Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

Özet

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Özet

Fonksiyonel, kendini hoşgörülü T hücre repertuarının nesil sonuçlanan eşsiz ve son derece organize timik mikroçevresinin timik seçim ilerler. T soy bağlılığı ve gelişimini incelemek için in vitro modeller bu süreçte değerli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu sistemler, T hücresi gelişimi için gerekli olan tam üç boyutlu timik ortam eksikliği ve bu nedenle, in vivo olarak timus seçim eksik yaklaşık değerlerdir. Modelleme T hücre gelişimi ile ilgili sorunlardan bazıları tamamen T hücrelerini gelişmekte olan timus seçimi destekleyen sağlam bir timik mikro sağlamak yerinde modellerinde kullanılarak aşılabilir. Timik dilim Organotipik kültürler in situ teknikleri mevcut tamamlayacak. Timik dilim timik kortikal ve medüller bölgelerin bütünlüğünü korumak ve tanımlanmış bir gelişim aşamasında veya endojen T c Kaplanmış timositlerin gelişimini incelemek için bir platform sağlamakolgun timik mikroçevresinin içinde arşın. fare başına ~ 20 dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, timik dilim yüksek verimlilik deneyler için ölçeklenebilirlik açısından benzersiz bir avantaj sunuyoruz. Dahası, farklı genetik geçmişleri farklı timik alt kümelerini ya da diğer hücre popülasyonları bindirmek için timik dilimleri ve potansiyelini üreten göreli kolaylığı bu yöntemin çok yönlülüğünü artırır. Burada timik dilimleri, izolasyon ve timositlerin kaplaması ve akış sitometrik analiz için timik dilimlerin ayrışma hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu sistem aynı zamanda timosit taşıma, timosit-stromal hücre etkileşimleri ve iki foton mikroskobu ile timik seçimi ile bağlantılı TCR sinyallerinin geleneksel olmayan T hücresi gelişimini incelemek ve görselleştirmek için adapte edilebilir.

Giriş

T hücreleri bir işlevsel, serbest-dayanıklı T hücresi repertuarının ^1-3 üretimi sağlamak birçok kontrol noktaları karşılaşma, bu süre içinde timus gelişim ara bir dizi farklılık gösterir. Pozitif seçim kortikal timik epitelial hücreler (CTEC) ^-2,3 üzerindeki majör histokompatibilite kompleks molekülleri (MHC) tarafından sunulan, orta dereceli afınitede, peptide düşük, tanıyan T hücre reseptörleri (TCR) ile timositler hayatta kalmasını teşvik eder. Negatif seçim ve düzenleyici T (T _reg) hücre gelişimi MHC ^2,4 tarafından sunulan öz-peptid kuvvetle cevap timositlerin ortadan kaldırılması ya da saptırma yoluyla kendini tolerans kurulmasına katkıda bulunur. Olgunlaşmamış CD4 ⁺ CD8 ⁺ çift pozitif (DP) olgun T hücre alt içine seçim süreci geçmesi ayırt TCRler ifade timositleri, hangi MHC sınıf I kısıtlı CD8 ⁺ sitotoksik çoğunluğuveya MHC sınıf ikincil lenfoid organlara ^1-3 efektör işlevleri gerçekleştirmek için timus çıkmadan önce, CD4 ⁺ yardımcı tek pozitif (SP) T hücrelerini II kısıtlı.

T hücre gelişiminin karmaşıklığı ekleme dinamik göç ve stromal hücre ağının ^5-9 boyunca timositleri gelişen hücresel karşılaşır olduğunu. Bu stromal hücreler timosit gelişiminde belirgin rol oynayan ve farklı şekilde pozitif ve negatif seleksiyon ¹⁰ meydana timik kortikal ve medüller bölgeler arasında dağıtılır. Pozitif seçim öncelikle korteks yer alsa da, DP timositleri medulla göç ve medulla pozitif seçimi ve soy tamamlanması için gerekli ek sinyaller olabileceğini düşündürmektedir olgun T hücreleri içine ayırt önce TCR sinyallerini gerektirecek devam ettiğini biriken kanıtlar vardır farklılaşma ^11,12. Bundan başka,reaktif timositleri ^13,14 silinmesini kolaylaştırmak ifade uzman medüller timik epitelial hücreler (MTec) ve mevcut dokuya sınırlı antijenlerin varlığına rağmen, negatif seçim büyük bir kısmı her yerde bulunan bir kendinden peptit dendritik tarafından sunulan ifade yanıt olarak kortekste meydana hücreler ^15,16. Böylece, T hücre gelişiminin doğru modelleri timositlerde ve stromal hücreleri arasındaki etkileşimi kolaylaştırır ve bu hücreler pozitif ve negatif seçim tabi olarak timosit göç destekler sağlam kortikal ve medüller bölgeler ile, son derece organize timik mikro sağlamalıdır.

