Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Özet

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında ²⁺ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Özet

Yumurta aktivasyonu, döllenmiş yumurtanın mayoz bölünmeyi tamamlamasına ve embriyonik gelişimi başlatmasına izin vermek için bir dizi olay içeren evrensel bir süreçtir. İncelenen tüm organizmalarda korunan yumurta aktivasyonunun bir yönü, genellikle 'Ca^{2 +} dalgası' olarak adlandırılan hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki (Ca^{2 +}) bir değişikliktir. Ca²⁺ dalgasının salınım hızı ve sayısı türler arasında farklılık gösterse de, hücre içi Ca^{2 +} 'daki değişim, embriyonik gelişim için gerekli olayların meydana gelmesinde anahtardır. Bu değişiklikler arasında hücre döngüsünün yeniden başlaması, mRNA regülasyonu, kortikal granül ekzositozu ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi yer alır.

Olgun Drosophila yumurtasında, döllenmeden önce dişi yumurta kanalında aktivasyon meydana gelir ve bir dizi Ca^{2 +} 'ya bağlı olayı başlatır. Burada Drosophila'daki Ca²⁺ dalgasını görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca²⁺ dalgasının mekanizmasını ve bununla ilişkili aşağı akış değişikliklerini sorgulamak için manipüle edilebilir bir model sistemi sağlar.

Giriş

Yumurta (oosit) aktivasyonu A hücre içi Ca değişim ²⁺ konsantrasyon tüm çalışılan organizmaların ^1,2 korunmuş bir bileşenidir. Bu olay, hücre döngüsü yeniden başlatılması ve depolanan mRNA çevirisi de dahil olmak üzere, Ca ^{2 +} -bağımlı süreçler, geniş bir yelpazede başlatır. Nedeniyle hücre içi Ca ^{2 +} konsantrasyonlarda geçici değişiklikler görselleştirme Ca ²⁺ için bu şartı, anahtar ilgi olmuştur.

Tarihsel olarak, Model canlılar kendi yumurta büyüklüğüne ve durumuna bağlı olarak yumurta aktivasyonu üzerinde çalışmalar için seçildi. Çeşitli görselleştirme yaklaşımlar da dahil olmak üzere, bu sistemlerde ^{2 +} konsantrasyonları takip ve hücre içi Ca değişiklikleri ölçmek için kullanılmıştır: Medaka balık ³ photoprotein aequorin; Böyle Fura-2 deniz kestanesi ve hamster ^4,5 gibi ca ²⁺ duyarlı floresan boyalar; ve kalsiyum-yeşil 1-dekstran Xenopus ^6.

Üretim ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) iyileştirilmesi vivo ⁷ Ca ^{2 +} dinamiklerini görselleştirmek için yeteneği dönüştürdü. Bu genetik yapılar belirli dokularda ifade ve invaziv doku hazırlıkları ⁸ ihtiyacını sınırlamak vardır.

GCaMPs nedeniyle yüksek Ca ^{2 +} afinite çok etkili olmuştur Geçiş yeşil flüoresan proteini (GFP) merkezli sınıf, sinyal-gürültü oranı ve kapasite ^9-11 özelleştirilmesi için. Ca ^{+ 2} varlığında, GCaMP kompleksi, kalmodulin Ca ²⁺ bağlanması ile başlayan yapısal bir dizi değişiklik maruz GFP bileşen ⁹ artmış floresan yoğunluğu ile sonuçlanır.

GCaMPs yoğun hücre içi Kalsiyum ¹² değişiklikleri görselleştirmek için Drosophila nöronlar üzerindeki araştırmalarda kullanılmıştır. son UygOlgun Drosophila yumurta ²⁺ Ca görselleştirmek için GCaMP teknoloji yumurta aktivasyonu ^13,14 tek bir geçici Ca ^{2 +} dalga ortaya koymuştur. Ca ^{2 +} dalga bir ex vivo aktivasyon tahlil ^13,14 kullanarak in vivo ¹³ yumurtlama sırasında ya da daha yüksek büyütmede düşük büyütme görülebilir. Ex vivo deneyde, tek tek, olgun oosit överlerden izole edildi ve hipotonik bir solüsyon kullanılarak çalıştırılır, in vivo aktive ^15-17 olaylarını özetlemek gösterilmiştir aktivasyon tamponu olarak anılacaktır.

