Tıbbi Cihazlar Bakterilerin yüksek verimlilik Kimlik Savar Polimerler

Özet

Tıbbi cihazlarda bakteriyel yüzey bağlanmasını azaltan polimerlerin tanımlanması için yüksek verimli bir mikrodizi yöntemi açıklanmaktadır.

Özet

Tıbbi cihazlar genellikle hastane kaynaklı enfeksiyonlarla ilişkilidir ve bu da hastalar ve sağlık sistemi üzerinde büyük bir yük oluşturur ve antimikrobiyal dirence katkıda bulunur. Cihazla ilişkili enfeksiyonların azaltılması için olası bir yol, bu cihazlar için bakteri itici polimer kaplamaların tanımlanmasıdır, bu da ilk bağlanma adımında bakteri bağlanmasını önleyecektir. Yüzlerce polimerin bir mikrodizi kullanılarak paralel olarak taranmasına dayanan bu tür itici polimerlerin tanımlanması için bir yöntem burada açıklanmaktadır. Bu yüksek verimli yöntem, klinik olarak ilgili çeşitli bakteri türlerinin ayrı ayrı ve aynı zamanda çok tür toplulukları olarak bağlanmasına direnen bir dizi umut verici polimerin tanımlanmasıyla sonuçlandı. Bir polimer, PA13 (poli (metilmetakrilat-ko-dimetilakrilamid)), ticari olarak temin edilebilen iki merkezi venöz kateter üzerine kaplandığında bir dizi hastane izolatının bağlanmasında önemli bir azalma göstermiştir. Açıklanan yöntem, bakteri bağlanmasının modifikasyonunun önemli olduğu çok çeşitli uygulamalar için polimerleri tanımlamak için uygulanabilir.

Giriş

Polimer mikrodizileri kadar 7,000 polimerleri ¹ prokaryotik veya ökaryotik hücreler, ² paralel analiz için cam slaytlar üzerine yazdırılma yüksek verimlilik platformlar minyatür edilmiştir. Burada sunulan yöntem, ilk 2010 ^3'te tarif olanı üzerine kuruludur. Bu tarama sistemi, insan hepatositlerde ^4, kök hücrelerin ^5, renal tübüler epitel hücreleri ^2, bakteriler ^3,6 ve protozoon patojenler ⁷ de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri uygulanmıştır. Her iki durumda da, teşvik ya da üzerinde çalışılan hücre bağlanmasını dirençli polimerler, ⁸ tespit edilmiştir. Sentetik polikatyonik polimerler ile DNA kompleksleri de gene aday ⁹ yüksek verimli tarama mikrodizi biçiminde kullanılmaktadır. Yanı sıra hücre alt-tabaka etkileşim için tarama, polimerin mikrodizileri da malzeme özellikleri ¹⁰ değerlendirmek için kullanılmıştır.

">, Bir yüzeye bakteri bağlanmasını modüle etmek üzere sentetik polimerlerin özelliği de ^3,6,11 kurulur. Keşfetmek biyo bakteriyel bağlama. Konvansiyonel yaklaşımlar etkilediği bilinmektedir yük, hidrofobiklik ve polimer yüzeyin yüzey pürüzlülüğü de dahil olmak üzere çok sayıda faktöre bu sırayla yoluyla bakteri bağlanması ya da ampirik olarak tasarlanması ve bir seferde bir malzeme test dirençli emek-yoğun, masraflı ve zaman alıcı işlemlerdir. Polimer mikroarray'ler bu tür sınırlamalar engellemeyi için cazip bir alternatif sunuyoruz.

Karmaşık bir nüfus biyofilm olarak adlandırılan yüzey ilişkili bakteriler büyümek - Böyle biyofilm birçok çevresel streslere ve antibiyotiklere oldukça dirençlidir. Bu durum, ¹² (proteinler, polisakkaritler, nükleik asitler oluşan) kendi yoğun hücre dışı matris ve kısmen biyofilm ¹³ sağlam "persistor" hücrelerinin artan varlığına kısmındadır. gerçi^{16 -} ugh yüzey dernek ve sonraki biyofilm oluşumunun kesin mekanizmalar karakterize etmek zordur, genellikle yüzey büyüme ¹⁴ üç farklı aşama vardır olduğuna inanılmaktadır. Başlangıç, geri bağlantı hücrelerinin güçlü yapışması izlemektedir, hücre dışı bir protein üretimi ve polisakarit matrisi ve hücre proliferasyonu ile biyofilm kurulması. Son olarak, olgun biyofilm bültenleri yerde yeni enfeksiyonları başlatabilir planktonik hücreler, serbest yaşayan. Bakterilerin ilk eki önlemek ve dolayısıyla biyofilm oluşumunun erken aşamalarında önlemek polimerler bakteri kovucu, potansiyel enfeksiyonları en aza indirmek için mükemmel bir çözüm oluşturmaktadır. Antibiyotik direnci artışı göz önüne alındığında (ve aynı zamanda bir yüzey ile ilişkili bakterilerin ¹² içsel daha direnci), enfeksiyonları azaltmak için antibiyotik içermeyen yollarla, özellikle ilgi konusudur. hastane ortamında, polimer bakteri kovucukaplamalar genellikle etrafında implante cihazlar ¹⁷ oluşturan hastane enfeksiyonlarının, azaltılması doğrudan tıbbi uygulama olabilir.