Ex vivo olarak tamamlamak için, yerinde, pozitif ve negatif seçim in vitro bir dizi okuyan bir araç olarak timositlerin analiz eder ve T hücresi gelişiminin in vivo modellerde ^17-22 geliştirilmiştir. Recapitulate etmek oldukça zor olmuşturPozitif in vitro seleksiyon, ama Notch ligandı ifade eden kök hücre popülasyonlarının veya stromal hücreler ile T hücre öncülerinin kokültürünün, özellikle OP9-DL1 / 4 hücreleri, in vitro modelde o paha biçilmez bir hale T soy bağlılığı ve sınırlı olumlu seçimi desteklemek için yeteneğine sahiptir çalışma T hücre gelişimi ^23-25. Bu sistemin Sınırlamalar Bununla birlikte, bu hücreler timik stromal hücrelerinde bulunan benzersiz peptid işleme makine ve üç boyutlu timik mikro yoksun olduğu gerçeğini içerir.

Daha teknik hantal, in vitro sistemler ile ilgili bazı engelleri aşmak yerinde ve timus seçim vivo modellerde rağmen. Reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) timositlerde ve timik stromal hücrelerin ^18,26,27 karışımlarını tarif içerir. Bu timik epitel hücre Reaggregates MHC sınıf I ve II ifadesini korumak ve developme destekleyebilirnt konvansiyonel T hücre alt, ama yine de kortikal ve medüller yapıları tanımlanmıştır yoksundur. Fetal timik organ kültürü (FTOC) lymphoreplete timik loplara lymphodepleted timik lob veya timositlerin enjeksiyon yoluyla asılı bırakma kültürü ile timositler ile tohumlandı ve CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T etkin gelişimini desteklemek edilebilir T hücresi gelişiminin popüler bir modeldir kültür ^18,28-31 zaman içinde hücre. Fetal timik lobların kültürünün başlangıcında mTECs bir yetersizlik var, ama tanımlanan kortikal ve medüller yapılar koşullara bağlı zamanla gelişebilir. Önemli bir husus, bu model, tercihan yetişkin T hücre gelişimi karşısında fetal destek olmasıdır. Son olarak, erişkin farelerde tanımlanan timik öncülerinin intrathymic enjeksiyonu teknik olarak zordur ama açıkça destekleyen bir ortam sağlar In vivo T hücresi gelişme. In situ ve in vivo modellerde Bu mükemmel araçlar t'nino çalışma T hücre gelişimi ve kullanımı bir deneme-by-deney temelinde ele alınmalıdır.

Timik dilimleri, ancak, son zamanlarda benzersiz, karmaşık ve genellikle daha yüksek verim denemeleri karşılamak için imkanı ile yerinde timik seçimi incelemek için çok yönlü, tamamlayıcı model olarak ortaya çıkmıştır. Timik dilim kortikal ve medüller bölgeler bütünlüğünü korumak ve geliştirme yanı sıra verimli pozitif ve negatif seleksiyon ^11,32-39 sırasında timosit göç destekler stromal hücrelerin bir çerçeve sunmaktadır. Timik dilimleri üstünde eklenen timosit alt kümeleri dokuya ve bunların uygun microenvironmental niş ^34,37 göç. üst üste timositleri konjenik işaretleri veya floresan etiketler ile timik dilim endojen hücrelerden ayırt edilebilir ve birkaç gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir. Timik dilim Organotipik kültürler çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirdiğerleri arasında timus seçimi, timosit davranışı (göç ve hücresel etkileşimleri) ve timosit lokalizasyonu da dahil olmak üzere T hücresi gelişiminin. Fare başına ~ 20 timus dilim oluşturmak için yeteneği göz önüne alındığında, deney ölçeklenebilirlik timus seçimi yerinde modellerinde diğerinden daha genel olarak daha fazladır. timik dilim hazırlanması uzman gibi vibratome gibi ekipmanları, ve hücre ölümü aracılığıyla zamanla hücre kaybı ve bir kapsül zarının olmaması nedeniyle sınırlıdır kültürde timik dilim yaşam süresi gerektirmesine rağmen, timik dilimleri mükemmel bir model sağlamak olgun timik mikroçevresinin içinde timositlerin senkronize popülasyonlarının timus seçimi analizi için. Burada akım sitometri analizi için timik dilim, izolasyon ve timositlerin bindirilirken, ve ayrışma (timus, timus lobları agaroz gömme ve gömülü doku vibratome bölümlendirilmeleri hasat dahil) timik dilimleri hazırlanmasını tarif etmektedir.

