Yöntem makalesi

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

15.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54312

⸱

30 Ocak 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Bu makalede

Özet

Biz moleküler temelli İnfluenza A, hızlı ve B tahlil açıklar. Grip deneyi moleküler işaret probları ile hedef tespiti ve ardından influenzaya spesifik primerler ile izotermal amplifikasyon kullanılarak 15 dakika içinde her bir hedef tespit eder. Grip A ve B tahlil kullanıcı dostu ve gerçekleştirmek için en az eller-zaman gerekli.

Özet

Grip insanlarda grip virüslerinin A ve B'nin neden olduğu bulaşıcı bir solunum yolu hastalığı olan ve morbidite ve mortalite her yıl önemli miktarda neden olur. Grip A ve B tahlil birinci CLIA-feragat moleküler hızlı gribi testi kullanılabilir. Grip A ve B test moleküler işaret probları ile hedef tespiti ve ardından influenzaya spesifik primerler ile izotermal amplifikasyon kullanılarak çalışmaktadır. Burada, donmuş Grip A performans ve B tahlil, bir solunum paneli deneyi ile karşılaştırılmıştır örneklerinin viral taşıma ortamı (VTM) saklanan nazofarengeal çubukla (NPS) arşivlenmiş.

Grip A ve B testinin performansı solunum paneli referans yöntemi sonuçları karşılaştırılarak değerlendirildi. toplam grip virüsü A duyarlılık% 67.5 (% 95 CI (CI), 56,6-78,5) ve özgüllük 86.9% (CI, 71,0-100) idi. İnfluenza virüsü B testi için, duyarlılık ve seçicilik% 90.2 idi (CI, 68,5-100sırasıyla) ve% 98.8 (Cl, 68,5-100),.

Bu sistem tam entegre, kapalı, az yer kaplayan sistemi üzerinde çalışan herhangi bir başka mevcut moleküler tahlil ve basit, pipet serbest prosedür daha kısa bir test süresi avantajına sahiptir. Genel olarak, bu çalışmada değerlendirilen Influenza A ve B tahlil, bir nokta-bakım hızlı grip tanı testi olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Giriş

Grip virüsü enfeksiyonları morbidite ve mortalite, her yıl 1, 2, 3, önemli bir miktarda sonuçlanır. Komplike olmayan grip, ateş, kas ağrısı, baş ağrısı ve kuru öksürük 4, 5 olarak anayasal ve solunum semptomları ile karakterizedir. Altta yatan eşlik eden yaşlı bireyler, küçük çocuklar, immün sistemi baskılanmış hastalar ve hasta pnömoni, miyokardit, merkezi sinir sistemi hastalığı veya ölüm 6, 7 gibi ciddi komplikasyonlara için daha yüksek risk altındadır.

Grip enfeksiyonu hastalığın şiddetini ve süresini 8 azaltabilir semptom başlangıcından 48 saat içinde antiviral tedavinin bu istemi yönetiminde diğer solunum yolu virüsleri benzersizdir. grip hızlı tespiti de olmuşturGereksiz antibiyotik 9, 10 kullanımını azalttığı gösterilmiştir. Ayrıca, grip enfeksiyonu olan yatan hastalar, uygun enfeksiyon kontrol önlemleri ile izole oda yerleştirilmesi gerekir. klinik grip ayırt etmek Ancak, sigara grip virüslerinin neden olduğu solunum yolu hastalıkları zor olabilir. Bu nedenle, grip için hızlı ve doğru tanı testi, klinik hasta yönetimi için çok önemlidir.

Çeşitli deneyler tespiti ve grip virüslerinin tanımlanması için kullanılabilir. Kullandıkları ve 15 dakika 11, 12 ila 30 içinde sonuç sağlamak için basit, çünkü hızlı grip antijen saptama testleri (RIDTs) yaygın nokta-bakım testleri gibi klinik pratikte kullanılır; Ancak, onların duyarlılıkları yaygın (% 10-80) üreticisi ve nüfus büyüklüğüne göre test edilmekte değişir ve influenza tip ve subtyPE 13, 14, 15. Doğrudan floresan deneyleri (DFA'ler) RIDTs üzerinde üstün hassasiyetleri sağlar, ancak işlem süresi daha büyük (~ 3 saat) ve vasıflı teknoloji 16, 17 ile tamamlanması gerekir. Viral kültür grip teşhis için altın standart olmuştur ve her iki RIDTs ve DFAs 18 üzerinde hassasiyet geliştirdi. Ancak, grip viral kültür hasta yönetimini 19 yardımında yararını azalan tamamlamak için 2-14 d sürebilir. Son olarak, nükleik asit amplifikasyon testleri (NAAT) grip teşhisi yeni altın standart olarak kültür teknikleri yerini almıştır. NAAT birkaç saat içinde Grip taramada kullanılan büyük hassasiyeti olduğu kabul edilir. Ancak, NAAT en pahalı deneyler ve 5 gerçekleştirmek için özel ekipman ve teknoloji gerektiren , 20, 21, 22, 23, 24, 25.

