. Yatay seviyesini Mikro plaka tutun (yani., Eğim vermeyin). her bir mikro plaka için, kültür ortamı yüzeyinde ve de kenarına P1000 mikropipetöre ucu yerleştirin.
    2. Yavaş yavaş mikro altındaki agrega rahatsız etmemek için dikkatli olmak, orta kaldırmak. t azaltılmasından sonraDokulu mikro yüzeyinden yaklaşık 1 ila 2 mm de orta düzeyde yavaşça hacmi yeterince düşük bir kez sıvı hareketi büyük ölçüde azalır oyuk (bir tarafında orta toplamak için plaka eğme kaldırılmasına ve elde agrega önlemek için daha kolay ) bireysel mikro dışarı. Yavaş yavaş kuyuda kalan orta dışarı pipetle.
  4. agrega bireysel mikro kalır sağlarken taze Aşama 1 İndüksiyon Orta eklemek için: P1000 micropipettor ile Aşama 1 indüksiyon ortamı 1 ml çizin. Kuyunun içindeki kenarına doğru pipet tutun ve çok yavaş bir şekilde oyuk iç duvarına karşı orta dağıtın. Kalan Kuyular için tekrarlayın.
  5. 3 gün boyunca hipoksik koşullar altında inkübatör plaka dönün.

5. Kardiyak İndüksiyon 2. Aşama

  1. 4. günde, bir yerde, 15 dakika en az 37 ° C su banyosunda (kuyu hacim = sayısı x 2 mi) ortam yıkayın.
  2. (Nihai konsantrasyon = 10 ng / ml), VEGF stok çözeltisi 2 ul, tam bir kardiyak Ortamına ml'si başına 0.5 ul IWP-2: Aşama 2 Ortamı (Wells x 1 ml hacim = sayısı) gerekli hacmi hazırlanması stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 5 um). 15 dakika en az 37 ° C su banyosu içinde hazırlanmış Aşama 2 İndüksiyon ortamı yerleştirin.
  3. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, mikro levhanın her bölmesine agrega hasat ve konik tüp (15 mL tüp başına 10 kuyuları için toplama) 15 ml toplam süspansiyon toplamak.
  4. agregaların hipoksik kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca oturmasına izin verin.
    NOT: Bu adım bozulmamış agrega tek hücrelerin ve hücre artıklarının ayırmak için önemlidir.
  5. Kalıntı endüktif sitokinler çıkarmak için önceden ısıtılmış yıkama ortamı 10 ml agrega dikkatle süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon (örn Aktivin bir hatta çok düşük bir co güçlü bir sinyal molekülü olanncentrations).
  6. 2 dakika için 50 x g'de santrifüjleyin agrega. süpernatant aspire. önceden ısıtılmış İndüksiyon 2 Ortamda pelet agrega tekrar süspansiyon.
  7. oyuk başına 1 ml, 24-çukurlu ultra düşük bağlanma (ULA) plakaya toplam süspansiyon aktarın. üniforma, sıkı hücre kümeleri olarak mikroskop altında agrega uyun. 6. günde kadar hipoksik koşullar altında inkübe edilir.