Protokol

Hôpital Maisonneuve-Rosemont - tüm hayvan çalışmaları için protokoller Centre de Recherche de Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

Timus Dilimleri Hazırlanması ve Tek hücre süspansiyonları 1. Hasat Fare Thymus

1. Servikal dislokasyon _CO2 ile fare öldürülür.
2. Laminer akış kaputu, bir diseksiyon kurulu fare ventral tarafı pin up. % 70 etanol ile fare püskürtün. göğüs boşluğu giren ve doku zarar etanol önlemek için gazlı bez ile dabbing herhangi bir aşırı alkol çıkarın.
3. Forseps bir çift ile sternum üssünde cildi kaldırın ve deri yoluyla bir kesim yapmak. Her ön ayakları yukarı derinin kesim uzatın.
4. göğüs kafesinden diyaframı ayırmak için sternum alt kısmında ek bir kesim olun. Sonra klavikula doğru göğüs kafesinin her tarafını kesti. göğüs boşluğu açığa kafasına doğru göğüs kafesini ters çevirin. iki lobutimüs kalbin üstüne yalan.
5. forseps, mikro-diseksiyon makas kullanarak timik lobları etrafında bağ dokusunu çıkarın ve / veya keskin kavisli makas. alttan veya bağ dokusu kalan aracılığıyla bireysel lobları kaldırmak için ince uçlu eğri forseps bir çift kullanın.
   Not: doğrudan timus tutmayın.
6. PBS içeren 15 ml konik tüp içinde timik lobları yerleştirin ve gerektiği kadar buz üzerinde bir kenara koyun.

