Yöntem makalesi

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

DOI:

10.3791/54358

⸱

27 Ağustos 2016

 ,  ,  ,  , 
1Behavioral Neuroscience Research Branch, Intramural Research Program, NIDA, NIH, DHHS, 2Division of Rheumatology, School of Medicine, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

nöroplastisite ve öğrenilmiş davranışların moleküler değişikliklerin çalışma dernekleri öğrenilen aracılık eden nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan aktif nöronların spesifik setleri çalışmaya tüm beyin bölgelerinin çalışma geçiyor. (FACS) Kontrol THP-en son yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiş ve nöronal marker NeuN ve fos protein güçlü aktif nöronların belirteci karşı antikorlar kullanılarak aktif nöronların izolasyonu izin verildi. Şimdiye kadar, Fos salgılayan nöronların ve diğer hücre tipleri uzun işlem günü ve uzun ve karmaşık davranış işlemlerinden sonra değerlendirilir beyin örnekleri izin çok kısıtlı gerektirdiği taze doku, izole edilmiştir. 21 gün - Burada dorsal striatum nöronlar ve Fos mRNA Fos-ifade verimleri 3 -80 ºC de donduruldu taze disseke doku ve doku arasındaki benzer olduğunu gördük. Buna ek olarak, fenotip teyitdondurulmuş doku, aynı zamanda, FACS izolasyonu için kullanılabileceğini gösterir nöronal değerlendirmek gen ifadesi (NeuN), astrositik (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ve microgial (Iba1) işaretleri ile NeuN-pozitif ve NeuN negatif kriteri hücrelerin glial hücre türleri. Genel olarak, toplamak incelemek ve birden FACS oturumları için beyin dokusu dondurmak mümkün. Bu genellikle uzun ve karmaşık davranışsal prosedürleri geçirmiş değerli hayvan deneklerden elde edilen verilerin miktarını en üst düzeye çıkarır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

öğrenme sırasında, hayvanlar son derece spesifik uyaranların karmaşık setleri arasındaki ilişkileri oluşturmaktadır. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan nöronların belirli kalıpları içinde değişikliklerle tarafından kodlanan olduğu düşünülmektedir. Nöronal toplulukları son zamanlarda güçlü davranış veya isteka pozlama sırasında aktive edildi gibi Fos, Arc ve Zif268 ve nöronlarda protein ürünleri gibi hemen erken genlerin (Bacaklarını) indüksiyonu ile tespit edilmiştir. Özellikle içerik ve işaret özgü öğrenilen davranışlar 1-4 nedensel rol oynadığı gösterilmiştir nöronlar Fos-dile getirdi. Bu nedenle, bu aktive Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations madde bağımlılığı ve post-travmatik stres bozukluğu (TSSB) 5 normal öğrenme ve anormal öğrenme bozuklukları sırasında oluşan dernek, öğrenilen enkode nöral mekanizmalar için en iyi adaylardır.

Fluorescence Aktif Hücre Sıralama (FACS) son zamanlarda Fos-ifade nöronlar içinde benzersiz moleküler neuroadaptations analizi izin verdi. Flow sitometri ve hücre kendi ışık saçılması ve immunofluorescent özelliklerine göre hücre karakterize ve izole etmek için 1960 6,7 geliştirilmiştir sıralama ve uzun immünoloji ve kanser araştırmalarında kullanılmaktadır. Ancak akım sitometri ve FACS yetişkin beyin dokusundan elde etmek zordur ayrışmış tek hücreleri gerektirir. FACS birinci antikor etiketleme 8,9 gerektirmeyen transjenik farelerden striatal nöronlar -expressing izole etmek ve (GFP) yeşil floresan protein analiz etmek için kullanıldı. Bu izole edilmesi ve vahşi tip hayvanlara 11-15 ilaç ve / veya ipuçları ile aktive nöronlar Fos eksprese eden moleküler değişikliklerin değerlendirilmesi için antikor bazlı FACS metodu ile 10 geliştirilmiştir. güçlü nöronlar aktive ederken, bu yöntemde, nöronlar, genel nöronal belirteç neun karşı bir antikor ile etiketlenirFos karşı bir antikor ile etiketlenir. Başlangıçtaki yöntem, taze doku için örnek başına 10 sıçan havuzu gerekli olsa da, bir protokolün takip eden değişiklikler tek sıçan 13-15 ayrık beyin alanlarının Fos salgılayan nöronların ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) analizi FACS izole izin . Genel olarak, eşsiz moleküler değişiklikler bağımlılığı araştırma 12,14,15 yılında bağlam ve işaret aktive davranışlar çeşitli sırasında aktive nöronlar Fos-ifade bulundu.