Bu ex vivo deney farmakolojik bozulma, fiziksel manipülasyonlar ve genetik mutantlar dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında Ca ^{2 +} dalganın kolay yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar. Bu makale ex vivo aktivasyonu ve th için olgun Drosophila yumurta hazırlanmasını göstermektedirGCaMP kullanarak Ca ^{2 +} dalga görselleştirmek için kullanılan e sonraki mikroskopi. Bu yaklaşım Ca ^{2 +} dalganın başlaması ve kontrolünü test etmek ve alt sonuçlarını araştırmak için kullanılabilir.

Protokol

Not: Aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın.

1. Diseksiyon için hazırlanıyor

Not: Burada anlatılan adımlar E. Gavis, Princeton Üniversitesi'nden & Weil et ile uyumludur. ark. ^18. görüntüleme önce aşağıdaki adımları iki gün uygulayın.

1. Katı gıda yaklaşık 10 ml ihtiva eden bir uçucu şişeye alın ve bir köşede kurutularak maya küçük bir miktar eklemek, 1 g yeterlidir.
   Not: sinek şişeleri ya da gıda hakkında bilgi 'Drosophila Bakım' ¹⁹ için bkz.
2. maya hidrat 3 damla su - 1 eklenir.
3. 45 ° açıyla kenara flakon ayarlayın ve 3 izin - su almak için maya için 5 dk.
4. Maya su emici olsa da, (en son ortaya çıkmıştır ki (GCaMP5 olarak da adlandırılır), bir myristoy küvet-VP16GAL4 tahrik UASt- MYR GCaMP5 ²⁰ eksprese eden sineklerin bir şişe seçinGCaMP5 arasında yonunun formu) yumurta membrana Geci cepheye ile gürültü oranı yüksek bir sinyal sağlamak için seçilmiştir.
5. CO ₂ gazı ile şişe içinde sinekler Anesteziyoloji. Islak gıda sinekler kaybetmek olmayacak şekilde ters şişe tutmak için emin olun.
6. CO ₂ ped üzerine anestezi sinekler İpucu ve sıralama 10-15 kadın ve bir mikroskop altında bir fırça kullanarak 5 erkek. Not: diseksiyon için sağlıklı kadın temin etmek erkekleri kapsayacak şekilde standarttır.
7. Adım 1.3 şişe hazır olduğunda, flakon seçilen sinekler ekleyin. sinekler aktif hale gelene kadar şişe yatay tutmak için özen gösterin.
8. Yaklaşık 36 saat boyunca 25 ° C'de şişe yerleştirin.
9. Şişe veya ıskarta CO ₂ pad kalan sinekler dönün.

2. Diseksiyon Drosophila Ovaryumlar

Not: Burada tarif edilen adımlar, Weil ve diğerleri ile uyumludur. ark. 18 kadar.

1. 36 saat sonra, CO ₂ ile mayalı flakonundan sinekler uyuşturan.
2. Flakon içindeki sinekler CO ₂ ped üzerine bunları İpucu anestezi sonra bir mikroskop altında bir boya fırçası ile sıralanacak.
3. Bir kadın seçin.
4. kadın iki yumurtalıklar izole edin. Tam detaylı protokol için Weil bakınız. ark. ^18. Özetle:
   1. No. 1.5, 22 x 40 mm örtücü kısım üzerine oksijenli halokarbon bir yağ (Seri 95) küçük bir damla koyun.
   2. Karın anterior forseps ile dişi kavrayın.
   3. Diseksiyon mikroskobu altında kadın tutarak, yavaşça dişinin posterior kaldırmak için forseps ikinci seti kullanın.
   4. İkinci forseps posterior doku siliniz.
   5. Karın posterior anterior ikinci forseps ile karın boşluğuna sıkın. İki opak yumurtalıkların zaman FEMA dışında forseps ayrılmamak gerekirle.
   6. yağın içine yumurtalıklar dokunun.
   7. forseps kapalı silerek forseps herhangi bir doku çıkarın.
   8. bir sinek, üç lamelleri elde etmek için her içeren yumurtalık - Bu adımları (2.4.7 2.4.1) tekrarlayın.

