Burada taze ve dondurulmuş hem de beyin dokusundan nöronal topluluklarından Fos-ifade moleküler değişiklikler incelemek için bir Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) protokol mevcut. dondurulmuş doku kullanımı değerli hayvan deneklerin kullanımını maksimize için birden fazla seans boyunca birçok beyin bölgelerinin FACS izolasyonu sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
nöroplastisite ve öğrenilmiş davranışların moleküler değişikliklerin çalışma dernekleri öğrenilen aracılık eden nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan aktif nöronların spesifik setleri çalışmaya tüm beyin bölgelerinin çalışma geçiyor. (FACS) Kontrol THP-en son yetişkin fare beyin dokusu için optimize edilmiş ve nöronal marker NeuN ve fos protein güçlü aktif nöronların belirteci karşı antikorlar kullanılarak aktif nöronların izolasyonu izin verildi. Şimdiye kadar, Fos salgılayan nöronların ve diğer hücre tipleri uzun işlem günü ve uzun ve karmaşık davranış işlemlerinden sonra değerlendirilir beyin örnekleri izin çok kısıtlı gerektirdiği taze doku, izole edilmiştir. 21 gün - Burada dorsal striatum nöronlar ve Fos mRNA Fos-ifade verimleri 3 -80 ºC de donduruldu taze disseke doku ve doku arasındaki benzer olduğunu gördük. Buna ek olarak, fenotip teyitdondurulmuş doku, aynı zamanda, FACS izolasyonu için kullanılabileceğini gösterir nöronal değerlendirmek gen ifadesi (NeuN), astrositik (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ve microgial (Iba1) işaretleri ile NeuN-pozitif ve NeuN negatif kriteri hücrelerin glial hücre türleri. Genel olarak, toplamak incelemek ve birden FACS oturumları için beyin dokusu dondurmak mümkün. Bu genellikle uzun ve karmaşık davranışsal prosedürleri geçirmiş değerli hayvan deneklerden elde edilen verilerin miktarını en üst düzeye çıkarır.
Giriş
öğrenme sırasında, hayvanlar son derece spesifik uyaranların karmaşık setleri arasındaki ilişkileri oluşturmaktadır. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi nöronal topluluklar olarak adlandırılan seyrek dağıtılan nöronların belirli kalıpları içinde değişikliklerle tarafından kodlanan olduğu düşünülmektedir. Nöronal toplulukları son zamanlarda güçlü davranış veya isteka pozlama sırasında aktive edildi gibi Fos, Arc ve Zif268 ve nöronlarda protein ürünleri gibi hemen erken genlerin (Bacaklarını) indüksiyonu ile tespit edilmiştir. Özellikle içerik ve işaret özgü öğrenilen davranışlar 1-4 nedensel rol oynadığı gösterilmiştir nöronlar Fos-dile ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bütün deneyler Laboratuvar hayvanlarında 16 Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberi National Institutes of Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre gerçekleştirilmiştir.
Not: Aksi belirtilmediği sürece, buz üzerinde tutulmuştur kullanımı, düşük bağlanma santrifüj tüpleri aşağıdaki tüm adımları.
Doku Koleksiyonu önce 1. Hazırlık
- 4 o C santrifüj ayarlayın
- Yangın lehçe azalan yaklaşık 1.3 çapları, 0.8, ve her bir numune için 0.4 mm üç cam Pasteur pipetler bir dizi.
- Soğuk Tampon A 1 ml içeren etiketli 1.7 ml-tüpler hazırlayın ve buz üzerinde tüple....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
akut metamfetamin enjeksiyondan sonra tek sıçanların taze ve dondurulmuş dorsal striatum dokudan Fos-pozitif ve Fos-negatif nöronlar sıralama.