Taze doku üzerinde FACS performans ile büyük lojistik sorun FACS ile doku ve süreci ayırmak bir bütün gün sürer olmasıdır. Buna ek olarak, sadece dört numune günde işlenebilir. Bu, genellikle tek bir beyin bölgesi Her beyinden gelen değerlendirilebilir ve kalan beyin bölgeleri iptal edilmesi gerektiği anlamına gelir. Bu tür öz-yönetim ve nesli trai gibi düşük verimlilik davranışsal işlemler için önemli bir sorundurcerrahi ve yoğun bir eğitim birçok hafta gerekir ning. Bundan başka, test gününde, uzun ve karmaşık bir davranış işlemler zor aynı gün FACS yapılmasını kolaylaştırır. Bu önemli bir avantaj hemen davranışsal test ettikten sonra hayvanlardan beyinleri dondurmak mümkün olacak, ve sonra araştırıcının seçeceği farklı zamanlarda bir veya birden fazla beyin bölgelerinden Fos-ifade nöronlar izole olacaktır.

Burada biz, FACS protokolü taze ve dondurulmuş, her iki beyin dokusundan Fos salgılayan nöronların (ve diğer hücre tipleri) izole etmek için kullanılabileceğini gösterir. Bir örnek olarak, akut metamfetamin enjeksiyondan sonra ve enjeksiyonlar (kontrol koşulu olmadan) naif sıçanların sıçan striatum nöronları Fos-ifade izole. Bununla birlikte, bu FACS protokolü bir davranış ya da farmakolojik tedavi sonrası kullanılabilir. Bizim örneklerin sonraki qPCR analizi bu hücre tiplerinden gen ifadesi simi ile değerlendirilebilir olabileceğini belirttitaze ve dondurulmuş hem dokudan lar verimliliği.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün deneyler Laboratuvar hayvanlarında 16 Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi National Institutes of Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre gerçekleştirilmiştir.

Not: Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde tutulmuştur kullanımı, düşük bağlanma santrifüj tüpleri aşağıdaki tüm adımları.

Doku Koleksiyonu önce 1. Hazırlık

  1. 4 o C santrifüj ayarlayın
  2. Yangın lehçe azalan yaklaşık 1.3 çapları, 0.8, ve her bir numune için 0.4 mm üç cam Pasteur pipetler bir dizi.
  3. Soğuk Tampon A 1 ml içeren etiketli 1.7 ml-tüpler hazırlayın ve buz üzerinde tüpler tutun.
  4. Matris, spatula ve diseksiyon gerçekleştirmek için cam plakalar (ya da ters cam Petri kabı) dilimleme beyin içeren bir buz tepsisi hazırlayın. t dokunma bütün aletleri kuru cam plakalar ve kullanım dokuları kağıt üzerinde ön soğuk iki veya daha fazla tıraş bıçağıkonu.
  5. Doku toplanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enzim solüsyonu çözülme.