6. Kardiyak İndüksiyon 3. Aşama

  1. 6. günde, Sahne 3 İndüksiyon Orta (kuyuların x 1 ml hacim = sayısı) gerekli hacmi hazırlayın. Tam Kardiyak Ortamına 1 ml için 2 | il VEGF stok solüsyonu (nihai konsantrasyon = 10 ng / ml) ve bFGF stok çözeltisi (nihai konsantrasyon = 5 ng / ml), 0.5 ul ekle. 15 dakika en az 37 ° C su banyosu içinde hazırlanan Aşama 3 uyarma ortamına yerleştirin.
  2. toplam 10 ml'ye kadar havuzu, 15 ml konik tüp agrega aktarmak için 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanıntüp başına s.
  3. agrega yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Süpernatantı aspire ve önceden ısıtılmış 3. Aşama İndüksiyon Ortamda agrega tekrar süspansiyon. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, oyuk başına 1 ml, 24-çukurlu ULA plaka içine agrega dağıtmak.
  4. günde 10, Evre 3 İndüksiyon Orta Kademe 6.1 uyarınca (kuyuları x 1 ml hacim = sayısı) gerekli hacmi hazırlayın.
  5. tüp için agrega 10 ml'ye kadar havuzu, 15 ml konik tüp agrega transfer etmek için, 5 ml serolojik pipet kullanın.
  6. agrega yerleşmek için 10 dakika bekleyin. Süpernatantı aspire ve Sahne 3 İndüksiyon Orta içinde agrega tekrar süspansiyon. 5 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, oyuk başına 1 ml, 24-çukurlu ULA plaka içine agrega dağıtmak.
  7. iki gün hipoksik koşullar altında inkübe edilir. 12. günde kültür süresinin geri kalanı (37 ° C,% 20 O2,% 5 CO2) için normoksik oksijen seviyesi hücrelerin inkübe edilmesi başlar.
    NOT:Bu zaman noktasından sonra, hücreler artık hipoksik koşullar altında kültürlenir.
  8. Bu tam orta alışverişini tekrarlayın hücre hasat kadar gün 14 başlayan her 4 günde bir, (6.2 ve 6.3 adımları) (tipik olarak, zirve kardiyomiyosit konsantrasyonları farklılaşma 14 gün sonra gözlenir).

Kardiyak Troponin T (cTnT) Microwell Kültür Çıktı İfade Frekans 7. Akım Sitometri Analizi