3. Ayırma Bireysel Olgun Yumurta

1. Adım 2.4 ilk lamel, 4X ayarlanmış büyütme ile standart bir mikroskop altında, yumurtalık yırtarak iki yumurtalık ayırın.
2. herhangi bir yumurta odaları delinme özen tek yumurtalık merkezi haline kapalı forseps bir çift tanıtmak.
3. Bir sonraki kapalı forseps yumurtalık merkezine standart bir diseksiyon probu yerleştirin.
4. Yavaşça olgun yumurta (evre 14 yumurta odaları) bulunduğu arka kutup, doğru yumurtalık yoluyla diseksiyon prob sürükleyin.
5. Tekrar 3.1 adımları - 3,4 2-5 kat yumurtalık ve yumurta sayısı boyutuna bağlı olarak değişir.
   Not: _CO2 ilavesi tipik önceden yatırılan yumurtalardan daha yükseltilmiş dorsal uzantıları ile büyük görünecek tek bir yumurta birikimi neden olur. Zaten kadın içinde aktif beri Bu yumurta görüntüleme için atılmalıdır.
   Not: Olgun yumurta yumurtalık bağ dokusu kolayca ayırmak için muhtemeldir.
6. Hiçbir olgun yumurta yumurtalık dışında görünür durumdaysa, diseksiyon prob ile alay yavaşça devam ediyor.
7. lamel merkezinde bir çizgi 5 - olgun yumurta yumurtalık dışında lamel görünür olduğunda, 3 manevra.
   Not: En iyi sonucu elde etmek için, yumurta kenarı boyunca yavaşça prob çalıştırın.
   Not: Bu yumurtayı zarar verebileceği dorsal uzantıları çekerek kaçının.
   Not: Gelecekteki görüntüleme set-up bağlı olarak maksimum görüntüleme alanı için lamel dik yaklaşık 200 mikron ayrı yumurta hizalayın.
8. hizalanmış sonra, f kullanılarak hizalanmış yumurta uzağa sürükleyerek yumurtalık dokusunun geri kalanını kaldırmakorceps.
9. Tıbbi silme köşesinde ile dabbing fazla yağı çıkartın. Tıbbi kaybolur temas gibi olgun yumurta silin olgun yumurta dokunmamaya özen gösterin.
10. mikroskop altında örnek bulma basitleştirmek için bir işaretleyici ile lamel bir crosshair çizin.
11. güvenli bir yerde lamel ayarlayın ve 5 için dinlenmek için lamel hazırlanan yumurta odaları bırakın - 10 dakika. Yumurta yağda yerleşmek için bu izin verir. Numuneler 1 saat sonrası diseksiyonu kadar kullanılabilmektedir.
12. onlara yumurtalıkların ile lamelleri geri kalanı için 3.11 - Tekrar 3.1 adımları.

4. Görüntüleme için hazırlanıyor

1. Oda sıcaklığına hazırlanan aktivasyon tamponu ¹⁵ getirin.
   Not: aktivasyon tamponu hipotonik tampon maddesi olup: 3.3 mM NaH ₂ PO _4, 16.6 mM KH ₂ PO _4, 10 mM NaCI, 50 mM KCI, bir 1 ile pH 6.4'e getirildi, 5% polietilen glikol 8000, 2 mM _CaCl2,: NaOH 5 oranı: KOH.Daha fazla bilgi için Mahowald, 1983 ^15. Aktivasyon tamponu alikoları en fazla 2 hafta içinde C ay boyunca 4 ° C'de -20 ° C'de saklanabilir.
2. Dikkatle görüntüleme tesisine hazırlanan lamelleri, aktivasyon tampon ve cam pipetler taşıyın.
   Not: Bir geniş alan, konfokal, eğirme disk veya hafif levha mikroskop kullanılabilir. Biz ters bir mikroskop kullanılarak öneririz. Bizim Örnek sonuçlar konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir.
3. tüm olgun yumurta görüntüleme için uygun bir hedef (burada: 20X 0.7 NA) seçilmelidir.
4. Mikroskop sahneye ilk hazır lamel monte edin. Sahnede lamelleri kırmamaya özen gösterin.
5. Kalitatif aktivasyon için olgun bir yumurta haznesi ile bir görüş alanı seçin. Görüntü delinmiş yumurta odaları veya zarında blebbing olanlar etmeyin.
   Not: adımlar 4.6 için - 4.7, yazılım komutları mikroskop ve üreticiye bağlı olarak değişir.
6. Set görüntüleme para(- 580 ila 500 nm) standart GFP uyarılma (488 nm) ve emisyon metre. Ayrıca olgun yumurta ve yerinden yağ görselleştirmek ve yönlendirmek amacıyla bir aydınlık alan görünümü kurdu.
7. Tam Z-yığını olgun yumurta görünür düşük Z-düzlemini seçin ve ayarlayın adım başı 40 mikron yaklaşık 2 mikron için alınacak. Z-yığını edinimi arasında hiçbir gecikme yok yani parametreleri ayarlayın. Yaklaşık 30 dakika boyunca yakalamak için zaman serisi ayarlayın.