Burada anlatılan influenza A ve B tahlil hazır ilk CLIA-feragat moleküler hızlı grip testidir. Bu deney, moleküler işaret probları ile hedef tespiti ve ardından influenzaya spesifik primerler ile izotermal amplifikasyon kullanan bir Kırpma Endonükleaz amplifikasyon reaksiyonu (yakın) kullanılarak çalışmaktadır. Bu deney, B influenza A ayıran kurmak ve bir örnek işlemek için 2 dk gerektirir ve tamamlamak için 15 dakika olmak üzere toplam gerektirir.

Burada, Influenza A ve B testi için protokol mevcut. Buna ek olarak, biz örnek bir veri (viral taşıma ortamında saklanan örneklerinin arşivlenmiş nazofarengeal sürüntü (NPS) üzerine Influenza A performans ve B testi karşılaştıran VT set sağlamakBaşka solunum patojen paneli tahlil M).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

ETİK TABLOSU: kullanımı sol üzerinde klinik örneklerin onaylanmış ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu kuralları izler.

1. Testi Koşu önce

NOT: İnfluenza A ve B tahlil nazofarengeal sürüntü örneklerinin ve viral taşıma medya saklanan nazofarengeal sürüntü için onaylanmıştır. Svaplar kit dahil edilir ve en iyi performans için kullanılmalıdır. Ancak, suni ipek, köpük, çubuklar veya polyester burun bezlerden de nazal sürüntü örnekleri toplamak için kullanılabilir akın etti.

  1. bir nazal sürüntü örneği toplamak için, en görünür drenaj vardır ya da en sıkışık burun deliğine çubukla yerleştirin. Direnç sağlanana kadar nazik rotasyon ile, burun deliğine çubukla itin ve yavaşça burun deliğinden çıkarmadan önce burun duvara birkaç kez çevirin. bezlerden saklayın ve viral taşıma medya (VTM) 3 ml'lik şişelerde taşırlar.
    NOT: Dikkatli dikkat appropr içiniate örnek toplama hatalı sonuçlar verebilir yetersiz örnek toplama olarak alınmalıdır.
    NOT: Swab örnekleri toplandıktan sonra en kısa sürede test edilmelidir. Bununla birlikte, en çok 2 saat oda sıcaklığında muhafaza veya test şimdi kullanılabilir değilse kadar 24 saat boyunca 2-8 ° C'de soğutulmaktadır. Taze toplanan örnekler, testin performansı için idealdir. Yanlış numune işleme, depolama ve / veya taşıma hatalı sonuçlar doğurabilir.
    NOT: Bir önlem olarak, bu testi bireylerin örneklerini tutarken evrensel önlemler takip ederek potansiyel olarak bulaşıcı tüm örnekleri tedavi gerekir.
  2. Test öncesinde, oda sıcaklığına kadar tüm örnekler getirin.
    Not: Tüm test bileşenleri, sadece tek bir kullanım için ve birden fazla testlerini yapmak için kullanılmamalıdır. Farklı lot numaralarına kit bileşenlerini karıştırmayın. son kullanma tarihi geçmiş kit reaktifleri kullanmayın.
  3. roo mavi örnek alıcı getirTest öncesinde m sıcaklığı. Turuncu test tabanı, oda sıcaklığına kadar ısınmaya gerek kalmadan test edilebilir.
  4. kadar kullanılmadan hemen önce folyo sarma tüm test parçaları bırakın. Cihazın yan tarafında bulunan güç düğmesine basarak alet açın. Kullanıcı kimliği ve Enter tuşuna basın 'Tamam.'

