Çok hücreli organizmalarda, salgılanan çözünür faktörler, parakrin sinyalizasyonunun bir sonucu olarak farklı hücre tiplerinden yanıtlar ortaya çıkarır. Insert ko-kültür sistemleri, hücre-hücre temasının yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği değişiklikleri değerlendirmek için basit bir yol sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Salgılanan çözünür faktörlerin hücresel yanıtların modifikasyonundaki rolü, tüm doku ve sistemlerin çalışmasında tekrarlayan bir temadır. Çok hücreli organizmaları oluşturan çeşitli hücresel alt tipler arasındaki çok karmaşık ilişkileri basitleştirmek amacıyla, araştırmacıların tek hücre popülasyonlarını ayrıntılı bir şekilde anlamalarına yardımcı olmak için in vitro teknikler geliştirilmiştir. Bu tekniklerden biri, salgılanan çözünür faktörlerin yayılmasına izin veren geçirgen bir zara sahip ekler kullanır. Bu nedenle, eklerde büyütülen bir hücre popülasyonu, hücre-hücre temasının yokluğunda parakrin sinyallemeyi takiben hücresel değişiklikleri değerlendirmek için farklı bir hücre tipi içeren bir kuyu veya tabakta birlikte kültürlenebilir. Bu tür insert ko-kültür sistemleri, diğer ko-kültür tekniklerine göre, yani çift yönlü sinyalleme, korunmuş hücre polaritesi ve hücresel değişikliklerin popülasyona özgü tespiti gibi çeşitli avantajlar sunar. Enflamasyon, kanser, anjiyogenez ve farklılaşma alanında kullanılmasının yanı sıra, bu ko-kültür sistemleri, özellikle nöroinflamasyon bağlamında, merkezi sinir sisteminde bulunan farklı hücresel alt tipler arasında var olan karmaşık ilişkilerin incelenmesinde birincil öneme sahiptir. Bu makale, bir insert ko-kültür sistemi kullanarak salgılanan çözünür faktörlerin aracılık ettiği hücresel değişiklikleri değerlendirmek için bir deney kurmak için genel metodolojik yönergeler sunmaktadır. Ayrıca, lipopolisakkarit ile aktive olan N9 mikroglia tarafından salgılanan sitokinlerin nöronal PC12 hücreleri üzerindeki nöroinflamatuar etkilerini ölçmek için spesifik bir protokol detaylandırılacak ve insert ko-kültür metodolojisinin somut bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır.
Giriş
In vitro doku, organ veya sistemlerin çalışma çok hücreli organizmaları oluşturan çeşitli hücresel alt tipleri arasındaki mevcut çok karmaşık ilişkileri kolaylaştırmak için bir girişimdir. Nitekim, in vitro çalışmalar mümkün tek hücre popülasyonlarının ayrıntılı bir anlayış elde etmek için yapmak. 1) kolayca hücresel ortamı manipüle 2) yeteneği hücresel etkileşimleri azaltılmış ve: in vitro deneylerde iletken iki temel avantajı vardır. Bu nedenle, bu iki avantajı izin bilim adamları, tüm organizmalarda dış etkilerin sonuçları düzenleyen potensitesi, in vivo spesifik hücre tiplerinin davranışını tahmin etmek. Bu anlamda, in vitr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: memeli hücresi kültürü için gerekli olan, aşağıdaki adımların her biri, bir laminar akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Buna ek olarak, optimum steril hücre ekimi için genel kurallar uygulanır, örneğin., Ipuçları her zaman onlar, çapraz kontaminasyon neden zaman hücrelerinin miktarını azaltarak olabilir atarak düzgün, tüm medya değişiklikleri gerçekleştirme ama nazikçe tüm karıştırarak zaman havaya maruz kalan hücre süspansiyonları Ayrıca, ekler, özel işlem gerektiren plasticware bir tür vb onların homojen pipetleme sağlamak için. ekler manipüle edildiği anda Birincisi, kolayca gözyaşları ve bu nedenle deney tehlikeye atab....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
insert ko-kültür sistemlerinin kullanılması MSS farklı hücresel oyuncular arasında parakrin ilişkileri vitrin nöro süreçlerin çalışmada özellikle uygun olduğunu. MSS Bağışıklık onların istirahat dallanmış devlet (Şekil 2A) çevreleri izlemek ve algılama bozuklukları yeteneğine sahip mikroglia denilen yerleşik hücreler tarafından çoğunlukla başarılı olduğunu olabilir sorun düzgün nöronal fonksiyon 76-78 için gerekli çok değerli homeostasis. Bir amoeboid şekli
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Herhangi bir ekleme ko-kültür sistemi deney en kritik adım aslında kullanmak için uygun parçayı seçiminde yaşıyor. Gözenek büyüklüğü ve membran malzemesi ekilmiş olan hücre türü ve deney amacı dikkate unutulmadan, ayrıntılı göz önüne alınmalıdır. Örneğin, chemotaxic deneyler, hücre-hücre temas yokluğunda salgılanan çözünür faktörlerin neden olduğu hücre davranışı modülasyon analiz hücre birleşik kültürlerinden daha membran aynı tip kullanabilir. Hücre göçü ve hücre-hücre temasını engelleyecek, hücre göçü izin vermek içi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada tarafından MGM'ye verilen bir hibe ile finanse edilmiştir. JR, NSERC-Vanier öğrenci bursiyeridir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 orta | Sigma | R8755 | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/Besin Karışımı F-12 Jambon Sigma | D6421 | 37 °C Sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu, 0.365 gm/L L-glutamin ile desteklenmelidir | |
| At serumu | ATCC | 30-2040 | 37 ° C'de ılık; Kullanmadan önce C su banyosu |
| Fetal sığır serumu | MultiCell | 80350 | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu |
| murin submaksiller bezinden Sinir Büyüme Faktörü-7S | Sigma | N0513 | Liyofilize tozu, 0.1&ndash içeren tamponlu salin veya doku kültürü ortamı çözeltisinde sulandırın; % 1.0 sığır serum albümini veya% 1-10 serum |
| Tripsin-EDTA çözeltisi | Sigma | T3924 | 37 ° C'de sıcak; C su banyosu kullanmadan önce |
| Lipopolisakkaritler Escherichia coli 055:B5 | Sigma | L2880 | 24 |
| oyuklu plakalarla kullanım için Toksik Hücre kültürü ekleri | BD Falcon | 353095 | 0.4 & mu; m gözenekler |
| 24 oyuklu plakalar | TrueLine | TR5002 | Kullanmadan önce kollajen ile kaplayın |
| Rutin PC12 hücre kültürü ortamı | Rutin N9 hücre kültürü ortamı | ||
| - %85 RPMI orta | - % 90 DMEM-F12 orta | ||
| - % 10 ısıyla inaktive edilmiş at serumu | - % 10 ısıyla inaktive edilmiş at serumu | ||
| - % 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu | |||
| PC12 farklılaşma ortamı | N9 tedavi ortamı | ||
| - %99 RPMI orta | - % 99 DMEM-F12 orta | ||
| - % 1 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu | - % 1 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu | ||
| - 50 ng/mL sinir büyüme faktörü | |||
| PC12 tedavi ortamı | |||
| - %99 RPMI orta | |||
| - % 1 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu |
Kaynaklar
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
