Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

7.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54329

⸱

20 Ağustos 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

Bu makalede

Özet

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Özet

Kornea endotel hücreleri (CEC'ler), aktif pompalama yoluyla kornea berraklığının korunmasında çok önemli bir rol oynar. Azalmış bir CEC sayısı kornea ödemine ve azalmış görme keskinliğine neden olabilir. Bununla birlikte, insan CEC'leri, tehlikeye atılmış proliferatif potansiyele eğilimlidir. Ayrıca, hücre büyümesinin uyarılması genellikle kademeli endotelyal-mezenkimal geçiş (EnMT) ile karmaşıklaşır. Bu nedenle, yetkin işleve sahip CEC'lerin yenilenmesini kolaylaştırmak için EnMT mekanizmasını anlamak gereklidir. Bu çalışmada, kornea deliğinden Descemet membranı ile CEC'leri soyarak sığır CEC'lerinin birincil kültürünü hazırladık ve sığır CEC'lerinin fenotipik değişim, β-kateninin nükleer translokasyonu ve EMT düzenleyicileri salyangoz ve sümüklü böcek dahil olmak üzere EnMT sürecini sergilediğini gösterdik in vitro kültürde. Ayrıca, EnMT sürecini in vivo olarak göstermek için bir sıçan kornea endotel kriyoyaralanma modeli kullandık. Toplu olarak, sığır CEC'lerinin in vitro primer kültürü ve in vivo sıçan kornea endotel kriyoyaralanma modelleri, EnMT mekanizmasını araştırmak için yararlı platformlar sunar.

Giriş

Kornea endotel hücreleri (CEC'ler), aktif pompalama yoluyla kornea stromasının hidrasyon durumunu düzenleyerek kornea berraklığının ve dolayısıyla görme keskinliğinin korunmasında hayati bir rol oynar1. İnsan CEC'lerinin sınırlı proliferatif potansiyeli nedeniyle, hücre sayısı yaşla birlikte azalır ve yaralanma sonrası kornea endotel yaralarının onarımı genellikle hücre mitozu yerine hücre büyümesi ve göçü yoluyla sağlanır2. CEC sayısı yaklaşık 500 hücre /mm2'lik bir eşiğin altına düştüğünde, kornea stromasının dehidrasyon durumu korunamaz, bu da büllöz keratopatiye ve görme bozukluğunayol açar 3,4.

İnsan CEC'lerinin sınırlı proliferatif potansiyeli, yaşlanan hücrelerde5 epidermal büyüme faktörünün ve reseptörünün ekspresyonunun azalması, sulu mizahta antiproliferatif TGFβ2 ve temas inhibisyonu2,7 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlanmıştır. Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) gibi bazı büyüme faktörleri, kültürlenmiş bir insan kornea endotelinde proliferasyonu artırabilse de, kültür etkinliği sınırlı kalmaktadır8,9. Ayrıca, CEC'ler ex vivo genişleme sırasında epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) benzeyen fenotipik bir değişikliğe uğrayabilir10-13. Endotelyal-mezenkimal geçiş (EnMT), hücre bileşke destabilizasyonu, apikal-bazal polarite kaybı, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi, alfa düz kas aktin ekspresyonu ve tip I kollajen sekresyonu ile karakterizedir14. Bu özelliklerin tümü, CEC'lerin normal işlevini iptal edebilir ve ex vivo kültürlenmiş CEC'lerin doku mühendisliğinde kullanımını engelleyebilir. Ayrıca, EnMT, Fuchs endotelyal kornea distrofisi ve retrokornea membran oluşumu dahil olmak üzere çeşitli kornea endotel hastalıklarının patogenezi ile ilişkilendirilmiştir15,16. Bu nedenle, EnMT mekanizmasının anlaşılması, EnMT sürecinin manipüle edilmesine yardımcı olabilir ve yetkin işlevi sağlamak için CEC'lerin yenilenmesini kolaylaştırabilir.