Burada, isabet doğrulama ve daha sonra kaplama ve santral kateter malzeme deneyi, ardından hastane enfeksiyonları ile ilgili patojenik bakterilerin bir dizi karşı itici bir aktivitesi için 381 polimerlerin taranması için yüksek verimli bir yöntem olup, (Şekil 1) tarif edilmektedir. Kısaca, polimerler, kurutma ve sterilizasyondan sonra, minyatürleştirilmiş diziler klinik olarak önemli bakteri kültürleri ile inkübe edildi, temasla baskı ile agaroz kaplı cam lam üzerine tespit edildi ve. İnkübasyondan sonra, mikrodiziler hafifçe yıkandı ve yapışan bakteri hücreleri, lekeli ve floresan ile görselleştirilmiştir. Daha sonra, bağlanma, bakteriyel inhibe polimerleri cam kapak slipleri üzerine kaplanarak daha geniş bir ölçekte incelendi ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir. seçilen iterlerödünç polimerler daha sonra ticari bir kateter üzerine kaplanmış ve yaklaşık 100 kat bakteri yapışmasını azalttığı gösterilmiştir.

Protokol

Agaroz Kaplı Slaytlar 1. Hazırlık

Not: Polimer mikrodizileri imal önce aminoalkylsilane kaplı cam lam spesifik olmayan bağlanma arka en aza indirmek ve bağlanan ya da bakterilerin ⁶ püskürtmek polimerlerin değerlendirilebilmesi için agaroz IB ile kaplanır. Silan kaplama slaytlara agaroz bağlanmasını kolaylaştırır.

1. Bir% 2 Makyaj 250 ml şişe damıtılmış su içinde agaroz IB'nin çözeltisi (w / v).
2. çözülene kadar gevşek şişe kapatma sonra, 30 saniye süre mikrodalga fırında süspansiyon ısıtın. kapak sıkıca olası basınç birikmesini önlemek için kapalı olmadığından emin olun. Düzenli şişeyi çıkarın ve yavaşça girdap.
3. Katı çözündüğünden emin olmak ve çözelti açıktır. Bir sıvı solüsyonu muhafaza edilmesi için bir 65 ° C su banyosu içinde, bu agaroz 100 ml'lik bir behere çözeltisi ve yer dökün.
4. Agaroz çözeltisi içine silan kaplı slaytlar Dip düzgün bir kaplama sağlanması, ve wiBir kağıt mendil ile slayt arka pe.
5. (Bir dolap içinde, örneğin veya çeker ocak) tozsuz bir ortamda, kaplamalı tarafı yukarı gelecek şekilde, slaytlar kurulayın 24 saat en az.
6. görsel inceleme ile düzgün bir kaplama teyit edin. yoğunlaşmayı kaplanmamış bölgelerde oluşturacak - Kaplama kolayca slayt üzerine nefes yoluyla değerlendirilebilir. tamamen ve eşit kaplı tek slaytlar mikroarray baskı için kullanılmalıdır.

Baskı Polimer Çözümleri 2. Hazırlık

1. Çözelti hazırlayın (% 1 w / v) cam şişelere N-metilpirolidon (NMP) içinde poliakrilatlar, poliakrilamidler ve poliüretanlardan oluşan önceden oluşturulmuş bir polimer seçimi. (Her polimerin 1 ml hazırlanması). polimer kadar Vortex tamamen çözülür. Polimer Sentezi başka ⁶ anlatılmıştır.
2. Bir mikro pipet kullanarak, çapraz conta olup sağlanması, 25 ul bir polimer çözeltisi ile 384 mikro levhanın her bölmesine dolguermesi ve her çukur benzersiz polimer içerir. En az 2 kuyularda bir negatif kontrol olarak NMP kullanın. Bir yuvalı plaka şablonu veya elektronik dosya her bir polimer çözeltisi tanımlanabileceğine.

3. Baskı Polimer Mikroarray'ler bir İletişim Yazıcı Kullanma

NOT: mikroarray'ler baskısı bir temas yazıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Polimer mikroarray baskı ile ilgili özel talimatlar aşağıda verilmiştir. Yazıcı ve emniyet öneriler kullanarak genel yönergeler için, üreticinin kullanım kılavuzu takip edin. bir iletişim yazıcı kullanmasına rağmen, uygun bir el damgalama cihazı da kullanılabilir.