5. Görüntüleme Ex Vivo Yumurta Aktivasyon

1. görüntü yakalama başlatın.
2. 2 tam Z-yığınlar elde edilecek - 1 bekleyin. Bu aktivasyon öncesinde olgun yumurta gösterir.
3. Bir cam pipet içine aktivasyon tampon yaklaşık 300 ul çekin.
4. olgun yumurta görüntülü doğrudan yukarıda kadar lamel üzerinde 45 ° 'lik açıyla aktivasyon tampon içeren cam pipet ucu konumlandırma, yavaş yavaş ışın yoluna pipet hareket ettirin. Cam pipet gerekirBu yağ, 2 cm - 1 olabilir.
5. cam pipet en fazla 5 saniye içinde aktivasyon tamponu 2 damla - 1 eklenir. Bu yağ yerinden gerekir. aşırı aktivasyon tampon ekleyerek veya olgun yumurta değiştirmesine neden olabilir cam pipet ile yumurta dokunmaktan kaçının. Bu amaç ve lamel arasındaki immersiyon oluşturmak için odak düzlemi veya hava kabarcıkları bir değişiklik neden olabilir pipet ile lamel dokunmamaya özen gösterin.
6. görüntü alımı sırasında aktivasyon tampon ekleyerek iken, yağ aktivasyon tampon yerinden edilmiş olmasını sağlamak için parlak alan kanalı kontrol.
   Not: Bu ilk nedeni ışın yolu kırma pipet bir gölge olarak görünür ama aynı zamanda küçük yağ damlacıkları görünümünü neden olacaktır. Bazı yağ damlacıkları deneysel sonuçları ve görüntü kalitesini etkiler olgun yumurta ile ilişkili kalabilir.
7. 5 - Yağ aktivasyon tampon tekrar ilk ilavesiyle yerinden değilse 5.4 adımları0,6.
8. Yağ başarıyla yerinden sonra, zaman serisi tamamlanana kadar çalışmasına izin verin.
   Not: aktivasyonu oosit şişlik, bazı yumurta odaları aktivasyon tampon ilavesi üzerine odak düzlemi veya görüş alanının dışında önemli ölçüde hareket edecektir nedeniyle. Bu durumda, satın durdurmak ve bir sonraki lamel monte edin.
9. görüntü sırası alımını tamamlandıktan sonra, verileri kaydetmek.

6. Post-satın alma Görüntü İşleme

1. Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) veya eşdeğer görüntü işleme yazılımı kullanarak veri seti açın ve analiz için ilgili dosyaları seçin.
2. elde edilen verilerin bir projeksiyon oluşturmak için seçin: Image> Yığınlar> Z proje.
3. Bir başlangıç ​​Z-dilim ve bir stop Z-dilim, genellikle bütün bölümünü seçin. tipik 'Maksimum Şiddeti' olarak ayarlanmış bir projeksiyon türü seçin. dizi için seçilen ayarları uygulamak için onay kutusu 'Tüm Zamanların Çerçeveler' kontrol edin.
4. EğerBirden fazla floresan kanal kompozit yapmak, renkler arasındaki hareketi sağlamak için Kanallar aracını kullanın ya da görüntü gri tonlama yapmak, görüntülenmiştir edilmiştir. Resim Seç> Renkler> Kanallar aracı.
5. Görüntü parlaklığını ayarlamak basıp Görüntü kontrast>> Parlaklık / Kontrast ayarlama için.
6. tek bir görüntü vermek için, ilgili çerçeve ve Dosya> Farklı Kaydet> JPEG, ya da herhangi bir tercih edilen biçimine zaman ölçeği kaydırıcıyı hareket ettirin.
7. Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin.
   görüntüleme yazılımından kare hızını Not resmin üzerine bir zaman damgası vermek için gerekli olacaktır.
8. bir film olarak zaman serisini vermek için seçin: Dosya> Farklı Kaydet> AVI, sonra (~ saniyede 7 kare) kare hızını seçin.
9. Verilen dosya için bir konum ve başlık seçin, ardından kaydedin.
10. Fiji formatında düzeltilmiş dosyayı kaydetmek için, Dosya> Kaydet.