Bu çalışmada, sığır CEC'lerini kornea deliğinden izole etmek için bir yöntem tanımladık. Birincil kültürde in vitro fenotipik bir değişiklik, β-kateninin nükleer translokasyonu ve EMT düzenleyicileri salyangoz ve sümüklü böcek dahil olmak üzere EnMT süreci gözlendi. Ayrıca, bir sıçan kornea endotel kriyoyaralanma modeli kullanarak EnMT'yi in vivo göstermek için bir yöntem tanımladık. Bu 2 modeli kullanarak, geniş spektrumlu bir matris metalloproteinaz (MMP) inhibitörü olan marimastatın EnMT sürecini baskılayabildiğini gösterdik. Açıklanan protokoller, EnMT mekanizmasının ayrıntılı analizini ve daha ileri klinik uygulama için EnMT sürecini manipüle etmek için stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği ile tanınan bu çalışmada izlenen ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. İzolasyon, İlköğretim Kültür Hazırlama ve Bovine CDKÖ immün

  1. Yerel bir mezbahaya taze sığır gözleri kazanır.
  2. 3 dakika boyunca% 10 w / v povidon-iyot çözeltisi gözleri dezenfekte. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile yıkanır.
  3. steril koşullar altında bir neşter ve makas ile kornea düğmeye hasat. bir mikroskop altında forseps ile Peel Descemet membranı (bu çalışmada unutmayın, sığır gözler yerel bir mezbahaya tarafından iki parçaya ayrıldı, bu nedenle ilk çalışma prosedürü laboratuvarda preenucleated gözlerinin dezenfeksiyon idi).
  4. try 1 ml Descemet membran inkübe30 dakika boyunca 37 ° C'de psin. 5 dakika boyunca 112 x g'de santrifüj ile sığır CDKÖ toplayın. takviye hormon epitel ortam (SHEM) HEPES-tamponlu Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı ve% 5 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Ham F12 ortamında,% 0.5 dimetil sülfoksit, insan epidermal 2 ng / ml arasında eşit hacimlerde ihtiva eden 1 ml hücrelerin tekrar büyüme faktörü, 5 mg / ml arasında insülin, 5 mg / transferin ml, 5 ng / selenyum mi, kolera toksin 1 nmol / L, 50 mg / ml gentamisin ve 1.25 mg / amfoterisin B mi
  5. 6 cm çanak içine hücreleri (gözün başına yaklaşık 1 x 10 5 hücre) Tohum. Sam'ın Kültür onları. Hava içinde% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de çanak inkübe edin. 3 günde kültür ortamı değiştirin.
  6. Hücreler kaynaşmaya eriştikten sonra, PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin 1 ml inkübe. 5 dakika boyunca 112 x g'de santrifüj ile toplayın. Sam'ın 1 ml hücre pelletini yeniden askıya.
    1. Bir hemasitometre hücreleri saymak. Bir 24-yuvalı plaka içinde çukur başına 1 x 10 4 yoğunluğuna ve kültür Sam hücreleri de kapaklı lam üzerinde hücreleri tohumu. marimastat arasında EnMT bastırıcı etkilerini araştırmak için, marimastat uM kültür ortamına ilave 10 Sam hücreleri inkübe ve her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin.
  7. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile belirtilen bir zaman noktasında hücreleri saptamak. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği. 30 dakika boyunca% 10 inek serumu albümini ile bloklayın.
  8. gece boyunca 4 ° C 'de, aktif beta-katenin (ABC), salyangoz ve sevk borusu karşı birincil antikor ile inkübe hücreleri. 200: kullanılan birincil antikor seyreltme 1'dir. antikorlar, 10 mM PBS,% 1 w / v sığır serum albümini ve% 0.09 w / v sodyum asid oluşan antikor seyreltici içinde seyreltilir.
  9. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve inkübe1 saat süre ile oda sıcaklığında (antikor seyreltici içinde 1: 100) ve Alexa Fluor-konjuge sekonder antikor ile m.
  10. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol 2 ug / ml hücreleri kapsayan, hücre çekirdeğine Counterstain, 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve montaj çözümü, anti-solma ile monte edilir.
  11. 20X objektif büyütme ile bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak 405 ve 488 nm uyarma dalga boylarında immunofluorescent görüntüleri elde edebilir.