1. Yazıcı kılavuzdaki tavsiye gibi, (8 satır ve 4 sütun olarak düzenlenmiş) 32-pin microarraying kafasını kullanarak, dörtlü 384 sıvılar (polimer çözeltileri veya NMP) baskı sağlayan bir rutin (adım 3.3) oluşturun.
2. 48 satır ve 32 sütun olarak düzenlenmiş 1536 noktalar yazdırın. 12 bölümünde yazdırmak için rutin ProgramBöylece s, yani., bir seferde 32 çözümleri, yazıcı pimleri temizliği sağlamak için her bölüm yazdırdıktan sonra durdurulabilir.
3. Bir baskı rutin oluşturmak için:
   1. yazılımını açın ve kullanılabilir seçenekler arasından seçim yapın 'Yeni bir rutin oluşturun'. Deney giriş ayrıntıları 'Açıklama' sekmesini seçin. 'Baş' sekmesini seçin ve '32-pin microarraying kafa 'seçin.
   2. 'Kaynak' sekmesini seçin ve plaka tutucu (kaynak plaka tutucu (1x5)), plaka tipi (x 6,000 plakalı 384), toplam plakalar seçin (1) ve (sütunlar) tarafından kaynak sırası.
   3. sekme 'Slide tasarım' olarak, '3x1' slayt seçin 'tarafından arraying seçin' Alan sayısı '. Ardından 'arraying desen' seçeneğini seçin. Girdi 'düzeni' ve 'Satır sayısı' olarak 'Desen boyutları' olarak 'Nokta görünümü' (6), 'Sütun sayısı' (8), 'Satır Saha' (750) ve 'Sütun saha' (560). köknar yazdırmak için bir bölüm seçint.
   4. 'Slide düzeni' sekmesi girişi slaytlar sayısı baskı için kullanılan. girişine (mürekkepleme başına pul sayısı: 1, nokta başına pul sayısı: zaman damgası 5: 200 ms zaman mürekkep: 100 milisaniye) baskı parametrelerini 'Yazdır' sekmesini seçin.
      NOT: Bir rutin şimdi (8 satır ve 4 sütun olarak düzenlenmiş) 32-pin microarraying kafasını kullanarak, dörtlü 384 sıvıları (polimer çözeltileri veya NMP) yazdırmak için oluşturulur. Toplam rutin 48 satır ve 750 mikron satır Saha ve 560 um sütun zift ile 32 sütun olarak düzenlenmiş 1536 noktalar yazdırır.
4. platformda agaroz kaplı slaytlar yerleştirin ve konumda slaytlar tutmak için iyi bir vakum sızdırmazlık sağlamak.
5. tüm pimleri aynı yükseklikte böylece baskı kafasını ayarlayın. el bir bardak slayt üzerine kafa düşürücü ve pimleri aynı anda yukarı taşımak olduğunu onaylayarak bu kontrol edin. yüksekliği ile herhangi bir tutarsızlık varsa, kovanı kullanarak ayarlamakpin up veya aşağı e.
6. Doğru yönde plaka tutucu, yani., Iyi A1 sahibinin sağ üst etmektir üzerinde plaka koyun ve iyi plaka sıkıca sabitlenir olduğundan emin olun.
7. yükseklik ayarlayıcısı kullanarak, plaka sahibinin yüksekliği polimer çözümlerini seçerken, pim kuyuların dibine dokunmayın böyle olduğundan emin olun.
   NOT: Bu sayede çapraz kontaminasyon neden bitişik kuyuların içine Polimer çözeltilerinin dökülmesini önlemek için de üniforma polimer tespit için önemli ve.
8. 'Başlat' sekmesini seçin ve 'Normal' olarak 'Run türü' seçin. 'Çalıştır' düğmesine tıklayın ve bu slayt, plaka onaylamak, vb istendiğinde konumda bulunmaktadır.
9. bölümler arasında pimleri temizlenmesi için izin, bir süre (12 kesitler bir seferde 32 çözümleri) 1 bölüm yazdırın. pimleri tamamen kuru olduğundan emin olmak için, kuru kağıt mendil ardından iyice kağıt havluyla aseton batırılmış işaretçilerine, temizleyin.
10. microarrays baskı tamamlanması üzerine, bir slayt tutucuya yerleştirin ve fırında polimer noktalarının NMP çıkarmak için 45 ° C'ye ayarlanmış vakumlu bir gece boyunca kurutun. 30 dakika boyunca UV ışığı ile Sterilizasyon sonrasında, mikrodiziler bakterilerin aşılanması için hazırdır.
11. (5. bölümünde açıklandığı gibi) bakteriler ile slaytlar aşılamak önce, eşiğe bir ölçüm yapın. bakteriyel bağlama hesaplanmasında bu ölçü kullanın.

Bakteri ile Polimer Mikroarray'ler 4. Aşılama

NOT: İyi aseptik teknik emin olun. kültürlerin her işlem, steril bir ortamda yapılmalıdır: Bunsen beki kullanarak veya akış başlığı içinde ya. Kültürler her bir türün ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir oksijen varlığı, büyüme ortamı, ve sıcaklık yetiştirilmelidir.