2. Agaroz gömülmesi ve Timus Lobların Vibratome Dilimleme

1. Steril PBS, 50 ml 2 g, düşük erime noktalı agaroz eritilmesi ve agaroz tamamen eriyene kadar düşük bir ayar mikrodalga tarafından yerleştirmek için,% 4 agaroz çözeltisi hazırlayın. Kullanım için hazır olana kadar, 55 ° C'de bir su banyosu içinde, alüminyum folyo ve yer ile balon örtün.
2. Bir doku kültürü kaputu tam% 10 fetal bovin serumu içeren RPMI-1640 ortamı (FBS), 4 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin ve 10 uM hazırlanması2-merkaptoetanol.
3. 6 oyuklu hücre kültürü plakasına oyuk başına 1.5 mi tam RPMI-1640 ortamı ekleyin ve iyice her bir hücre kültürü ekleme yerleştirin. kadar gerekli 37 ° C'de bir kuluçka kenara plaka ayarlayın.
4. bir buz kovası, su ve buz ile bir sulu buzlu su banyosu hazırlayın.
5. Dikkatle ince uçlu forseps kullanarak her timik lobu çevreleyen kalan tüm bağ dokusu kaldırmak. Bir doku üzerine transferi PBS ile ıslatılmış veya bir mikroskop altında mendilin sonra timik lob, bir doku kültürü çanak PBS batmış ise bunu yapın.
6. Agaroz doku aşırı ısınmasını önlemek için, şişeyi dokunma sadece sıcak 40 ° C'nin altında soğumasını bekleyin. Yaklaşık 1 cm yüksekliğe kadar doku kalıba agaroz soğutuldu% 4 dökün.
7. dikkatli bir doku silin ve doku zarar vermeden kurutmak için yavaşça rulo timik lob aktarmak için forseps bir çift kullanın. doku tamamen kurur emin olun veya dilimleme sırasında agaroz dışarı kayar.
8. Dikkatle agaroz lob yerleştirin ve yatay olarak bir kalıbın tabanındaki (dilim sayısını artırmak için) dikey olarak (her dilimin yüzey alanını arttırmak için) ya da her iki konumlandırmak. Agaroz katılaşmaya izin vermek için 5-10 dakika boyunca, buzlu su kalıp yerleştirin.
9. Bu süre boyunca, tampon kasası montaj numune diski monte ve vibratome bıçak sokulmasıyla dilimleme vibratome hazırlar. numune disk üzerinde laboratuvar bant bir parça yerleştirin. % 70 etanol ile temiz, monte çalışma alanını sterilize edin.
10. Agaroz katılaşır sonra, yavaşça agaroz gömülü lob serbest bırakmak için kendi merkezinde kalıp ve basın ters.
11. altta ~ 0.5 cm lob her tarafı ve agaroz ~ 2 mm bırakarak çevreleyen aşırı agaroz kesmek için keskin bir bıçak kullanın.
12. numune disk üzerinde bant parçasına doku yapıştırıcı bir damla ile her agaroz blok sabitleyin. Birden fazla blok bant yapıştırılmış olabilir.
13. Vibratome bıçak wi hizalayınAgaroz blok üst th. Bıçak ve agaroz blok (ler) tamamen dalmış kadar steril PBS ile tampon tepsisini doldurun.
14. Bölüm agaroz gömülü doku 400-500 um bir kalınlığı olan dilimler elde edilmiştir. 0.225 mm / sn hızında, 100 Hz frekansında ve 5 ° açıya Vibratome ayarlayın.
15. bunlar kesilir steril PBS içeren bir doku kültür plakasına timik dilim toplamak için bükülmüş bir spatula kullanın. İlk ve son dilim atın.
16. 4X büyütme bir ışık mikroskobu altında dilimleri inceleyin. Bozulmamış timus dokusu ve çevresindeki agaroz (Şekil 1A) ile dilimleri seçin.
17. yavaşça hücre kültürü eki üzerine eğilmiş spatula gelen timik dilim kaydırmak için pipet kullanarak adım 2.3 hazırlanan plaka dilimleri aktarın. Her insert ~ 3 dilim konaklayabilir. dilimler birbirlerine ya da hücre kültürü eklemek duvarlara dokunmayın emin olun.
18. gerekli olana kadar, 37 ° C 'de plaka muhafaza edin.

3. Kaplama için timositlerin hazırlanması

1. Bölüm 1'de tarif edildiği gibi% 2 FBS içeren steril PBS, 5 ml ile dolu bir steril 15 ml doku öğütücüsü kullanılarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak için el loblar ayrıştırmaları timik loblar izole edin. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın.
2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 545 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatant atılır ve kırmızı kan hücreleri lize etmek için 3 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 x ACK lisiz tamponu (0.15 M _NH4CI, 10 mM KHCO _3, 0.1 mM _Na2EDTA) içinde 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri.
3. PBS,% 2 FBS içeren 15 ml tüp doldurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 545 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
4. % 2 FBS içeren 10 ml PBS hücrelerin tekrar ve 255 um ağ filtre içerisinden hücreleri geçer.
5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 545 x g'de santrifüj hücreleri ve concentr% 2 FBS içeren PBS içinde hücre pelletiniml başına 1 x 10 ⁷ hücre yapımı.
6. Hücresel böyle carboxyfluorescein süksinimidil ester gibi boyalar (KAKE) dilim endojen hücrelerden ayırt etmek congenic işaretleri veya genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere ifade farelerden alınan timositleri kullanarak değilse üretici protokollerine göre hücreleri etiketleyin.
7. Etiketli hücrelerin nihai yıkamadan sonra, 15 ul başına 1-3 x 10 ⁶ hücre tam RPMI-1640 ortamı içinde hücre pelletini.

4. Timus Dilimleri üzerine timositlerdeki Kaplama

1. uç üzerindeki timik dilimleri çevreleyen herhangi bir sıvı aspire bir pipet kullanın.
   Not: agaroz zarar vermemek için özen gösterin. agaroz bozuksa, Kaplanmış timositleri nedeniyle yüzey gerilimi kaybı dilim yüzeyine takmak olmaz.
2. pipet, bindirme her timik dilim üzerine 3. bölümünde hazırlanan timositlerin 15 ul dilim dokunmadan.
3. pla inkübe2 saat boyunca 37 ° C 'de te hücreleri timik dilimler halinde göç izin vermek.
4. 2 saat sonra, henüz dokuya göç değil aşırı Kaplanmış timositleri çıkarmak için 1 ml PBS ile timik dilimleri 3 kez yıkayın.
5. timik dilim hasat edilmeye hazır olana kadar deneye bağlı olarak genellikle 1-72 saat 37 ° C'de inkübe plakası.