2. Sıçan Kornea Endotel Cryoinjury Modeli ve İntrakameral Enjeksiyon

  1. % 2 ksilazin (5.6 mg / kg) ve tiletamin artı zolazepam (/ kg 18 mg) kas içine enjeksiyonu ile 12 haftalık erkek Sprague-Davvley sıçanları anestezisi. Yavaşça cilt seğirmesi yokluğunda uygun anestezi onaylamak için hayvanların derisini çimdik.
  2. Göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için her sıçanın sağ gözüne% 0.5 proparacaine hidroklorür bir damla aşılamak. Aşılamaksol göze tetrasiklin merhem kornea kuruluğunu önlemek için.
  3. sıvı nitrojen içinde paslanmaz çelikten bir prob (çap = 3 mm) soğutun. 30 sn sağ gözünün kornea santralinde paslanmaz çelik prob uygulayın. Sıkça kornea kuruluğunu önlemek için işlem sırasında sağ gözüne PBS aşılamak.
  4. hemen cryoinjury sonra% 0.1 atropin ve% 0.3 gentamisin sülfat aşılamak ve günde bir kez siliyer spazm kaynaklanan göz ağrısı rahatlatmak için ve enfeksiyonu önlemek için.
    1. İşlemden sonra, sıçanlar bir ısı lambası kullanarak sıcak tutmak ve onlar motor kontrolünü yeniden kadar anestezi sonrası kendi iyileşme her 15 dakika gözlemleyin. Ayrıca, iyileşme döneminde kornea kuruluğunu önlemek için sağ gözüne tetrasiklin merhem uygulayın.
  5. 3 gün üst üste kornea cryoinjury tekrarlayın.
  6. Daha önce açıklandığı gibi sıçan gözlerin ön odasına marimastat veya bFGF verilmesi için, fareler uyutmak. bir damla aşılamaksağ göz içine% 0.5 proparacaine hidroklorür göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için.
  7. steril PBS ile göz yüzeyi yıkayın. iris yukarıda ve paralel bir düzlemde paralimbal açık bir korneadaki bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 G iğne sokarak bir ameliyat mikroskobu altında Ön bölme parasentezi gerçekleştirmek.
  8. İğne yukarı konik çevirin ve hafif bazı sulu mizah drenaj ve göz içi basıncını düşürmek için kornea yara bastırın. intrakameral ilacın 0.02 ml enjekte edilir. Yavaşça iğne çekilmesi sırasında pamuk uçlu iğne yolu sıkıştırmak.
  9. ameliyat mikroskobu altında belirtilen zaman noktasında dış göz fotoğraf.