2. Doku Toplama ve Diseksiyon

  1. Doku toplamadan önce davranışsal ya da farmakolojik tedavi 90 dakika başlatın.
    NOT: Burada gösterilen sonuçlar için, yeni bir ortama (test koşulu) ve naif sıçanlarda fareler üzerinde 5 mg / kg metamfetamin akut periton enjeksiyonlar evlerinde kafeslerde (kontrol koşulu) muhafaza yapıldı.
  2. Doymuş izofluran ile bir cam kurutucu kavanoza koyarak sıçan anestezisi ve sıçan 30 decapitate - 60 sn sonra bir giyotin kullanarak.
    kafa deri ve kas çıkarın ve kafatası açığa çıkarmak için makas kullanın. kafatası kesti ve foramen magnum açmak ve kafatasının arka kısmı kaldırmak için rongeurs kullanın. beyin ortaya çıkarmak için kafatasının üst kenarları boyunca kesmek için rongeurs kullanın. beyin zarar vermemek için dikkatli olun. nazikçe bir altında kepçe için küçük bir spatula kullanınbeyin yükseltmek d. Beyin yükseltmek ve beyin 17 serbest kalıncaya kadar sinirleri kesti.
  3. Jilet kullanarak doku teşrih.
    NOT: Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak doku örneklerinin elde edilmesi: (2.3.1) taze disseke doku; diseksiyonu sonrası (2.3.2) dondurulmuş doku; veya (2.3.3) dondurulmuş doku dondurulmuş tüm beyin disseke. Diseksiyon boyunca beyin dilimleme matrisi, jilet ve cam plaka kuru tutun ve yoğunlaştırılmış su gibi süreçleri kıyma hücrelerin hipotonik lizizi yol açabilir. Doğru diseksiyon sağlamak için gözlük büyüteç kullanın.
    1. Taze parçalara doku için, buz üzerinde soğutulmuş olan bir beyin dilimleme matrisi (1 mm aralıklarla traş makinesi bıçaklarının yuvaya sahip bir fare beyni şeklinde bir metal kalıp) içine yeni çekilmiş beyin yerleştirin. Çevrede beyin bölgesini (ler) ihtiva koronal dilimleri kesmek için yuvalarına iki veya daha fazla önceden soğutulmuş Jilet yerleştirin. soğutulmuş cam plaka üzerinde kesik dilimler yerleştirin.
      Not: beyin regio teşrihsoğutulmuş cam plaka üzerinde ilgi ns.
    2. Diseksiyon sonra dondurulmuş doku için, 2.3.1, yukarıda tarif edilene benzer yeni çekilmiş beyin, dilim ilgi beyin bölgesi (ler) incelemek. bir mikrotüp içine disseke doku yerleştirin ve hızla 20 saniye boyunca -40 ºC izopentan içinde mikrotüp daldırarak doku dondurma. fazla işlem kadar -80 ºC derin dondurucuda her zaman dondurulmuş doku disseke tutun.
    3. Dondurulmuş doku için, hemen 6 aya kadar -80 ° C'de mühürlü bir torba içinde -40 ºC isopentane ve mağaza yeni çekilmiş beyin dondurmak.
      1. Diseksiyon gününde, yaklaşık ayarlanmış bir kriyostat içinde donmuş beyin koyun -20 ºC (hayır sıcak -18 den ºC) yaklaşık 2 saat boyunca sıcaklığını dengelemek için.
        NOT: çok soğuk sıcaklıklar güvenli kesilecek beyin çok kırılgan yaparken Brain, bu sıcaklıkta kolaylıkla kesilebilir.
      2. 2 mm koronal dilim - 1 kesmek için jilet kullanınBir kriyostat içinde donmuş beyinleri. donma koşulları altında bu dilim doku yumruklar elde etmek için bir körelmiş 12- 16-gauge iğne kullanın. daha fazla işlem kadar her zaman dondurulmuş doku disseke tutun.
  4. kıyma önce disseke doku kapsayacak şekilde Tampon A 2 damla - 1 ekleyin. toz haline getirme işleminin geri kalanı boyunca nöronların kaybını önlemek için iki Jilet kullanarak dokudan beyaz maddenin en kaldırın. Dondurulmuş doku ile başlayan, sonra doku tamponu çözeltisi uygulanmadan önce en fazla 1 dakika boyunca soğuk bir cam plaka üzerine çözülme sağlar.
  5. soğutulmuş bir cam plaka üzerine bir jilet ile dokuya her ortogonal yönde 100 kez kıyma. kıyma zaman cam plaka dikey jilet tutun.
    NOT: Kapsamlı kıyma tüm protokol adımları için kritik öneme sahiptir.
  6. ke 5 kez - tüpü 3 ters çevirin soğuk Tampon A 1 ml içeren mikrosantrifüj tüpler içine kıyılmış doku aktarmak için Jilet kullanınçözelti içinde tüm kıyılmış doku ep.

