Yöntem makalesi

Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

DOI:

10.3791/54350

⸱

3 Eylül 2016

 ,  , 
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, meme kanseri hücre dizilerinde hücre proliferasyonunu analiz etmek için üç farklı yöntemin kullanımını açıklar. Bu, geleneksel hücre sayımı, lüminesans tabanlı hücre canlılığı ve bir hücre görüntüleyici kullanımı yoluyla hücre sayımının kullanımını içerir. Her biri, hücre proliferasyonunun tekrarlanabilir ölçümü için avantajlar sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre proliferasyonunun ölçülmesi, her biri farklı hassasiyet seviyelerine, tekrarlanabilirliğe ve yüksek verimli biçimlendirme ile uyumluluğa sahip bir dizi farklı yöntemle gerçekleştirilebilir. Bu protokol, hücre proliferasyonunu in vitro olarak ölçmek için geleneksel hemositometre sayma odası, nispi hücre sayısının bir ölçüsü olarak canlı hücrelerin metabolik aktivitesindeki değişikliği kullanan lüminesans tabanlı bir test ve bir sayma algoritması kullanarak hücre sayısını ölçen çok modlu bir hücre görüntüleyici dahil olmak üzere üç farklı yöntemin kullanımını açıklar. Her yöntem, hücre proliferasyonunun ölçümü için zaman, maliyet ve yüksek verim uyumluluğu dahil olmak üzere kendi avantajlarını ve dezavantajlarını sunar. Bu protokol, her yöntemin zaman içinde hücre proliferasyonunu doğru bir şekilde ölçebildiğini ve farklı hücresel yoğunluklarda büyümeyi tespit etmek için hassas olduğunu göstermektedir. Ek olarak, bir hücre görüntüleyici kullanılarak hücre proliferasyonunun ölçülmesi, morfoloji, birleşme gibi daha fazla bilgi sağlayabildi ve zaman içinde hücre proliferasyonunun sürekli izlenmesine izin verdi. Sonuç olarak, her yöntem hücre proliferasyonunu ölçme yeteneğine sahiptir, ancak seçilen yöntem kullanıcıya bağlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör bastıncı gen p53, hücre döngüsünün durdurulması, apoptoz ve yaşlanma 1 de dahil olmak üzere hücresel süreçleri, bir dizi önemli bir düzenleyicidir. Bu genomik stabilite bakımından sorumlu olan, ve bu nedenle, hücre ölümü ve hücre büyümesinin dengesini sağlamak için çok önemlidir. P53 mutasyonlar kanser yaygındır ve kontrolsüz kanseri hücre çoğalması 2 giden p53 etkisizleştirme başlıca nedenidir. İlginç bir şekilde, p53 mutasyonlar diğer mekanizmalar p53 fonksiyonunun kaybının sorumlu olduğunu göstermektedir, meme kanserlerinin 3 yaklaşık% 25'ini oluşturmaktadır. En son keşfedilen p53 izoformları insan kanserlerinde bir dizi ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğalma Tahliller için hazırlanması 1. Hücreler

Not: her yöntem analiz için aynı biçimde aynı şekilde ve tohum iki hücre çizgileri hazırlamak.

  1. T- MCF-7-Lego ve MCF-7-Δ40p53 75 cm2 doku kültürü şişeleri 75-80% konfluansa 7 hücreleri büyümek kırmızısız fenol,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 ug / ml insülin, ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 1 ug / ml Puromisinin. Steril bir biyogüvenlik kabini sınıf II hücreleri anlaştım.
    Not: izdiham hücreleri büyümek için geçen süre tohumlama seyreltme bağlı olarak değişir. Çoğalma d....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kültürlenmiş hücrelerin çoğalmasını,-Δ40p53 MCF-7 hücrelerinin transduse hücre proliferasyon ölçüm farklı yöntemler incelenmesi transdüksiyona MCF-7-LEGO'nun Meme kanseri hücre dizisi ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırıldı üç yöntem - şematik diyagramda özetlenen analizi-alışılmış hemositometre yöntem olup, hücre canlılığı, lüminesans deneyi ve hücre görüntüleme (Şekil 1). Her yöntemin avantajları ve doğru zamanla hücre sayımı ölçmek için dezavantajları vardır, ve en e.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kültürlenmiş hücrelerde hücre çoğalmasını ölçmek için üç farklı yöntem incelenmiştir. Her yöntem 96 saat boyunca hücre çoğalmasının tekrarlanabilir ve hassas ölçümler yeteneğine sahip olduğunu ve sonuçlar (Şekil 2 ve 3) test edilen yöntemlerin her karşılaştırılabilirdir. Lüminesans bazlı analiz ve hücre görüntüleme yöntemi Hem 96 saat sonra, hücre çoğalmasında lineer artış gösteren, en güçlü sonuç (Şekil 2B, C). Ayrıca, zamanla hücre görüntüleme transduse v.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Hamish Campbell ve Prof. Antony Braithwaite'e transdüksiyonlu MCF-7-LeGO hücre hatlarının geliştirilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü aracılığıyla Bloomfield Group Vakfı tarafından sağlanan finansman desteğimizi takdir etmek isteriz. BCM, Newcastle Üniversitesi aracılığıyla bir APA bursu ve Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü aracılığıyla MM Sawyer Bursu ile desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium, fenol kırmızısı içermeyenThermoFisher Scientific21063-045%10 FBS, 200 mM L-glutamin, 2 ve mikro ile desteklenmiş; g / ml insülin ve 1 &mikro; g/ml puromisin
L-glutamin çözeltisi (100x)ThermoFisher Scientific25030-081
İnsülin çözeltisi insanSigma-AldrichI9278-5ML
Fetal sığır serumu (FBS)Bovogen BiologicalsSFBS-F-500ml
Puromisin dihidroklorürSigma-AldrichP9620-10ML
%0,5 tripsin-EDTA çözeltisi (10x)ThermoFisher Scientific15400-054DPBS
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 2x'e seyreltin (1x)ThermoFisher Scientific30028-02
Doku kültürü şişesi, 75 cm2 büyüme alanıGreiner Bio-One658175
Scepter 2.0 Hücre SayacıMerck MilliporeOtomatik hücre sayacı
96 kuyulu çok kuyulu plaka, düz tabanlıNunc167008
Geliştirilmiş Neubauer HemositometreBOECO AlmanyaBOE 01
Olympus IX51 ters mikroskopOlympusIX51
CellTiter-Glo 2.0 TestiPromegaG9242Lüminesans tabanlı test
Cytation 3 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuBioTekPlaka okuyucu ve parlak alan hücre görüntüleme
Gen5 Veri Analiz YazılımıBioTekGEN5
Lüminesans, floresan için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
  2. Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).
  3. ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cell ProliferationHemocytometer CountingLuminescence AssayCell ImagerMCF 7 Cell LinesAutomated Cell CounterMulti Mode Plate ReaderTrypsinization Protocol96 Well PlateGFP Imaging

İlgili makaleler