3. Hasat Sıçan Kornea Düğme ve immün

  1. Fareleri euthanize için, ötenazi odasına koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 demlenmeye. Bir CO 2 infüzyon korumaksolunum yetersizliği ve soluk göz rengi sonra ek dakika.
  2. keskin bir bıçak ile limbusta sıçan göz nüfuz eder. limbusta boyunca kornea makasla korneaları kesin. bir slayt korneaları dümdüz. korneaları kıvrılıp, ek radyal kesiler olun.
  3. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile kornealar düzeltildi. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği, ve 30 dakika boyunca,% 10 büyükbaş hayvan serum albümini ile bloke eder.
  4. 1 oranında sulandırılmış bir gece boyunca 4 ° C 'de ABC karşı birincil antikor ile kornealar inkübe: 200 antikoru seyreltici içinde. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez kornealar yıkayın ve ikincil antikor ile inkübe: 1 saat süre ile oda sıcaklığında (1 antikoru seyreltici içinde, 100). Hücre 2 ug 4 / ml ', 6-diamidino-2-fenilindol ile hücrelerin kaplayarak nükleus ve 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri Counterstain.
  5. montaj çözümü, anti-solmaya korneaları monte edin. ob20X objektif büyütme bir lazer tarama konfokal mikroskop ile immunofluorescent 405 uyarma dalga boylarındaki görüntüleri ve 561 nm tain.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sığır CECS izole edildikten sonra, hücreler, in vitro olarak kültürlendi. 1 sığır CDKÖ faz kontrast görüntüler sunar Şekil. Izdiham hücrelerin altıgen şekil hücreleri hücre izolasyonu sırasında kornea stromal fibroblast tarafından kontamine olmadığını belirtti. 2 belirtilen bir zaman noktasında ABC, salyangoz ve sümüklü böcek karşı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir immün tasvir etmektedir. Yanı sıra, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CESler hücre proliferasyonu sırasında EnMT geçmesi için kendi eğilimi bilinmektedir. Tedavi amaçlı EnMT sürecini bastırmak için stratejiler geliştirmek, EnMT mekanizmasının tam bir anlayış gereklidir. Biz EnMT, in vitro kültür modeli ve sıçan kornea endotel cryoinjury modelinde yani sığır CEC araştırmak için 2 modeller nitelendirdi. Bizim sonuçları Her iki modelde de EnMT süreci göstermiştir. Ayrıca, marimastat ve EnMT baskılayıcı etkisi bu 2 model aynı mekanizmayı paylaşan düşündüren, her iki modelde ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir rakip mali çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi Tıbbi Araştırma Bölümü, İkinci Çekirdek Laboratuvarı personeline teknik destekleri için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
tripsinThermoFisher Bilimsel12604-013
Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı ve Ham'ın F12 ortamıThermoFisher Scientific11330
fetal sığır serumuThermoFisher Scientific26140-079
dimetil sülfoksitSigmaD2650
insan epidermal büyüme faktörüThermoFisher ScientificPHG0311
insülin, transferrin, selenyum ve nbsp;ThermoFisher Scientific41400-045
kolera toksiniSigmaC8052-1MG
gentamisinThermoFisher Scientific15750-060
amfoterisin BThermoFisher Scientific15290-026
paraformaldehitelektron mikroskobu bilimleri111219
Triton X-100SigmaT8787 
sığır serum albüminiSigmaA7906
marimastatSigmaM2699-25MG
anti-aktif beta-katenin antikoruMillpore05-665
anti-salyangoz antikoruSanta cruzsc28199
anti-sümüklü böcek antikoruSanta cruzsc15391
keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikorThermoFisher ScientificA-11001sığır CEC'lerinin ABC'sinin boyanması için,
keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikorusıçan kornea endotelinin ABC'sinin boyanması içinThermoFisher ScientificA-11003
anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikorusalyangoz ve sümüklü böcek CEC'lerinin boyanması içinThermoFisher ScientificA-11008
seyrelticiGenemed Biyoteknoloji10-0001
4 ', 6-diamidino-2-fenilindolThermoFisher ScientificD1306
montaj ortamıVektör LaboratuvarlarıH-1000
lazer taramalı konfokal mikroskopZEISSLSM510
ksilazin ve nbsp;BayerN/A
tiletamin artı zolazepamVirbacN/Aveteriner ilacı
proparakain hidroklorür oftalmik çözeltiAlconN/Aveteriner ilacı
%0.1 atropinWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Aklinik ilaç 
% 0.3 gentamisin sülfatSinphar GrubuN / Aklinik ilaç 
temel fibroblast büyüme faktörüThermoFisher ScientificPHG0024klinik ilaç 
, , , keçi , , antikor

Kaynaklar

  1. Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
  2. Joyce, N. Proliferative capacity of the corneal endothelium. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).
  3. Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
  4. Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
  5. Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
  6. Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
  7. Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
  8. Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
  9. Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
  10. Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
  11. Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
  12. Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
  13. Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095(2013).
  14. Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  15. Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
  16. Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
  17. Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
  18. Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
  19. Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
  20. Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
  21. Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
  22. Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
  23. Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

S r Kornea Endotel H creleriS an Kornea Endoteli Kriyohasarla Olu turulan ModelIn Vitro K lt rIn Vivo ModelH cre zolasyon Prosed rmm nofloresan BoyamaN kleer Translokasyon AnaliziMarimastat TedavisiTemel FGF Enjeksiyonu
Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.