  1. şöyle agrega ayrıştırmaları:
    1. 15 ml konik tüp agrega 1 kuyusunu aktarmak için bir 5 ml serolojik pipet kullanın. 2 dakika süreyle 50 xg'de agrega Santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant aspire.
    2. agrega taze çözülmüş 1 mg / ml kollajenaz, Tip II çözeltisi 1 ml. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne toplam süspansiyon aktarın. gece boyunca, oda sıcaklığında kollajenaz tip II agrega inkübe edin.
    3. Ertesi gün, nazikçe agrega ayırmak için P1000 micropipettor kullanmakhomojen bir tek hücre süspansiyonuna aktarılmış. agregalar hali hazırda ayrışmadığı yoksa, agrega yerleşmek süpernatanı havalandırın, ve oda sıcaklığında 1 ila 2 dakika süre ile Ayrılma enzim 700 ul agrega inkübe edin. Yavaşça ayırmak P1000 micropipettor ile Agregalar 1 ila 2 kez pipetle.
    4. ayrılma enzimi seyreltilir: 1 mg / ml DNAz stok çözeltisi 14 ul ihtiva eden yıkama ortamı içinde 700 ul ekle. 2 dakika boyunca 300 xg'de bir tezgah üstü mıkro kullanarak kalan süspansiyon bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve santrifüj 10 ul örnek almak.
  2. bir hücre sayımı yapın: tripan mavi eşit hacimde 10 ul sayımı örnek boyama ve bir hemositometre kullanılarak sayılır.
  3. mikrosantrifüj kalan hücreleri içeren 1,5 ml'lik ependorf tüp çıkarın. Süpernatant aspire ihtiva eden Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi içinde 100 ul başına 200,000 ila 500,000 hücre konsantrasyonunda, hücrelerin tekrar süspansiyon% 2 cenin sığır serumu (HF).
  4. Her durum için, hücre süspansiyonu 100 ul başına oyuğa 96 oyuklu bir plaka (bir de cTnT antikoru ile boyanmış olacak ve ikincil antikor kontrolü olacaktır) 2 kuyu aktarın.
  5. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka santrifüj. Bir çok kanallı micropipettor ile süpernatantı.
  6. hücreleri saptamak: oyuk başına sabitleme çözeltisi (kit bileşeni) 200 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca plaka inkübe edin.
  7. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka santrifüj. dikkatle kuyulardan süpernatant çekilme çok kanallı bir micropipettor kullanın. Bir paraformaldehid atık kabına süpernatant bertaraf edin.
  8. İki kez sabit hücreleri yıkayın: her kuyuya HF 200 ul ekleyin. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka santrifüj. Süpernatantı aspire ve bir kez daha yıkama adımı tekrarlayın. Sabitlenen hücreler, 4 ° C'de HF bir haftaya kadar saklanabilir.
  9. Hücreleri permeabilize:
    1. 300 Plakayı santrifüj2 dakika boyunca xg.
    2. Her bir oyuğa besleyici çözeltiyi (kit bileşeni) 100 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe plakası.
    3. 2 dakika boyunca 300 xg'de plaka Santrifüj ve süpernatant aspire.
  10. Verilen bir sayısı için uygun konsantrasyonda HF anti-cTnT bir ana karışımı hazırlanması (uygun seyreltme titrasyon ile belirlenen ve tipik olarak 1 arasında değişmektedir gerekir: 500 ila 1: 2,000).
  11. Her durum (koşul başına 2 kuyu), bir kuyunun (lekeli örnek) ve diğer kuyu (sekonder antikor kontrolü) düz HF 100 ul ana karışımı 100 ul ekleyin. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe hücreleri.
  12. 2 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj. Süpernatantı aspire ve oyuk başına HF 200 ul ekleyin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
  13. ikincil antikor bir master karışımı hazırlayın. Bir her kuyu için 100 ul karşılık HF hacmini (sekonder antikor kontrolü aktarın vecTnT lekeli) ile muamele edilir. (: 200 dilüsyon 1) HF 200 ul başına keçi anti-fare-APC sekonder antikor 1 ul ekle.
  14. örnekleri Leke. Her bir oyuğa (sekonder antikor kontrolü ve anti-cTnT lekeli kuyu her ikisi de) boyama çözeltisi 100 ul ekle. 30 dakika süre ile 4 ° C'de (ışıkla ağartma bilmek fluorescent sekonder antikor ilave edildikten sonra kaplı plaka ya da karanlıkta tutun) karanlıkta inkübe hücreleri.
  15. 2 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj. Süpernatantı aspire ve oyuk başına HF 200 ul ekleyin. Bu yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
  16. Analiz tüpleri sitometresinde 5 ml yuvarlak dipli akışı örnekleri aktarın ve enstrüman 19 için standart protokolleri kullanarak APC kanalında sinyal flow sitometri gerçekleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hPSCs boyutları kontrollü gruplar etkili sadece var olan hücre konsantrasyonu ve mikro yüzey alanına bağlı mikro sistemi kullanılarak oluşturulabilir. Kısa bir santrifüj ardından, hücrelerin uygun sayılar (Bu protokol 1000) her mikro (Şekil 1A) bir araya getirilir. Önemlisi, bu hücreler 24 saat içinde hücre içi bağlantıları yeniden ve artık iyi doldurmak gerekir, ancak düzgün kenarlara (Şekil 1B) ile kompakt agrega olarak görünür. Bu büyüklükler bir kalp kaderi yönünde daha fazla farklılaşması için başlangıç ​​maddeleri sağlar. Hücreler sıkı kümeleri oluşturmak için başarısız olursa, bu mümkün hücre ayrılma ve reaggregation aşağıdaki ölüm ve muayene edilmelidir belirli bir hücre hattı için tek bir hücre pasajı ve ROCK inhibitörü konsantrasyonları uygunluğunu göstermektedir. mikro aşağıdaki üç gün toplam morpho çok az değişiklik gösterirlogy bazı büyüme belirgindir da mümkündür. Mikro kaldırılır zaman, agrega onların yuvarlak, sıkıca paketlenmiş morfoloji korumak ve birbirlerine (Şekil 1C) benzer bir büyüklükte olmalıdır. ULA 24 oyuklu plakalar içinde kültür ayrıca hücre genişlemesi ve büyümeleri için uygun olacaktır.