1. 5 ml Luria-Bertani etsuyu (LB aşılayarak gecelik kültürler hazırlanması: 10 g ^L-1 bakto-tripton, 5 g ^L-1 NaCI, 10 g L ^{-1 bir tabak bir koloni ile maya özütü). 200 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.}
2. gliserol (% 10 konsantrasyon Genel olarak) eklenerek gece boyunca kültürler dondurucu stokları hazırlayın ve -80 ° C'de stok saklayın.
3. çözülmüş bakteriyel stoklar örnekleri hücre sayısını belirlemek için, her bir stok seri dilüsyonları gerçekleştirmek ve katı ortam üzerinde gece boyunca bakteri büyür. Stoklarında hücre sayıları doğru belirlenmesi, her türün ⁶ uygun aşılama sağlar.
4. mikrodizi için inokulum hazırlayın. Tek türlü kültürleri yukarıda büyütüldü ve microarrays doğrudan uygulanır. BacMix-1 Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) ve Staphylococcus aureus (S. aureus) 'in bir bakteriyel karışımıdır. BacMix-2 Streptococcus mutans (S. Mutans) aşağıdakilerden oluşan bir bakteriyel karışımı, S. aureus , K. pneumoniae ve Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Ya karışık kültür üretmek için eşit hacimlerde (3 ml her biri) içinde geceleme karıştırın ve taze LB ile (yaklaşık 50 ml son hacim kadar) dört kez sulandırmak.
6. Dikdörtgen 4 oyuklu plakalarda, UV ile sterilize edilmiş bir polimer mikrodizileri koyun ve 5 gün süre ile hafif bir çalkalama (30 rpm) ile 37 ° C 'de karıştırılır bakteri kültürlerinin 6 ml ile inkübe edin.
7. (: 10 mM _Na-2 HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, PBS) 1 ug ml bir çözelti ile inkübe ^-1 4 inkübasyonundan sonra, yavaşça fosfat tamponlu salin ile iki kez mikrodiziler yıkayın 30 dakika boyunca PBS içinde ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) lekesi.
8. bir zamanlar PBS değişen, PBS ile kaplama ve hafifçe dönen bir taze plaka lekeli mikroarray slaytlar yıkayın. hava akımı altında kurutulur. yapıştırıcı ile yerine mikroarray slayt ve mühür bir cam kapak kayma uygulayın. d kezRy,% 70 (h / h) etanol ile dış yüzeyi sterilize edin.
9. Güvenli bir şekilde muhafaza düzeyine göre kültürlerin atmayın.

5. Mikrodizin Görüntüleme ve Analiz

1. aydınlık ve DAPI (Ör / Em = 358 nm / 361 nm) kanallarında her polimer nokta için tek görüntüler yakalayın. 20X objektif ile donatılmış bir floresan mikroskop ya da (bir görüntü elde etme yazılımı tarafından kontrol edilen bir XYZ evre) otomatik floresan mikroskop kullanılarak el ile bu gerçekleştirin.
   NOT: Yazılımı faaliyet ve aydınlık ve DAPI kanallarını kullanarak görüntüleri elde etmek için mikroskop ayarlamak için manuel ^18'e bakın. tüm mikroarray'ler için görüntü yakalamak için kazanç ve maruz kalma süresi aynı olduğundan emin olun.
2. Spot alanı seçme ve bir görüntü işleme yazılımı ile floresan niceleme DAPI kanalında her yerinde ortalama floresan yoğunluğu edinin.
3. Her bir nokta eşiğe için, obtabir suret mikrodizisi üzerinde polimer noktalarının görüntüleri, sadece herhangi bir bakteri ile ortam ile inkübe edilir. bakterilerden floresan elde etmek için nokta yoğunluğu arka floresan düşeriz.
4. Çeşitli polimerlerin ⁶ bağlayıcı bakteriler karşılaştırmak için kullanılan her polimer, temsil, dört noktalardan ortalama normalize değerini hesaplayın.
5. 'Hit' polimerler ⁶ olarak en az bakteriyel bağlanma (en düşük floresan) sergileyen polimerler belirleyin.

'Hit' Doğrulaması için Kapak Slips 6. Kaplama

1. Polimerler ile kaplayın lameller için:
   1. 'Hit' polimer çözeltilerini hazırlama (~% 2 a / h) tetrahidrofuran (THF) ya da başka uygun bir çözücü.
   2. 10 saniye boyunca 2000 rpm'de bir eğirme kaplayıcı kullanılarak polimer çözeltileri ile uygun boyutta sıkma kaplama yuvarlak cam lameller.
      Not: bir eğirme kaplayıcı yokluğunda, lamelleri ya da diğer maddeler, sıkma, ancak daldırma ile kaplanmış olabilirKaplama daha düzgün bir yüzey oluşturur.
   3. gece boyunca 40 ° C'de bir konveksiyon fırınında kaplanmış lamelleri kuru ve önceki aşılama bakteri 30 dakika boyunca UV-Işık altındaki sterilize edin.
2. Negatif Kontroller için Agaroz ile kaplayın lameller için:
   1. ya da plazma işlemi ile temiz lamelleri 10 dakika için ya da 4 saat süre ile, 1 M NaOH içinde daldırılması.
   2. gece boyunca,% 1 (3-aminopropil) trietoksisilan ihtiva eden asetonitril lamelleri bırakın. aseton ile 3 kez lamelleri temizleyin ve 1 saat boyunca bir fırında (100 ° C) konulmuştur.
   3. Daldırma kaplama, 60 ° C'de bir su banyosu içinde muhafaza% 1 agaroz sulu bir çözelti ile kurutuldu lamelleri. 24 saat boyunca tozsuz ortam koşullarında düz bir yüzey üzerinde agaroz kaplanmış lamelleri ve önceki aşılama bakteri 30 dakika boyunca UV-Işık altındaki sterilize edin.