3. Hücre Ayrılma

NOT: Aşağıdaki adımların tümünü karıştırma ucuna kullanın nazik sonu. Bir girdap karıştırıcı kullanın ve hücre hasarına neden hava kabarcıkları kaçının.

  1. 4 ° C'de 2 dakika süreyle 110 xg'de örnek tüplerini santrifüj. Süpernatantı atın. Yavaş yavaş mikrotüp iç duvar aşağı soğuk taze çözülmüş enzim solüsyonu (proteolitik enzimlerin bir karışımını ihtiva eden) bir 1 ml. Hemen kıyılmış doku pelet dağıtmak için bir orta büyük uç çapı pipet ile sadece 4 kez yukarı pipet ve yavaşça tüm pelet emmek ve.
  2. Alt yapışmasını pelet önlenmesi ve 4 O ° C'de 30 dakika boyunca son aşırı uç karıştırma ile örnekleri inkübe hemen mikrotüpler Invert
  3. Enzimatik Doku sindirimi sonra, santrifüj 4 ° C'de 2 dakika boyunca 960 xg'de borular. Süpernatantı ve soğuk tampon A immediatel 0.6 ml ilavey Tampon A ekledikten sonra, aşağı 5 kez tüm pelet emme pelet dağıtmak için aynı pipet kullanın ve nazikçe yukarı pipet ve.
  4. Mekanik sindirilmiş doku çiğnemek ve aşağıdaki adımları uygulayarak 15 ml tüpler toplamak. Her numune için, lateks ampul takılı yaklaşık 1.3, 0.8 ve 0.4 mm çapları azalan 3 yangın cilalı cam Pasteur pipetler ayrı bir kümesi kullanın.
    1. Yavaşça her bir numune 1.3 mm cam pipet ile 10 kez çiğnemek. Numune (dibe olacak enkaz ve ayrışmamış hücreler) buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. 15 ml konik tüp süpernatant (~ 0.6 ml) ve transfer toplayın (tüp # 1).
    2. Kalan pelet bir çözeltisi ml Tampon 0.6 ekleyin. örneklemin 0.8 mm cam pipet ile 10 kez Karışım. Numune buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. Aynı 15 ml supernatant (~ 0.6 mi) ve transfer toplamak konik tüp # 1.
    3. Kalan Pelle A çözüm ml Tampon 0.6 Eklet. örneklemin 0,4 mm cam pipet ile 10 kez Karışım. Numune buz üzerinde 2 dakika süreyle dinlendiriniz. (Non-ayrışmış hücreleri ile pelet dokunmadan ~ 0.6 ml) ve aynı 15 ml konik tüp içerisinde 1. transfer süpernatant toplayın.
      NOT: Aşağıdaki toz haline getirme adımları için tüp 1. 0,4 mm çaplı pipet tutun.
    4. Adımı tekrarlayın 3.4.3 ayrı 15 ml konik tüp içine üç tane daha küçük cam pipet (~ 0.4 mm çap) kullanılarak kez ve süpernatant toplamak (tüp # 2).
    5. 0,4 mm cam pipet kullanarak 10 daha fazla kez tüpler # 1 ve # 2 toplanan hücre süspansiyonları çiğnemek ve buz üzerinde tutmak.