Günde 8 ile, ilk Aktivin sinyalizasyon ve Wnt inhibisyonu maruz kaldıktan sonra, agrega büyük ve parlak agrega (Şekil 1D) olarak görünmeye başlayacaktır. Bu süre boyunca, önemli ölçüde hücresel kalıntı her bir kuyunun altındaki belirgin ve agregalar ortamını çıkarmadan önce yerleşmeye izin vererek çıkarılmalıdır. Bazen, çok agrega birlikte sigorta olacaktır. Bu "Super agregalar" küçük agrega ile görülen morfolojik değişiklikler sergileme eğilimi ve tam farklılaşma geçmesi daha az olmasına rağmen bu, oyuk diğer agregaların farklılaşmasını inhibe olmaz.

fo "jove_content": keep-together.within-page = artan boyutta ve organize lifli bölgelerin görünümü ile agrega için önemli morfolojik değişikliklerin "1"> Devam farklılaşma sonuçları. 12. günde, sözleşme agregalar gözlenebilir. Bunlar her zaman büyük, şeffaf hücrelerden kadar yapılabilir ve genellikle agrega (Şekil 2) dışında geniş hücre dışı matriks içerecektir. agrega geniş kasılmalar başarılı bir farklılaşma işaret ederken, kardiyak markör ifade de sözleşme görünmüyor agrega görülebilir. Agrega ve immunolabeling ayrışmasından sonra, hücrelerin çoğunluğu flow sitometri kardiyomiyosit işaretleyici cTnT (Şekil 3) için olumlu olacaktır. Bu markör ekspresyon hücrelerinde stabil olan ve en geç farklılaşma 19. günde olduğu agrega gözlenebilir.

1.jpg "/>
Şekil 1: hPSC Timeline kardiyak kaderi doğru ayırt hemen toplama sonra, hücreler neredeyse her kuyu (A) doldurun.. Bir gün sonra, agrega yoğunlaştırılmış görünür ve pürüzsüz (B). Bu morfoloji agrega mikro çıkarılır ve kuyucuğu (C) içine kaplama bile devam eder. 8. günde ile, agrega genişletmek başlar ve renk (D) 'de daha açık. Ölçek çubuğu:. 250 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-1
Şekil 2:. Kardiyak İndüksiyon 3. Aşama Ortamda altı gün, güçlü agrega çapında kasılmalar gözlendi sonra Büyüklükleri (Günün Farklılaşma 12 ile üst paneli Müteahhitlik başlayın: relaxation, orta panel: daralma). alt panel siyah ya da beyaz (ok başları) olarak görünen en önemli farklılıklar, üst ve orta panelleri çıkarılmasıyla elde edilir. Ölçek çubuğu:. 250 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3:. Günün 17 At Farklılaştırılmış hPSCs Kardiyak Troponin T immunolabeling, hücrelerin en akış sitometri (dolu histogram) tarafından kardiyak troponin T olumludur. Ayrıca tek başına sekonder antikor (doldurulmamış histogram) ile boyandı hücrelerdir gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent kök hücrelerin etkili kalp farklılaşma çok değişken bir süreç olduğu gözlenmiştir. Farklı hücre çizgileri, belirli hücre tiplerine farklılaşma kapasitesi farklı eğilimleri gösteren şaşırtıcı değildir, kalp farklılaşma verimliliği aynı hücre hattı 6 kullanarak çalışır tekrarında arasında önemli ölçüde dalgalanır gözlenmiştir. Burada açıklanan protokol doğrudan agrega başına giriş hücre sayısını kontrol ederek bu değişkenliğin bir ana kaynağını giderir. Daha çalışır arasındaki değişkenliği en aza indirmek için, tek bir hücre geçiş için adapte hPSC hatları pluripotense markerlerinin ifadesi frekanslar için (ör Oct4, Nanog göre daha tutarlı bir pluripotent popülasyonlarda hPSC genişletme ve bakım sonuçlarının bu form olarak kullanılması tavsiye edilir Tra-1-60, vb.).