2. Testi Koşu

  1. Test sürecine başlamak için, enstrüman ekranda 'Run Testi' dokunun. Ekran klavyesini veya barkod tarayıcı ve basın kullanılarak hastaların kimliğini girin 'OK.' Kapağı açın ve Portakal testi baz tutucu içine Portakal testi tabanını yerleştirin.
  2. doğru test ekranı ve basın görüntülendiğini onaylayın 'OK.' Mavi numune alıcı tutucu içine mavi örnek alıcısını takın.
    NOT: Bu doğru çalışma sıcaklığını ulaşmasını elüsyon tamponu engeller ve test performansını etkileyebilir olarak enstrüman yerleştirmeden önce örnek alıcısı açmayın.
  3. Örnek alıcı ısınmak için bekleyin. enstrüman tarafından istendiğinde, folyo mühür kaldırmak ve örnek alıcı içine test edilecek hasta bezi yerleştirin.
    NOT: folyo sökerken, yerinde kalmasını sağlamak için örnek Alıcı kenarında iki parmağınızı yerleştirin.
  4. Şiddetle size çubukla gelen numune çıkarmak yardımcı karıştırarak olarak numune alıcı tarafında karşı çubukla kafasına basarak, 10 saniye boyunca sıvı içinde çubukla karıştırın. Basın 'Tamam' devam etmek. viral taşıma ortamında saklanan test bezlerden, 10 saniye boyunca VTM vorteks sonra numune alıcısına 200 ul ekleyin.
  5. mavi numune alıcı içine beyaz aktarım kartuşunu basın. turuncu gösterge yükselir kadar örnek alıcısı üzerinde basmaya devam edin.
  6. Kaldırın ve daha sonra test tabanına aktarma kartuşu takın. Kartuş transferi doğru bağlandığından kez turuncu gösterge gözlemleyin inerler. Kapak kapatın ve "Test Complete" kadar açmayınmesajı ekranda görünür.

3. Kalite Kontrol

  1. Ana ekranda 'Run QC Testi' dokunun. QC Testi seçmek Run edilecek. 'Tamam' dokunarak ve ekrandaki testi tamamlamak ister takip ederek test amaçlı QC örnek eşleşecek test türünü onaylamak.

4. Sonuç Yorumlama

  1. test çalıştırması tamamlandıktan sonra, İnfluenza A, B, bilinmeyen alt tiplerin varlığı için yorumlarıyla ekranda test sonuçlarını gözlemleyin. Geçersiz sonuçlar için testi tekrarlayın.

5. Bakım ve Temizlik

  1. alet ve% 70 etanol ya da% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile günlük olarak çevredeki tezgah temizleyin. temizlemek için nemli, tüy bırakmayan bir bez üzerine temizleme solüsyonu püskürtün. enstrüman üzerinde doğrudan çözüm dökmeyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmada, arşivlenmiş NPS örnekleri 2013 NPS örnekleri 3 ml sunuldu 15 Aralık 2012 ve 1 Mart arasında bir grip salgını sırasında Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nde (MSKCC) de grip benzeri semptomlar ile başvuran yatan hasta toplandı VTM ve çalışma süresince Influenza A, A-1, A-3, ve B olmak üzere solunum yolu virüsleri (RP), bir panel tespit moleküler testi ile rutin klinik pratikte bir parçası olarak test 3675 NPS örnekler sunuldu test için MSKCC klinik laboratuvara. Bu örn...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Grip virüsleri morbidite ve mortalite dünya çapında nedenlerdir. grip hızlı ve doğru tanı, solunum sezonunda grip salgınları yönetmek için en önemli anahtarlarından biridir. Diğer antijen temelli testler, hızlı ve gerçekleştirmek kolaydır; ancak, düşük duyarlılıkları 13 var. Öte yandan, geleneksel moleküler testler hassasiyeti daha iyi, ancak yapmak ve daha pahalı olan daha deneyimli laboratuar teknologlar ihtiyaç var. Bu çalışma ve protokol açıklanan Grip A ve B deney tekniği Biz göstermektedir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nin Klinik Mikrobiyoloji Servisi personeline klinik örneklerin toplanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen MSKCC ve Alere Scarborough (SK2013-0262) arasındaki bir araştırma anlaşması ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alere i InstrumentAlereNAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test KitiAlere425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode ScannerAlereEQ001001
Alere Universal PrinterAlere55115 (Global), alereiprinter ( US)
200 ve mikro; l Hassas Pipet
200 & l tek kullanımlık pipet uçları
Viral taşıma ortamıRemelM4-RT

Kaynaklar

  1. Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, suppl 4 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza --- recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children--diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244(2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nfluenza A ve Bzotermal AmplifikasyonMolek ler aret i ProblarNazofaringeal S r ntViral Ta ma BesiyeriSolunum Paneli AnaliziHasta Ba TestiH zl nfluenza Tan sKlinik Tan y ntemleri

İlgili makaleler