Akım Sitometrisi için Timik Dilimleri 5. Ayrışma

1. % 2 FBS içeren PBS 150 ul ilave edilerek, her bir dilim için bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
2. timik dilimleri ile doku kültür eki% 2 FBS içeren PBS ile 1 ml ilave edilir ve yavaşça, hücre kültürü ucun yüzeyinden dilim ayırmak için bükülmüş bir spatula ile karıştırılmıştır.
3. bükülmüş spatula ile mikrosantrifüj tüp Ovülden dilim aktarın.
4. El ile bir mikrosantrifüj tüp numune havaneli kullanarak dilim bozabilir. bir son hacim 300-2% FBS içeren PBS 150 ul ekleul.
5. Bir yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine 40 um'lik bir filtreden ayrışan doku filtre. Süzülmüş hücreler akım sitometri analizi ⁴⁰ lekeli hazırdır.
6. sitometresinde tüm agaroz kaldırılır ve akış sitometresinin yapışmasına neden olmadığından emin olmak için bir akış iletmeden önce hücreleri ikinci kez Filtre.
7. Bir akış sitometresinde hücreleri elde edilmesi ve daha önce ⁴⁰ tarif edildiği gibi verileri analiz.

Sonuçlar

Böyle pozitif ve negatif seçim olarak T hücre gelişiminin farklı yönlerini timus dilim destek analizi. Başarılı deneyler için, timus dilim kalitesi çok önemlidir. Böylece, timik dilim timus dokusunun bütünlüğünü sağlamak için muayene edilmelidir ve timus dilim çevreleyen agaroz bozulmamış (Şekil 1A) olduğunu. Agaroz doku içine göç timositlerin sayısında önemli bir azalmaya neden zarar gördüğünde Yüzey gerilimi tehlikeye girebilir. Böylece, doku hasarı ...

Tartışma

Burada timik dilimleri ve akış sitometrisi ile Kaplanmış ön seçim MHC sınıf I kısıtlamalı TCR transjenik timositlerin etkin pozitif ve negatif seçim için temsili sonuçlar hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu ^sistem, agonist antijen, negatif seçim ve timus _regülatör T geliştirme ^11,12 mevcudiyetinde, ön seçim DP timositleri ³² MHC sınıf II kısıtlı CD4 ⁺ T hücrelerinin pozitif seçim destek benzer başarı ile kullanılabilir, ve edilmiştir ^{36,38,39,43,44.}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Vibratom	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG Agarose	Lonza	50080	Düşük erime sıcaklığına sahip agaroz
Gömme Kalıbı (Kesik - T12)	Polyciences	18986	22 mm x 22 mm kare, 12 mm x 12 mm'ye kesilmiş
Çift Kenar Hazırlama Bıçakları	Personna	74-0002
Doku Yapıştırıcısı	3M	1469SB
0.4 ve mikro; m Hücre Kültürü Ekleri	BD Falcon	353090	Test edilen birkaç markadan, bunlar hücreleri dilimlerin üzerinde en iyi şekilde tuttu
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin	ThermoFisher	21600-010
RPMI-1640 L-glutamin ile	Wisent	350-000-CL
Fetal Sığır Serumu	Wisent	080-110	Isı ile inaktive edilmiş
L-Glutamin, 200 mM	Wisent	609-065-EL
Penisilin / Streptomisin, 100x	Wisent	450-201-EL
2-Merkaptoetanol	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck Doku Öğütücüler	Wheaton	357426
Naylon Mesh Filtre	Bileşeni Temini	U-CMN-255
Mikrosantrifüj Tüpü Numune Havaneli	Bel-Art	F19922-0000
40 ve mikro; m Naylon Hücre Süzgeci	BD Falcon	352340
Forseps Inox Tip	Dumont	RS-5047	İnce uçlu kavisli forseps, boyut .17 x .10 mm
Mikro Forseps	Dumont	RS-5090 ve nbsp;