Burada yazıldığı gibi protokol o için 1000 hücre toplu bir boyutunu belirtirHES-2 embriyonik kök hücre hattından ptimal kalp indüksiyon. farklı hücre hatları için bu protokolü uygulamak için bir başlangıç ​​agrega boyutu ekran hücre çizgisi özgü optimum agrega boyutunu belirlemek için yapılması önemlidir. doğrudan burada takip edilecek prosedürler etkilemez iken, biz oksijen sunumunu etkilemesi beklenen agrega boyutu ve genel hücre yoğunluğundaki değişiklikleri okuyucuya hatırlatmak. Bu aşağı uygulamalarda bir husus haline gelebilir. Buna ek olarak, apoptotik hücre ölümü tek hücrelere hPSCs ayrışma sırasında husustur. Nedenle, bu ROCK inhibitörü mikro zorla hücre toplama sırasında mevcut olmasını sağlamak için önemlidir. Son olarak, farklılaşma günde 4 agrega önce iyice İndüksiyon 2 Ortamında tabanda için İndüksiyon 1 Ortamda mevcut iz Aktivin A, uzaklaştırmak için yıkanır olması önemlidir. farklılaşma 4 gün sonra, Aktivin bir mezo pahasına endoderm farklılaşmasını teşvikderi indüksiyon 20.

Bu tekniğin ana uygulama etkili kalp farklılaşmasını teşvik yığın ebatları ekrana. Bununla birlikte, mevcut tekniğin sınırlamaları biri, mikro plakaları kullanılarak klinik olarak önemli seviyelere kardiyak üretim ölçekli zorlu olmasıdır. Kalp farklılaşma ölçeği kadar, tipik olarak karıştırılan süspansiyon biyoreaktörlerde 21 toplu kültür koşullarında gerçekleştirilir. Mikro sistemi verimli kalp indüksiyon agrega boyutu kabul edilebilir aralıkları belirlemek için kullanılan edildikten sonra nedenle, büyütmek için bir sonraki adım istenilen hücre agrega boyutu üretebilir biyoreaktör pervane hızlarını tespit etmektir.