Sonuçlar

Burada ex vivo aktivasyonu için olgun Drosophila yumurta nasıl hazırlanacağını göstermiştir. ²⁺ dinamikleri yumurta aktivasyonu Ca bir GECI sağlayacak görüntüleme ve embriyonik gelişim başlangıcı (Şekil 1) ifade yumurta. GCaMP bağlı özellikle miristoil grubunun varlığı sonuçları hafif niteliksel farklılıklar ^{13 14} sahip olabilir, kullanılan not edilmelidir. Ayrıca aktin polimerizasyon inhibitörünün eklenmesiyle yumurta aktivasyonu sırasında fonksiyonel aktin rol göstermiştir, cytochalasin D, aktivasyon tampon (Şekil 2) ^14.

Yumurta aktivasyonu hücre iskeletinin için bir gereklilik korunur. C. elegans, gübreleme sonrasında iskelet parçaları ilk asimetrik bölünme ^21,22 için tek hücreli embriyo hazırlamak için yeniden düzenlenir. cytoskele deniz kestanesi olarak, bozulmaaktivasyon aşağıdaki tal yeniden organizasyon kasılma halka oluşumunu ²³ önleyerek hücre döngüsünü etkilediği gösterilmiştir. Ca ^{2 +} dalga ve Drosophila yumurta aktivasyonu onun aşağı fonksiyonunu aracılık aktin rolü tam olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir.

Drosophila olarak, Ca2 ⁺ ve dalga aktin hücre iskeletinin co-görselleştirme bu ex vivo aktivasyon tahlili kullanılarak elde edilebilir. Birden fazla kanal Zaman serisi elde edilebilir ve hücre içi Ca ²⁺ dinamikleri oosit (Şekil 3) aktin organizasyonu değişiklikleri ile uyumlu olabilir.

Şekil 1:. Ex vivo Drosophila Yumurta Aktivasyon Süresi serisinde Tek Ca ²⁺ Dalga a aşağıdaki UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunaktivasyon tamponu (AH) ve Ayrıca bu yöntem. Sitoplazmik Ca ^{+ 2} artış yaklaşık 1.5 mm / sn arasında bir ortalama hız ile arka kutup (B) ve düzende (BF) de kaynaklanır. dalga başlatılması tipik olarak aktivasyon tamponu ilave 3 dakika içinde görülmektedir. Aktivasyondan sonra, olgun yumurta hücre içi kalsiyum seviyeleri seviyeleri (G, H) etkinleştirme öncesi geri döner. tamamlayıcı filmi 1 (toplam süresi 33 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Aktivasyon Tampon bozan Ca Sitokalasin D ilavesi²⁺ dalga yayılımı. Ex vivo zaman serileri 10 ug / ml sitokalasin D nihai konsantrasyon (AH) ihtiva eden aktivasyon tamponu ilave edildikten sonra UASt- myrGCaMP5 ifade Drosophila yumurta olgunlaşması. Ca ^{2 +} dalga arka kutup (A) başlatılır iken, o tehlikeye ve yumurta (F) anterior bulmuyor (beyaz ok başları dalga ön göstermek). Daha başka Ca ²⁺ değişiklikleri), 30 dakika boyunca gözlenmiştir. tamamlayıcı filmi 2 (toplam süresi 30 dk) bakınız. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: E'de Aktin ve Ca ²⁺ Co-görselleştirmeex vivo Drosophila. Zaman serisinde gg Aktivasyon UASt- myrGCaMP5 (Mavi) ve UASP -F-Tractin.tdTomato (Eflatun) aktivasyon tamponu aşağıdaki ek (AH) ifade Drosophila yumurta olgun. Ca ^{2 +} dalga arka kutup başlatır ve Şekil olarak kurtarır 1. Aktin, beyaz ok ucu (H vs A) zamanla değişiyor gibi görünüyor. Olgun yumurta merkezinde Ca ^{2 +} sinyal tespiti olmaması görüntü yakalama sırasında numunenin hareketine bağlıdır. Ölçek çubukları 50 mikron =. Maksimum projeksiyon 40 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu protokoldeki ilk kritik adım, olgun yumurtaların zarar görmeden izole edilmesidir. Bu, diseksiyon probu ile yumurtaların gentil manevrası ile elde edilebilir. Uygulama, bu manipülasyonun yumurtalara zarar vermeden gerçekleştirilmesini sağlayacaktır. İkinci önemli adım, yağdaki olgun yumurtaya aktivasyon tamponu uygulandığında numune kaybının önlenmesidir. Aktivasyon tamponunun uygulanması yavaş ve lamel ile temas etmeden yapılmalıdır. Mikroskop kurulumu numuneye kolay erişime izin vermiyorsa bu adım zor olabilir. Mikroskobun sıcaklık inkübatörü gibi aksiller kısımlarının hareket ettirilmesi tavsiye edilir.