4. Hücre Sabitleme ve Permeabilization

  1. % 100 soğuk etanol 800 ul ekleyerek (tüp # 2 hücreleri için tüp # 1 hücreleri için iki mikrotüpleri ve iki) numune başına 4 mikrotüpleri hazırlayın Her tüpe (kullanımdan önce -20 o C'de saklanır) ve buz üzerinde saklayın . Not: Nihai etanolkonsantrasyon% 50 olacaktır.
  2. Pipet ~ 800 soğuk etanol ihtiva eden 4 tüpün her birine (tüp # 1 ve boru # 2) hücre süspansiyonları ul numune karıştırmak için tüpler ters.
  3. tüpler her 5 dakika ters çevirici kadar 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
  4. sabitleme / permeabilization sonra, 4 ° C'de 4 dakika boyunca 1.700 xg'de tüpler santrifüj ve supernatant atın. hücre kaybını önlemek için bir çözüm 50 ul bırakın.
    NOT: Bu aşamada pelet beyaz ve permeabilization daha önce tüplerin duvarına daha az sopa. Bu nedenle, hiçbir pelet olduğu yerde mikrotüpte duvarını dokunarak dikkatlice süpernatant kaldırmak ve yavaş yavaş bir mikropipet kullanarak süpernatant hazırlar.

5. Hücre Filtrasyon

  1. aşağıdaki gibi soğuk PBS ile adım 4,4 pelet yeniden askıya:
    1. Tüp # 1 gelen iki mikrotüplerdeki birine soğuk PBS 550 ul ekleyin ve bir orta büyük çaplı pi kullanınPette ucu hafifçe hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı 5 kez pipet için. bir mikrotüp tüp 2. gelen için tekrarlayın aynı.
    2. Aynı pipet kullanılarak tüp # 1 hücreleri için, ikinci bir pelet ilk hücre süspansiyonu aktarın. yavaşça kombine hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı 5 kez pipetleme ikinci pelletini.
    3. Tüp # 2 hücreleri için, tekrar süspansiyon ve 5.1.2'de tarif edildiği gibi peletler (örneğin, üçüncü ve dördüncü mikrotüpler) birleştirir.
  2. ayrı ayrı hücre süzgeçler iki farklı çift (100 um ve 40 mikron gözenek boyutları) aşağıdaki gibi kullanarak adım 5.1.2 ve 5.1.3 iki hücre süspansiyonları Filtre:
    1. süzgeç içine PBS eklenerek ön ıslak her hücre süzgeç. süzgeç dışından aşırı PBS kaldırmak için bir pipet kullanın.
    2. eşit 100 mikron gözenek büyüklüğüne sahip ilk hücre süzgecinden üzerine adım 5.1.2 hücre süspansiyonu pipetle. Buz üzerinde 50 ml bir tüp içinde akış yoluyla toplayın. pi kullanınhücre süzgecinden dış yan altındaki ekli aracılığıyla Pette, akış toplamak.
    3. 40 mikron hücre süzgecinden 100 mikron hücre süzgecinden gelen akış yoluyla aktarmak için aynı pipet kullanın. buz üzerinde bir 50 ml tüp bu akış yoluyla toplayın. 40 mikron hücre süzgecinden gelen akışı aktarırken, 100 mikron hücre süzgecinden gelen kirlenmesini önlemek için yeni pipet uçları değiştirin.
    4. filtre yeni bir dizi kullanarak adım 5.1.3 hücre süspansiyonu için bu adımları yineleyin.
  3. Numune başına yaklaşık 1 ml 'lik bir son hacim, her numuneden iki akış-through birleştirin.

Antikorlar 6. inkübasyon

NOT: önce ana örneği çalıştırmak için ayarlarda sitometresinde uygun akış ayarı için çoklu kontrol örnekleri hazırlamak için beyin hücre süspansiyonları az miktar kullanın. Her bir antikor etiketleme için, herhangi bir antikor, sadece kendisini de içine kontrol örnekleri hazırlamakDaha sonra condary antikoru (ya da diğer floresan etiket), ve her ikisi de birincil ve ikincil antikorlar (ya da diğer floresan etiket). Akış sitometresindeki spesifik olmayan etiketleme karşı spesifik ayrı kapıları ayarlamak için bu denetimleri kullanın. Mümkün olduğunda, tazminat gerekmez fluorochromes kullanın. , birincil antikorlar ilave edilmeden PBS eklenerek 700 ul'lik nihai bir hacme kadar yolluk kontrol örnekleri nihai hacmi arttırır.