7. Bağlanma ve Taramalı Elektron Mikroskobu kullanılarak Kapak Kayma Analizi (SEM)

1. Sonra30 dakika boyunca UV ışığı ile sterilizasyon, standart 12 oyuklu plaka ya da (lamelleri boyutuna bağlı olarak), 24 oyuklu bir plaka içerisinde kapak slipleri (polimer / agaroz kaplanmış veya kaplanmamış cam) yerleştirmek ve bakteri kuluçkalanması bölümünde tarif edildiği gibi 4.
2. bakterilerle inkübasyondan sonra, 0.1 M kakodilat tampon maddesi (pH 7.4) ile iki kez kaplanmış ve kaplanmış lamelleri yıkama ve daha sonra 2 saat süre ile% 2.5, 0.1 M kakodilat tampon içinde glutaraldehid (w / v) (pH 7,4) ile tespit edin.
3. % 1, oda sıcaklığında 1 saat süreyle (a / h) ozmiyum tetroksit ve 30 dakika her biri için 50, 70, 90 ve 100% (h / h) en sıralı etanol yıkama ile dihidrat ile sonrası düzeltme örnekleri.
4. Standart protokollere ^19'a göre CO ₂ kuru örnekler. Kuruma süresi, numunenin doğasına bağlı olacaktır.
5. Torr 0.75 30 mA akım ve vakumlu püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak altın / paladyum alaşımı (60/40%) olarak Coat örnekleri. Standart protokoller ^20'deki gibi bir elektron mikroskop altında inceleyin.
   NOT: Ensson derece zehirli olduğu gibi ure yeterli güvenlik önlemleri, depolama, taşıma ve osmiyum tetroksit elden çıkarılmasından kaynaklanan riskleri yönetmek için.
6. Görme kaplanmamış lamelleri görüntüleri karşılaştırmak ve agaroz ya da 'hit' polimerler ile kaplanmış olan polimerlerin bakteriyel bağlanma / kovucu yeteneklerini onaylamak için.
   NOT: ekin Direnç mevcut hücrelerin bir azalma olarak kolaylıkla görünür olmalıdır.
7. En umut verici tıbbi cihazlar (örneğin, santral venöz kateterler) ⁶ ile kaplama çalışmaları için bağlayıcı olmayan polimerler 'hit' seçin.

Kaplama Kateter için bir çözücü 8. seçimi

1. Kateterin kalıcı kısmı ile uyumluluğu, hem de 'hit' polimeri çözmek için kabiliyetleri için çeşitli çözücüler değerlendirir. uzunluğu 5 mm cath-1 ve silindirik parçalar halinde parçalar kesmek ve bir dijital Vernier kumpas ile ölçülür.
2. Böyle Acet gibi çeşitli çözücüler değerlendirinIC asit, amonyak, aseton, asetonitril, dietil eter, tetrahidrofuran (THF), dimetilformamid (DMF), N-metil-2-pirolidon (NMP), etanol, metanol, etilen glikol, toluen ve ksilen. 12 saat boyunca solventler kateter parçaları daldırın ve kateter ve çözücünün netlik bütünlüğü için görsel değerlendirir.
   Not: kateterler akmasına veya parçalanma veya bulanık bir çözücü ile sonuçlanması neden olmayan bir çözgen seçin. Çözücü 'hit' polimerler çözülür gerekir.

Konfokal Mikroskopi Kateter üzerinde bakteri Ek 9. Analizi

1. % 2.5 hazırlanması (a / h) aseton, veya diğer uygun bir çözücü içinde, polimer çözeltiler, küçük cam şişeler (5 mi) içine bölümünde 8. Talep 5 mm kateter parçaları belirlenmiş ve 2 dakika boyunca, polimer çözeltisi, 1 ml sokmaktan şekilde . Fazla polimer çözeltisi çıkarın ve 40 ° C'de vakumlu bir fırın içerisinde gece boyunca kateter parçaları kurutun.
2. Çözülmüş bakteriyel st karıştırılarak inokulum hazırlayınocks 50 ml LB ⁶ her türün yaklaşık 10 ⁶ hücre elde edildi.
3. 30 dakika boyunca UV ışığı ile kaplanmış ve kaplanmamış kateter parçaları sterilize ve yumuşak çalkalama ^6, 3 gün boyunca 37 ° C 'de, 24 oyuklu bir plaka içerisinde LB aşılandı 1 ml inkübe edin.
4. İnkübasyondan sonra, PBS (2x, 2 mi) ile kateter yıkama, 30 dakika boyunca PBS içinde% 10 paraformaldehit ile bakteri düzeltmek ve PBS (1 mi) ile yıkayın. DAPI ile kateter parçaları üzerinde bakteri (1 ug ml ^{- 1)} leke, 20 dakika boyunca PBS (1 mi) ile yıkayın.
5. - Airy1, görüntü boyutu - 1.024 × 1024 piksel, voksel genişlik - 105.2 nm, 0.5μ m aralığı Z-yığınlar 405nm mavi lazer diyot, dedektör aralığı 414 nm 502, pim deliği: Aşağıdaki ayarları kullanarak kateter parçaları konfokal görüntü elde , büyütme - 40X 1.25.
6. kateter 100 mikron uzunluğu boyunca Z-istifleme 50 görüntüleri ile konfokal görüntüleme tamamlayın.
7. suitab kullanarak görüntüleri analizle analiz yazılımı: Bir kateter parçasının tek bir görüntü oluşturmak için, alan derinliği genişletmek için işlevini kullanarak, Z düzleminde Z-yığılmış görüntüleri dümdüz.
   NOT: Bu görüntü daha sonra 'arka düzleştirmek' fonksiyonunu kullanarak background-düzeltildikten sonra, bakteriler tarafından kapsanan kateterin alanı elde etmek analiz edilmelidir.