toplam bazlı kardiyak farklılaşması için diğer yöntemlere göre bu tekniğin önemli farklardan biri, bu agrega endojen sinyalizasyon etkilerini modüle içine yanı sıra doğrudan soruşturma sağlamasıdırtoplam 13, hPSCs endüktif / inhibitör doku tiplerinin CO-kültürü. soruşturmaların Bu tür büyük ölçekli kardiyak üretim süreci geliştirme bilgilendirebilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.U.'nun temeldeki mikro kuyu teknolojisinde finansal çıkarı var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün laboratuvarında geliştirildiği Dr. Peter Zandstra'ya ve bu sürecin dayandığı ilk yöntemlerin oluşturulmasında yardımcı olan Dr. Mark Gagliardi ve Gordon Keller'a teşekkür ederiz. Protokol geliştirme, CB'ye Ontario Bilim ve Teknoloji Yüksek Lisans Bursu ve Ontario Kalp ve İnme Vakfı'ndan Peter Zandstra'ya bir hibe ile desteklendi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biyolojik güvenlik kabini
Pipet yardımcısı
Serolojik pipetler (5 ila 25 ml) 
Aspiratör Aspiratör
veya Pasteur pipetleri
15 ve 50 ml konik tüpler
Çeker ocak
0.22 &mikro; m şırınga filtresi
% 5 CO2< / sub>,% 5 O2< / sub>< / sub> ve nem kontrollü hücre kültürü inkübatörü ve nbsp;Hipoksik (düşük oksijenli) inkübatör
%5 CO2, %20 O2 ve nem kontrollü hücre kültürü inkübatörü 
Bir plaka tutucu ile donatılmış sallanan bir kova rotoruna sahip düşük hızlı santrifüj 
P2, P20, P200 ve P1000 mikropipetleyiciler ve ilgili uçlar 
4X, 10X ve 20X faz objektifli ters mikroskop 
Ultra Düşük Bağlantı (ULA) 24 kuyulu plakalar Corning/Costar3473
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri
Tezgah üstü mikrosantrifüj
L-Askorbik AsitSigma-AldrichA4403
Steril Ultra saf damıtılmış suSigma-AldrichW3500
Vorteks
Buz
-20 derece & derece; C dondurucu
MonotiyokliserolSigma-AldrichM6145Toksik; Tekrarlanan açılma nedeniyle oksidasyonu en aza indirmek için MTG'nin kesilmesi şiddetle tavsiye edilir. Alikotlar 4 derecede saklanabilir; 3 aya kadar C, -20 &°C; Uzun süreli depolama için C önerilir.
StemPro-34 OrtaThermo Fisher Scientific10639-011Bazal Kardiyak İndüksiyon Ortamı; Ek -20 ° C'de saklanır; C ve 4 &°C'de bazal ortam.
TransferrinRoche10652202001
BMP-4Ar-Ge D Teknolojileri314-BP
bFGFAr-Ge D Teknolojileri233-FB
VEGFAr-Ge D Technologies293-VE
Activin A Ar-Ge D Technologies338-AC
IWP-2Reaktifler Doğrudan57-G89
Fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific14190
Sığır Serum Albümini (BSA)Thermo Fisher Scientific15561
Hidroklorik asit ve nbsp;Sigma-Aldrich258148Aşındırıcı
Dimetilsülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660
100x Penisilin / StreptomisinThermo Fisher Scientific15140
100x L-glutaminThermo Fisher Scientific25030
Nakavt Serum DeğiştirmeThermo Fisher Scientific10828010
TrypLE SelectThermo Fisher Scientific12563Ayrışma enzimi
Hemositometre
Tripan Mavisi
Aggrewell 400 plakaKök Hücre Teknolojileri27845Microwell Plakaları
Aggrewell Durulama SolüsyonuKök Hücre Teknolojileri7010Mikro Kuyu Durulama
Çözeltisi Y-27632 ROCK İnhibitörüTocris1254
Kollajenaz Tip IISigma-AldrichC6885 ve nbsp;
Hank'in Dengeli Tuz ÇözeltisiThermo Fisher Scientific14025092
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher Scientific12483
96 kuyulu plaka (FACS boyama için)
Intraprep Geçirgenleştirme ReaktifiBeckman CoulterIM23892 parçalı kit: Fiksasyon Çözeltisi ve Geçirgenleştirme Çözeltisi; Toksik
cTnT antikoruNeobelirteçleri MS-295
keçi anti-fare-IgG APC antikoruThermoFisherMoleküler ProblarA865
5 ml yuvarlak alt akışlı sitometri tüpleriFACS makineye bağlı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wintermantel, E., et al. Tissue engineering scaffolds using superstructures. Biomaterials. 17, 83-91 (1996).
  2. Lazar, A., et al. Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver. Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).
  3. Sachlos, E., Auguste, D. T. Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation. Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).
  4. Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).
  5. Steinberg, M. S. Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells. J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).
  6. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).
  7. Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation. Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).
  8. Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, 1601-1603 (2005).
  9. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).
  10. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PloS One. 3, e1565(2008).
  11. Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).
  12. Ungrin, M. D., et al. Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics. Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).
  13. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  14. Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).
  15. Markway, B. D., et al. Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures. Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).
  16. Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).
  17. Wallace, L., Reichelt, J. Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).
  18. Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. Phenotypic analysis of human embryonic stem cells. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).
  19. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. JoVE. , e52010(2014).
  20. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).
  21. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac DifferentiationHuman Pluripotent Stem CellsMicrowell AggregationAggregate Size ControlHypoxic IncubationFlow CytometryCardiac Troponin TStage Induction MediumUltra Low Attachment PlateParacrine Signaling

Related Articles