  1. 1,7 mL'lik bir mikro filtre hücre 100 ul numune aktarılarak ışık saçılma ve DAPI kontrol örneği hazırlayın. çekirdek boyama için 1 ug / ml DAPI ile soğuk PBS 600 ul ekle. sonu aşırı uç karıştırma ile 10 dakika süre ile inkübe ve (adım 6.4.5 6.4.2 de gösterildiği gibi) akış sitometresi boyunca geçirilmeden önce yıkayın.
    Not: Bu örnek sadece FACS makinede kalan hücrelerin sıralama önce hücre / çekirdekler kapısı ayarlamak için kullanılır.
  2. 100 & # aktararak tek imüno kontrol örnekleri hazırlayın181; 1.7 mi mikrotüp filtre hücrelerin l. (Örneğin, NeuN antikoru) bir antikor ile soğuk PBS 600 ul ekle. Başka bir antikor (örneğin, Fos antikoru) bir mikrotüp soğuk PBS 600 ul ekle. Bu doğrudan konjüge edilmiş primer antikor değilse gelen ikincil antikor ekleyin.
    NOT: Bu numuneler uygun photomultiplier tüp (PMT) voltajı belirlemek için, ve gerekirse iki floresan sinyallerin çakışmasını değerlendirmek için kullanılır. Antikor konsantrasyonu tüm kanallarda iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için titre edilmelidir. Çakışan floresan sinyalleri de akış sitometresi içinde farklı floresan kanalların iç kalibrasyon telafi edilebilir.
  3. 1,7 mL'lik bir mikro filtre 100 ul hücre aktarılarak, çift flüoresan etiketli negatif kontrol numunesi hazırlanır. Tek başına ikincil antikorlar veya IgG doğrudan konjuge primer antikorlar ile soğuk PBS 600 ul ekleyin.
    NOT: This kontrol numunesi her fluorofor için background fîoresanını tespit etmek sıralamadan önce her kullanılabilir.
  4. Ana örnek hazırlayın sıralanacak.
    1. 1.7 ml'lik mikrotüp içine süzülmüş hücrelerin 700 ul aktarın. Birincil NeuN antikorun Fikoeritrin (anti-NeuN-PE) ile doğrudan konjüge edilmiş: Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) ve 1.4 ul (500 1) ile doğrudan konjüge edilmiş primer Fos antikorun: 7 ul (100 1) ekleyin. sonu aşırı uç karıştırma ile 4 ° C 'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    2. İnkübasyonun sonunda, ana numunesi ve kontrol örnekleri dahil olmak üzere, her bir mikrotüp soğuk PBS 800 ul ve çevirerek karıştırın.
    3. Santrifüj mikrotüpler 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1.300 xg'de. hücre kaybını önlemek için 50 ul süpernatant bırakarak süpernatant atın.
    4. orta derecede büyük bir uç çapı olan bir pipet kullanılarak pelet ve tekrar süspansiyon hücreleri soğuk PBS 1 ml ilave edilir.
    5. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1.300 xg'de santrifüj. Dsüpernatant iscard.
    6. Yeniden askıya 500 ul pelet soğuk PBS (son hacim pelet büyüklüğü bağlı ayarlayın).
    7. Aktarım ve hücre süzgecinden kap (40 um) olan bir yuvarlak dipli FACS deney tüpüne süspansiyonu filtre edin. buz üzerinde immunolabeled hücreleri tutun ve hemen FACS gerçekleştirin. Not: filtreleme için, süzgeç kapağı dikey pipet dokunun ve bunun üzerinden hücre süspansiyonu itin.
  5. Kontrol örnekleri kullanılarak kapıları sitometresinde Set akışı.
    1. Toplam olaylar ve hücresel enkaz nöronal hücre popülasyonunu belirlemek için ışık saçılması ve DAPI kontrol örneği kullanın.
      NOT: - Toplam olaylar (dinlenme enkaz ve kırık hücresel süreçlerdir)% 2 bu hazırlık Hücre gövdeleri sadece 1 bulunmaktadır. DAPI floresan sinyal (işaret çekirdekleri) ve İleri dağılım (hücrenin boyutu) dayanarak geriye Vadeli İşlem ve Side dayalı hücre gövdeleri ve kapıyı bulmak mümkün özelliklerini ışık saçılmasıhücreleri (Şekil 1 A, B, 'de gösterildiği gibi).
    2. PMT voltaj ayarlarını belirlemek için, ve başka bir filtre / kanal (örneğin, Alexa Fluor 488 / FITC veya Phycoerythrine) içine belirli bir florokrom emisyon avantajını analiz etmek tek imüno kontrol örnekleri kullanın. floresan sinyalleri çakışırsa, elle tazminat seviyelerini ayarlayarak üst üste düzeltin.
    3. Pozitif nüfus eşiğini ayarlamak için çift floresan etiketli negatif kumandayı kullanın.
      NOT: Bu örnekte gelen sinyali pozitif olarak kabul edilebilir otomatik floresans ve bu eşiğin üzerinde yer alan ana örnek hücrelere bağlı olduğu düşünülmektedir. Tipik olarak, sıralama için eşik parametreleri daha sıkı ve yaklaşık negatif kontrol yukarıda işaretli hücrelerin üst 2/3 aslında sıralanır vardır.
  6. 1.7 mi mikrotüpler içine FACS ile ana numuneden kriteri nöronlar. RNA 50 ul içine hücreleri toplamakekstraksiyon tamponu. Sıralama girdap ve santrifüj tüpü ve tüpün duvarlarına tüm sıralanmış hücreleri kurtarmak için aşağı 10 kere yukarı ve aşağı pipetleme süspansiyonu karıştırmak sonra.
  7. Tüm hücreler, RNA ekstraksiyonu önce lize sağlamak, ve daha sonra 4 ° C 'de 2 dakika boyunca 2.800 x g'de santrifüj 30 dakika boyunca 42 ° C' de sıralanmış hücre süspansiyonu inkübe edin.
  8. Daha önce 13-15 açıklandığı gibi, RNA izolasyonu, cDNA sentezi, hedef gen ön büyütme ve qPCR için örnek işlemek hemen -80 ° C'de uzun süreli depolama için bir RNaz ücretsiz tüp süpernatantı aktarın veya.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