SEM ile Kateter üzerinde bakteri Ek 10. Analizi

1. % 10 aseton (hacim / ağırlık) bir polimer çözeltisi hazırlanır.
2. Bir pipet basın kateterin kesim parçasının orta kısmına (200 ul mikropipet için) onu tutmak için ve yaklaşık 30 saniye boyunca polimer çözeltisi içinde parça batırın. 30 dakika için çevre koşullarında kaplanmış parça kurutulur. ortam koşullarında polimer çözeltisinin ve kuru gecede içine tekrar daldırarak ikinci tabaka ile kaplayın.
3. bakteri, UV tedavisi ve inkübasyondan sonra (n = 3) PBS ile (2x, 1 mi) ve 1 ihtiva eden 48 oyuklu plakalara transfer parçaları yıkama30 dakika boyunca PBS içinde% 0 formaldehid. Bu işlemin ardından, PBS (1 mi), oda sıcaklığında kuru bir gece boyunca parçaları yıkama iletken karbon disklerle koçanları monte ve bir püskürtme kaplayıcı kullanılarak altın kaplama (adım 7.5).
4. Bir taramalı elektron mikroskobu ⁶ kullanarak görüntüleri elde edebilir.

Sonuçlar

Şekil 2, mikro-dizi analizi ile saptandığı haliyle polimer bir dizi bakteriyel eki (normalize floresan yoğunluk) göstermektedir. Agaroz kuvvetle ⁶ bağlayıcı bakteri üremesini direnir olarak polimer olmadan basılı noktalar (MHP sadece), negatif kontrol vardır - kaydedilen floresan çok düşüktür. Görüntülenen polimerler tüm düşük bağlayıcı çoğu durumda, bir polimerin itici özellikler test edilen bakteri türleri arasında önemli ölçüde değişiklik gösterir. Bu farklı türler arasında bağlanma mekanizmaları arasındaki geniş farklılıkları yansıtır. Uygun bir polimerin seçimi uygulamaya muhtaçtır, ancak düşük bağlayıcı polimerlerin kolayca agaroz ile karşılaştırılması ile belirlenmiştir. Yüksek bağlayıcı polimerler bir dizi içinde tespit edilmesi olasıdır ve sonraki deneylerde pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. DAPI kanal otomatik floresan göstermemektedir polimerler, nitel CO(Şekil 3'de gösterildiği gibi, tek bir temsili yüksek bağlayıcı polimer, üç örnek, düşük bağlayıcı polimerler vurgulayarak) Noktası görüntü mparison görsel yapılabilir. Bu karşılaştırma, istatistiksel analiz daha az bilgi sağlarken, hesaplanan yoğunluk değerlerinin kullanışlı görsel doğrulama olabilir.

22 Uygun polimerler mikrodizisi kullanılarak tespit ile, ölçek büyütme deneyleri büyük yüzeylerin kaplanması için kullanıldığı zaman kendi bakteri tutmayan özelliği onaylamak için yürütülmektedir. (SEM ile analiz (Şekil 4 ve 5)) kat cam kapak fişleri ve kateter dilimleri (konfokal mikroskopi (Şekil 6) ve SEM ile analiz (Şekil 7)) için kullanılan en iyi performans gösteren örnekler gösterilmiştir. Hem mikroskobik yöntemler kesin veri sağlayan, yüzeyde doğrudan hücre sayımı izin yararı var; hücre eki azalma visibl kolayca olduğunue. En iyi yanı büyük ölçekli kaplama teknikleri için uygun olarak, ölçek-up onların itici özelliklerini muhafaza Bu kaplamalar, ayrıca incelenmiştir. Gösterilen sonuçlar her aşamasında en iyi performans gösteren polimerler göstermektedir.

Şekil 1:. Biyomedikal uygulamalar için polimer mikroarray'ler yoluyla bakteri tutmayan polimerlerin tanımlanması yer Adımlar SEM = taramalı elektron mikroskobu.

Şekil 2:. Bakteriyel mikro-dizi analizi ile belirlenen polimerlerin bir dizi bağlayıcı düşük poliakrilatlar / akrilamid (PA) ve poliüretanlar (PU) bir dizi görülmektedir bağlayıcı bakteriyel. Polimer mikrodizileri alınan sonuçlar çeşitli bakteri s ile problanmış PECIES (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans ve iki konsorsiyum, BacMix-1 ve BacMix-2) gösterilmektedir. arka plan ortalama DAPI floresan (normalize) düzeltilmiş gibi bakteriyel ifade bağlama. Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler. Referans ⁶ uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Temsili polimerler üzerinde bakteri eki gösteren BacMix-2 polimer noktalar Örnek görüntüleri Floresan (DAPI) ve aydınlık mikroskobu görüntüleri. Bir güçlü bağlayıcı polimer birkaç bağlayıcı olmayan polimerler (PU-20, PA-336 ve PU-179) ile karşılaştırma için dahildir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Referans ⁶ uyarlanmıştır.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: 'hit' polimerler (Tablo 1'den seçilen örnekler) ile kaplanmış kaplanmamış cam ve cam üzerinde bakteri eki gösteren Ölçek-up cam kapak slipleri ile deneyler SEM görüntüleri.. Ölçek çubukları 20 mikron =.

Şekil 5:. En iyi 'hit' polimerler ile kaplanmış yüzeylerin, birim alan başına, birleşmiş hücrelerin bakteriyel SEM görüntülerinden hücre sayısı ile ölçülmüştür bağlanma karşılaştırması. Agaroz bir kontrol bağlama yüzeyi olarak cam bir kontrol 'bağlayıcı' bir yüzey olarak kullanılmıştır. Hata çubukları temsilstandart sapma.