Yumurta aktivasyonunda^Ca2+ yerine floresan etiketli diğer faktörleri görselleştirmek için bu protokolde değişiklikler yapılabilir. Daha genel olarak, Drosophila gelişiminin farklı aşamaları veya farklı bir tampon eklemenin sonuçları bu protokol kullanılarak analiz edilebilir.

Mikroskoptaki ayarlar numuneden gelen sinyali görselleştirmek için uygun değilse sorun giderme gerekebilir. Bu, lazer gücünü artırarak veya azaltarak, yakalama aralığını değiştirerek ve Z-yığını parametrelerini ayarlayarak başarılabilir. Diğer bir sorun, aktivasyon tamponunun eklenmesiyle yumurtaların sürekli olarak görüş alanının dışına çıkması olabilir. Bu düzenli olarak gerçekleşirse, olgun yumurtaların 15 ila 20 dakika gibi daha uzun bir süre lamellere yerleşmesine izin verin. Daha yüksek viskoziteli bir yağ kullanmanın, yağın aktivasyon tamponu ile yer değiştirmesini değiştireceğine dikkat edin.

Burada sunulan bu teknik, objektifin çalışma mesafesi, olgun yumurtaların dehidrasyonu ve olgun yumurtaları zarar görmeden diseksiyon yeteneği ile sınırlıdır. Bununla birlikte, olgun oositin yetişkin dişiden geçtiği ve biriktirildiği in vivo görüntüleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında ¹³, yöntemimiz daha fazla uzamsal çözünürlük, olgun yumurtayı aktivasyondan önce fiziksel olarak manipüle etme seçeneği ve döllenme olmadan yumurta aktivasyonunun rolünü test etme yeteneği sağlar.

Yumurta aktivasyonunda hücresel bileşenler için raportör yapılarının test edilmesi ve^Ca2+ dalgasının mutant arka planlarda ^14,24 görselleştirilmesi de dahil olmak üzere, bu tekniğin gelecekteki birçok potansiyel uygulaması vardır. Deneysel ve genetik araçlarla birlikte, burada sunulan ex vivo yumurta aktivasyon testi, evrensel olarak korunmuş^Ca2+ dalgasının tetikleyici, yayılma ve aşağı akış etkilerinin incelenmesini sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kuru aktif maya	Fleischman' s	# 2192
Diseksiyon mikroskobu	Leica	MZ6	Çeşitli çalışacak
Lamba	Mircotec Fiber optik	MF0-90	Çeşitli çalışacak
Tıbbi mendiller	Kimberly-Clark Corporation KLEW3020
Marker kalem	Stabilo	841/46	OHPen evrensel, siyah - çoğu kırtasiye mağazasında mevcuttur. Süper İnce Genişlik 0,4 mm
CO2 ped	& Genesee Scientific	59-114 (789060 Dutscher)
Kapak kayması, No. 1.5, 22 x 50 mm,	Uluslararası- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm	, Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T
Halokarbon yağı, seri 95	Halocarbon Products Corp.	Avrupa'daki Distribütör:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S	VWR Chemicals	24627.188	Halokarbon yağı yerine kullanılabilir, seri 95
Forseps	Güzel Bilim Araçları	11252-00	Bu aletlerin temiz olması gerekirken, otoklav kullanımına gerek yoktur, etanol yeterli olacaktır.
Prob	Güzel Bilim Araçları	10140-01
Cam pipet	Fisherbrand,FB50251		Pasteur Pipetler, cam, fişsiz, 150 mm uzunluk
Flakon	Regina Industries	P1014	GPPS  80 mm x 25 mm