akut metamfetamin enjeksiyondan sonra tek sıçanların taze ve dondurulmuş dorsal striatum dokudan Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar sıralama.

Yukarıda tarif edilen protokol metamfetamin (5 mg / kg) periton içinden enjekte sonra bir sıçan dorsal striatum, 90 dakika arasında Fos-pozitif ve fos-negatif nöronlar sıralamak için kullanıldı. kendi kafeslerinde naiv sıçanlar kontrol olarak kullanıldı. Dorsal striatum dokusu işlenmişt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FACS, taze ya da dondurulmuş yetişkin beyin dokusundan nöronlar ve diğer hücre tipleri sıralamak için kullanılabilir. Girişte belirtildiği gibi, donmuş doku kullanma yeteneği gibi bağımlılık araştırma öz-yönetim ve nüks çalışmaları gibi karmaşık ve uzun süreli davranış prosedürleri geçirmiş hayvanlardan numune optimum kullanımını sağlar. 2 saat ya da daha uzun süre ve tüm hayvanları gerektiren - Bu davranış prosedürler genellikle 1 sürer - aynı gün 13,18 test edilecektir (10 20 toplam). Beyin diseksiyon, hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIDA Intramural Araştırma Programı (Bruce T. Hope, Yavin Shaham) tarafından desteklenmiştir. FJR, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından yönetilen NIDA Araştırma Katılım Programına atanarak desteklendi ve CONICYT ve Universidad de los Andes tarafından yönetilen bir Becas-Şili bursundan ek mali destek aldı. Santiago, Şili. Johns Hopkins FACS Core tesisi, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nden P30AR053503 Ödülü ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