Şekil 6: Kaplanmış ve kaplanmamış kateter dilimleri üzerinde bakteri bağlama karşılaştırması BacMix-2 ile inkübasyondan sonra PA13 (B) ile kaplanmış muamele edilmemiş kateter (Katater-1) (A) ve kateter karşılaştırırken Konfokal ve görüntüler.. 40X objektif (Ölçek çubuğu = 20 mm) ile çekilen resimler. Referans ⁶ uyarlanmıştır.

Şekil 7:., Kaplanmış ve kaplanmamış kateter dilimleri üzerinde bakteri bağlama karşılaştırması SEM görüntüleri bakteriyel kokteyli BacMix-2 aşağıdakilerden oluşan ile inkübasyondan sonra PA13 (B) ile kaplanmış muamele edilmemiş kateter (Katater-1) (A) ve kateter karşılaştırmasını göstermektedir ölçek. barlar = 101 m. Referans ⁶ uyarlanmıştır.

Polimer	monomer 1	Monomer 2	Monomer 3	Monomerlerin oranı
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	HEMA	6	1	3
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	3
PA13		DMAA	-	9	1	-
PU1	PEG2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	PEG2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	BICH	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU227	PPG-PEG-1900	HDI	-	4.9	5.2	-
PU129	PPG425	BICH	DMAPD	2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	BICH	-	4.9	5.2	-
PU179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

Tablo 1: bakterilerin Kompozisyon bağlayıcı olmayan Şekil 2'de polimerler 'hit'.

Tartışma

Bir yüzeye bakteri ataşman bakteri türlerinin göre, bir çok faktöre aralığı tarafından belirlenir karmaşık bir süreçtir, yüzey, çevreleyen aracı ve fiziksel çevre özellikleri. Belirli bazı kimyasal gruplarca bakteriyel bağlama etkilediği bilinmektedir, ancak zor spesifik işlevler için polimerlerin rasyonel tasarım, yapım kimyasal yapılara sahip polimerlerin biyolojik etkisini ilişkilendirerek, (poliglikoller, mesela, tipik olarak ek ¹¹ karşı) zordur. Detaylı bağlanma mekanizmalarının yokluğunda, diğer çalışmalar uzun ve kapsamlı optimizasyon ²¹ süreçleri ile doğal olarak ortaya çıkan itici yüzeyler, taklit çalışmışlardır. Burada sunulan minyatür yüksek verimli yöntemi daha fazla çalışma için yol belirlemek için polimerlerin yüzlerce paralel tarama kolaylaştırarak bu zorlukların üstesinden gelir.

mikroarray yönteminin sonuçları esas ide hizmet. olasılıkla talebi adayları ntify Şekil 3, bağlama kapasitesi açık bir azalma gösterirken 2, en az bir türün, düşük bağlanma 22 aday göstermektedir Şekil. Şekil 2'de gösterilen tüm 22 düşük bağlayıcı polimerler (geçirmezlik ve kaplama özellikleri açısından) en iyi PU83, PA13 ve PA515 olarak saptanmıştır sırasında ölçek büyütme deneyleri, içine doğru çekilmiştir (Şekil 4 ve 5). Poliakrilatlar polimerizasyon yöntemleri açısından daha büyük bir esneklik sağlar ve bu düşük bağlayıcı poliakrilat, PA13, kateter kaplama çalışmaları için seçildi (Şekil 6 ve 7). Diğer adaylar üzerinde yapılacak daha detaylı çalışma yürütüldü ve başka bir yerde ⁶ bildirilmiştir.

Deneysel yineleme bir dizi sayesinde küçük adımlar bir dizi başarısı ve tekrarlanabilirlik anahtarı olduğunu gördük. Yanı sıra yapışmasını kolaylaştırmakAgaroz bakteri kolonizasyonu son derece dayanıklı olduğu gibi, temiz bir arka plan sağlar altında kaplama bir agaroz kullanılarak cam slaytlar polimerler. Aynı şekilde polimer içinde tutarlılık, aynı dizi içinde ve diziler arasında, hem kendilerini görür hayati ve bu nedenle dizilerin baskı dikkatle kontrol edilmesi gerekir. Baskı kafasına iğne ve 384 plaka da muntazam dolum dikkatli ayarlanması üniforma lekelenme sağlamak için gereklidir. Biz kullanılan polimerlerin bazı gibi bakteriler ile inkübasyon hayati önce her slayt için arka plan floresan verilerini alarak, otofloresansı bir ölçüde sergiledi. farklılıkları hesaba katmak için ve mikroarrayler sağlam veri çoğaltır tavsiye edilir elde etmek.