Yukarıda tarif edilen protokol metamfetamin (5 mg / kg) periton içinden enjekte sonra bir sıçan dorsal striatum, 90 dakika arasında Fos-pozitif ve fos-negatif nöronlar sıralamak için kullanıldı. kendi kafeslerinde naiv sıçanlar kontrol olarak kullanıldı. Dorsal striatum dokusu işlenmişt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
FACS, taze ya da dondurulmuş yetişkin beyin dokusundan nöronlar ve diğer hücre tipleri sıralamak için kullanılabilir. Girişte belirtildiği gibi, donmuş doku kullanma yeteneği gibi bağımlılık araştırma öz-yönetim ve nüks çalışmaları gibi karmaşık ve uzun süreli davranış prosedürleri geçirmiş hayvanlardan numune optimum kullanımını sağlar. 2 saat ya da daha uzun süre ve tüm hayvanları gerektiren - Bu davranış prosedürler genellikle 1 sürer - aynı gün 13,18 test edilecektir (10 20 toplam). Beyin diseksiyon, hücr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma NIDA Intramural Araştırma Programı (Bruce T. Hope, Yavin Shaham) tarafından desteklenmiştir. FJR, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından yönetilen NIDA Araştırma Katılım Programına atanarak desteklendi ve CONICYT ve Universidad de los Andes tarafından yönetilen bir Becas-Şili bursundan ek mali destek aldı. Santiago, Şili. Johns Hopkins FACS Core tesisi, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüsü Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü'nden P30AR053503 Ödülü ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
iba-1
PCR temiz 352235, tedarik eder antikor, , TaqMan PreAmp Master Mix Applied sıralanmış hücreleri toplamak için kullanılırcDNA TaqMan Advance Fast yapılır nükleotid dizisiNöronal gen belirteci için nükleotid dizisi Astrocityc gen markeriçin TaqMan probu/primerleri nükleotid dizisi nükleotid dizisi nükleotid dizisi
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Koronal beyin dilimleri elde etmek için | beyin matrisi | CellPoint Scientific | 69-2160-1 |
| Hibernate A düşük floresan | Beyin Bitleri | Protokoldeki HA-lf | Tampon A, ayrışmadan fiksasyon adımlarına kadar doku ve hücrelerin işlenmesi için kullanılır |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Protokoldeki enzim çözeltisi, tritürasyondan |
| önce dokunun enzimatik sindirimi için kullanılırProtein LoBind Tüpü 1.5 ml, protokol | sırasında hücre kaybını önlemek için | Eppendorf | 22431081 |
| Hücre Süzgeci, 40 & m | BD Falcon | 352340 | hücre süspansiyonunu filtrelemek için |
| Hücre Süzgeci, 100 & m | BD Falcon | 352360 | hücre süspansiyonunu filtrelemek için |
| Falcon 5 ml hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü | BD Bioscience | , | akış sitometresinden geçmeden önce hücre süspansiyonunu filtrelemek için |
| Pasteur Pipeti, Cam | NIH | doku tritürasyonu yapmak için | 6640-00-782-6008 |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Klon A60 (fare monoklonal) antikoru | EMD Nöronları tespit etmek için milipore | FCMAB317PE | antikoru |
| Fosfo-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Tavşan (Alexa Fluor 647 Konjugat) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | Fos eksprese eden hücreleri tespit etmek için | 8677 |
| çekirdekleri etiketlemek için | DAPI | Sigma | D8417 |
| PicoPure RNA İzolasyon Kiti | Uygulamalı Biyosistemler. | KIT0204 | Kit, adım 6.14 için RNA ekstraksiyon tamponunu içerir. RNA |
| Biosystems'den cDNA'yı sentezlemek için | Superscript III birinci iplikli cDNA sentez sistemi | Invitrogen | 18080-051'i |
| . | Master'dan hedefli preamplifikasyon | 4391128 | |
| Uygulamalı Biyosistemler. | TaqMan probları Fos TaqMan prob Applied Biosystems kullanılarak PCR 4444963 yapılır | ||
| . | Rn00487426_g1 | TaqMan probu/primers | |
| NeuN TaqMan probu | Uygulamalı Biyosistemler. | Nöronal gen belirteci için | CACTCCAACAGCGTGAC |
| NeuN İleri astar | Uygulamalı Biyosistemler. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nükleotid dizisi |
| NeuN Ters primer | Uygulamalı Biyosistemler. | Nöronal gen belirteci için | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA |
| Gfap TaqMan probu | Uygulamalı Biyosistemler. | Rn00566603_m1 | |
| > TaqMan probu | Uygulamalı Biyosistemler. | Rn00574125_g1 | Microglya gen markörü için TaqMan probu/primerleri |
| Gapdh TaqMan probu | Uygulamalı Biyosistemler. | Referans / temizlik geni için | CTCATGACCACAGTCCA |
| <> Gapdh< > İleri astar | Uygulamalı Biyosistemler. | Referans / temizlik geni için | GACAACTTTGGCATCGTGGAA |
| Gapdh< > Ters astar | Uygulamalı Biyosistemler. | Referans/temizlik geni için | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA |
| Oligo2 TaqMan probu | Uygulamalı Biyosistemler. | Rn01767116_m1 | Oligodendrositik gen markörü için TaqMan probu/primerleri |
| P1000 pipetleyici | Rainin | 17014382 | Hafif doku tritürasyonu için adım 3.1 ve 3.3'te ve hücreleri yeniden süspanse etmek için adım 6.7'de geniş uç çapına sahip pipet olarak adlandırılır |
| 7500 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR sistemi | Uygulamalı Biyosistemler. | Kantitatif PCR için | 446985 |
| FACSAria I Hücre Sıralayıcısı | BD Biosciences | FACS sıralaması için |
Kaynaklar
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell ne....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