iba-1

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Koronal beyin dilimleri elde etmek içinbeyin matrisiCellPoint Scientific69-2160-1
Hibernate A düşük floresanBeyin BitleriProtokoldeki HA-lfTampon A, ayrışmadan fiksasyon adımlarına kadar doku ve hücrelerin işlenmesi için kullanılır
AccutaseMilliporeSCR005Protokoldeki enzim çözeltisi, tritürasyondan
önce dokunun enzimatik sindirimi için kullanılırProtein LoBind Tüpü 1.5 ml, protokolsırasında hücre kaybını önlemek içinEppendorf22431081
Hücre Süzgeci, 40 & mBD Falcon352340hücre süspansiyonunu filtrelemek için
Hücre Süzgeci, 100 & mBD Falcon352360hücre süspansiyonunu filtrelemek için
Falcon 5 ml hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpüBD Bioscience,akış sitometresinden geçmeden önce hücre süspansiyonunu filtrelemek için
Pasteur Pipeti, CamNIHdoku tritürasyonu yapmak için6640-00-782-6008
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Klon A60 (fare monoklonal) antikoruEMD Nöronları tespit etmek için miliporeFCMAB317PEantikoru
Fosfo-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Tavşan (Alexa Fluor 647 Konjugat) Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi Fos eksprese eden hücreleri tespit etmek için8677
çekirdekleri etiketlemek içinDAPISigmaD8417
PicoPure RNA İzolasyon KitiUygulamalı Biyosistemler.KIT0204Kit, adım 6.14 için RNA ekstraksiyon tamponunu içerir. RNA
Biosystems'den cDNA'yı sentezlemek içinSuperscript III birinci iplikli cDNA sentez sistemiInvitrogen18080-051'i
.Master'dan hedefli preamplifikasyon4391128
 Uygulamalı Biyosistemler.TaqMan probları Fos TaqMan prob Applied Biosystems kullanılarak PCR 4444963 yapılır
.Rn00487426_g1TaqMan probu/primers
NeuN TaqMan probuUygulamalı Biyosistemler.Nöronal gen belirteci içinCACTCCAACAGCGTGAC
NeuN İleri astarUygulamalı Biyosistemler.GGCCCCTGGCAGAAAGTAGnükleotid dizisi
NeuN Ters primerUygulamalı Biyosistemler.Nöronal gen belirteci içinTTCCCCCTGGTCCTTCTGA
Gfap TaqMan probuUygulamalı Biyosistemler.Rn00566603_m1
> TaqMan probuUygulamalı Biyosistemler.Rn00574125_g1Microglya gen markörü için TaqMan probu/primerleri
Gapdh TaqMan probuUygulamalı Biyosistemler.Referans / temizlik geni içinCTCATGACCACAGTCCA
<> Gapdh< > İleri astarUygulamalı Biyosistemler.Referans / temizlik geni içinGACAACTTTGGCATCGTGGAA
Gapdh< > Ters astarUygulamalı Biyosistemler.Referans/temizlik geni içinCACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA
Oligo2 TaqMan probuUygulamalı Biyosistemler.Rn01767116_m1 Oligodendrositik gen markörü için TaqMan probu/primerleri
P1000 pipetleyiciRainin17014382Hafif doku tritürasyonu için adım 3.1 ve 3.3'te ve hücreleri yeniden süspanse etmek için adım 6.7'de geniş uç çapına sahip pipet olarak adlandırılır
7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemiUygulamalı Biyosistemler.Kantitatif PCR için446985
FACSAria I Hücre SıralayıcısıBD BiosciencesFACS sıralaması için
PCR temiz 352235, tedarik eder antikor, , TaqMan PreAmp Master Mix Applied sıralanmış hücreleri toplamak için kullanılırcDNA TaqMan Advance Fast yapılır nükleotid dizisiNöronal gen belirteci için nükleotid dizisi Astrocityc gen markeriçin TaqMan probu/primerleri nükleotid dizisi nükleotid dizisi nükleotid dizisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
  2. Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
  3. Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
  4. Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
  5. Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  6. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
  7. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
  8. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
  9. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  10. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
  11. Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
  12. Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
  13. Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
  14. Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
  15. Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
  16. US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
  17. Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
  18. Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
  19. Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
  20. Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Taze Dondurulmu DokuH cre DisosyasyonuAk SitometrisiNeuN Mark rFos Proteini

İlgili makaleler