Burada kullanılan boya (DAPI) DNA'ya spesifik olmayan bağlanma bakteri türlerinin için bir seçiciliğe sahiptir. kirleticiler farkedilmeden gidebilir gibi bakteriyel kültürler tefsiratını kafa karıştırıcı, tanıtıldı Bu nedenle bir kez, iyi aseptik teknik esastırSonuçların lama. Aynı o çubuklar ve koklar ayırt ama cinsine veya tür değil sadece mümkün taramalı elektron mikroskobu kullanarak daha sonraki deneyler için de geçerlidir.

mikrotertip tarama sonra gelecek vaat eden polimerler, bundan başka doğrulama için seçilmelidir. Burada verilen örnekte, ilgi yedi polimerleri mikrodizisi üzerinde floresan kendi açık bir azalma ile tespit edilmiş ve bağlanma inhibisyon daha büyük yüzeyler üzerinde kaplanması ile teyit edilmiştir. Şekil 4 ve 5 ve cam lameller, bir ilgili elde edilen bağlanma azalma gösterir pratik araçlar toplu kaplamalar gibi ziyade mikroarray noktalar olarak polimerlerin davranışını test etmek. Daha sonra, bu polimerler, tam bakteri ek azalma ölçmek için tıbbi cihazlarda kaplanmıştır. Solvent (burada, kateter), bu kaplama çalışmaları için istenen alt tabakaya benign (protokol bakınız bölüm 8) muhafaza ederken seçilen önemlidirkaplama sağlamak için, ilgi konusu olan polimer çözümleme yetisine ing. Burada, bu özelliklere hem de düşük bir kaynama noktasına sahiptir ve tek bir kaplama bırakacak şekilde hızlı bir şekilde buharlaşır aseton kullanılır.

Belirli bir uygulama bağlı olacaktır seçilen doğrulama araçları çalışılmaktadır. Elektron ve floresan mikroskobu ile hücrelerin gözlem bireysel hücre eki direkt ölçümü sağlar, biz toplu boyama mikroarray tahlil bir tamamlayıcısı olarak bu teknikleri seçti. Sonuçlar ücretsiz doğrulama yöntemleri önemini göstermek, Şekil 6 ve 7'de gösterilmiştir. SEM burada pürüzsüz ve düzgün bir polimerin yüzeyinde bir değerlendirmesini sağlayan yararı vardır iken Şekil 6'da konfokal görüntüleri, bireysel hücrelerin çok net görüntü sağlar. Bu yöntemler, kullanılan Mikroskop görüş alanı ile sınırlıdır ve bu nedenle Importa arent sonuçlarına güven için anlık bir dizi çekmek için. Yukarıda tarif edilen yöntem, sadece küçük bölgelerde bir dizi kapsama sonucuna, tüm yüzey üzerinde bakteri yapışmasını nicelendirmek olamaz. Bu tarif edilen uygulama için yeterli olduğuna inanıyoruz. Bakteriyel bağlanma azalma başka bir yerde ²² açıklandığı gibi yöntemler kullanılarak, tüm kaplanmış ve kaplanmamış kateter parçaları yüzey yapıştırılır bakteri sayımı ile değerlendirilebilir. Ancak bu yöntemler, deneyler, genellikle karmaşık geometriye sahip tıbbi cihazlar ile gerçekleştirildiğinde korumak zor düzgün bir yüzey alanına sahip olması filtrelenmiş biyomalzeme yüzeyleri gerektirir.

Açıkçası, klinik kullanım için tasarlanmış herhangi bir cihaz, insanlarda güvenliğini ve etkinliğini sağlamak için önemli daha fazla test geçmesi gerekiyor. Burada sunulan yöntem, in vivo aktivite onayı içermelidir bu süreç ve daha fazla çalışma başlangıcını temsil eder. Bu durumda, venöz okuyanatheters, ilk iş kan bileşenleri ve polimer bütün hücrelerin bağlanmasını araştırmak olabilir. Bakteriyel bağlama kan bileşenlerinin etkisi muhtemelen etkinleştirilmiş serum veya de-fibrinated kan ²³ varlığında bağlanma tahlilleri tekrarlayarak, dikkate alınmalıdır. Teknoloji kesin testi gibi deri altından implant enfeksiyon modeli ²⁴ gibi bir in vivo modelde olur.

Biz yüzey değiştiren polimerlerin elenmesi için polimer mikroarray yönteminin potansiyelini göstermektedir. Bu gibi polimerler, (her ikisi de mukavemet ve bağlayıcı bakteri üremesini teşvik), bu yöntem, yani araştırma birçok alanda yararlı olabilir, ilaç, gıda sanayi ve biyoteknoloji uygulamalarında çok sayıda vardır. burada çalışma bakterileri kullanmasına rağmen, yöntem, diğer hücre tipleri ve aynı şekilde diğer kimyasal mikrodizileri adapte edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agaroz	Sigma	05066
Silan hazırlama slaytları	Sigma	S4651
Şirket	içinde sentezlenen	Uygulanamaz
NMP	Sigma	494496
LB Et suyu	Oksoit	CM1018
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Tetrahidrofuran	Sigma	401757
(3- aminopropil) trietoksisilan kaplı cam slaytlar	Sigma	Silan hazırlama
Kakodilat tamponu	Sigma	97068
Kateter 1	Arrow International	CS12123E
Kateter 2	Baxter Healthcare	ECS1320
Osmiyum tetroksit	Sigma	201030
Equipment
Kontakt yazıcı	Genetix	Qarraymini
Mikrodizi mikroskop	IMSTAR	Pathfinder
Spin Kaplayıcı	Speedline Technologies	6708D
Konfokal mikroskop	Leica	SP5
Görüntü analiz yazılımı	Medya Sibernetik	Image-Pro Plus
Taramalı elektron mikroskobu	Philips	XL30CP
Püskürtme kaplayıcı	Bal-Tec	SCD050