Method Article

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

DOI:

10.3791/54389

⸱

July 27th, 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tandem Afinite Saflaştırma (TAP) yöntemi, proteomik için başta ökaryotik olmak üzere hücresel ekstrakttan doğal kompleksleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, yapısal çalışmalar için doğal komplekslerin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Affinity arıtma yaklaşımları proteomik karakterizasyonu için yerli kompleksleri izole başarılı olmuştur. Yapısal heterojenite ve bir kompleksin kompozisyon heterojen bir derecesi genellikle bu tür çalışmalar yürüten ilerleme engel olmaz. Bunun aksine, yapısal karakterizasyon için amaçlanan bir kompleksi hem de içerik olarak ve yapısal olarak homojen olarak proteomik için gerekli olandan daha yüksek bir konsantrasyonda bir halde arındırılmalıdır. Son zamanlarda, büyük makromoleküler kompleksler yapı tayini için elektron mikroskobu uygulamasında önemli ilerlemeler olmuştur. Bu elektron mikroskobu ile yapısal tespiti için yeterli nicelik ve nitelikte yerli kompleksleri arındırmak için yaklaşımlar ilgi artırmıştır. Tandem Affinity Arıtma (TAP) yöntemi 18-altbirim ayıklamak ve arındırmak için optimize edilmiştir, ~ tomurcuklanan maya 0.8 MDa ribonükleoprotein montaj (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok önemli hücresel süreçler büyük protein ve protein-RNA kompleksleri 1 tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu tür komplekslerin biyo-fiziksel ve yapısal çalışmaları yapmak için önemli bir engel, uygun bir kalite (yani, homojen) ve uygun bir konsantrasyonda onları elde edilir. doğal bir kaynağından, bir kompleks izole alt birimlerin ilgili transkripsiyon sonrası ve / veya translasyonel modifikasyonlar tutma ve uygun karmaşık bir düzenlemesini sigortalanması dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Ancak, büyük hücre kompleksleri düşük kopya sayısında sık sık, bir hücrede mevcut olan ve arıtma için yüksek verimli olması ve karmaşık bütünlüğü ko....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: Aşağıdaki protokol hücre kültürünün 4 L, hücrelerin yaklaşık 40 g ıslak ağırlık bir kompleks saflaştırılması için geliştirilmiştir. Hazırlandıktan sonra, bütün tamponlar, 4 ° C'de saklanır ve bunların hazırlanması ve bir ay içinde kullanılmalıdır. İndirgeme maddesi ve proteaz inhibitörleri, sadece kullanımdan hemen önce tampon eklenir.

Tandem afinite temizliği için tam hücre özütünün hazırlanması 1.

  1. S. Büyüme cerevisiae hücreleri
    1. Streak istenen TAP S. etiketli cerevisiae cinsi depolama (-80 ° C) bir maya pepton dekstroz üzerine (YPD) plaka. maya hücreleri ve beyaz kabarık görüne....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değiştirilmiş bir TAP yöntemi S'den saflaştırmak için kullanıldı U1 snRNP, 18 alt birim ribonükleoprotein kompleksi cerevisiae'de. Yayınlanmış bir protokol 2,3 takiben kompleksin bir başlangıç ​​TAP saflaştırma gümüş üç grup ana poliakrilamid jel (Şekil 2A) boyanmış şekilde göç heterojen çıktı bir kompleks elde edilmiştir. TAP yönteminin optimizasyonu birden fazla tur, daha homojen bir montaj (Şekil 2A) gösteren bir yerli jel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAP yöntemi sıkı ve seçici fizyolojik çözelti Koşullar korumak için bir arzu bir afinite reçineye bağlanmak için bir dengelemeye iki etiket kullanılmaktadır. Bu denge sonrası arıtma karakterizasyonu için faktör (ler) etkileşime ile etiketli protein istikrarlı etkileşimi (ler) korumak için hizmet vermektedir. Buna ek olarak, bireysel TAP biri herhangi bir maya kompleksi için etiketli protein ile herhangi bir maya suşu elde edebilirsiniz, böylece Orfs, ticari bir kaynaktan temin edilebilen etiketledi. Bir kompleks bütünlü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Nikolaus Grigorieff'in desteği ve tavsiyesi için minnettardır. Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu ve Mike Rigney'e yararlı tartışmalar ve EM rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı, Ödül No. 1157892 tarafından finanse edildi. Brandeis EM tesisi, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P01 GM62580 tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
S. cerevisiae TAP etiketli suşuOpen BiosystemsYSC1177Bu, TAP protokolünü geliştirmek için kullanılan birincil maya türüdür. Arka planı S288C: ATCC 201388: MATa, his3 & Delta; 1, leu2 ve Delta; 0, met15 ve Delta; 0, ura3 ve Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Kahve değirmeniMr. CoffeeIDS77Hücre lizisi için kullanılır
Hemositometre, Bright LineHausser Scientific3120Hücre lizisini değerlendirmek için kullanılır
JA 9.100 santrifüj rotoru Beckman Coulter, Inc.Maya hücrelerini hasat etmek için kullanılır
JA 20 sabit açılı santrifüj rotoruBeckman Coulter, Inc.'in hücre ekstraktını temizlemek için kullanılır
.Çözünür hücre ekstraktını daha da temizlemek için kullanılır
ThermomixerEppendorfR5355Sıcaklık kontrollü çalkalayıcı
Novex jel sistemiThermo Fisher Scientific 
IgG reçinesiGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6 hızlı akışlı
Calmodulin reçinesiAgilent Technologies, Inc.214303Afinite reçinesi
Proteaz inhibitörü kokteyli, mini tabletlerSigma Aldrich589297Mini cOmplete ultra EDTA içermeyen tabletler
Proteaz inhibitörü kokteyli, büyük tabletlerSigma Aldrich5892953cOmplete ultra EDTA içermeyen tabletler
Fenilmetansülfonil florür (PMSF)İzopropanol 2 ml içinde çözünmüş
Bio-spin sütunuBio-Rad Laboratuvarlar A.Ş.7326008Calmodulin reçinesi
10 ml çoklu hazırlık kolonunuBio-Rad Laboratories, Inc.7311550IgG reçinesini paketlemek ve yıkamak için kullanılır
Prekast yerli PAGE Bis-Tris jelleriYaşam TeknolojileriBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - %16 prekast poliakrilamid jeller
NativeMark protein standardıThermo Fisher ScientificLC0725Doğal PAGE için kullanılan boyanmamış protein standardı. Yük 7.5 μ gümüş lekeli bir jel için l ve 5 & mu; l SYPRO Yakut lekeli jel için
Prekast SDS PAGE Bis-Tris jellerYaşam TeknolojileriNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - %12 prekast poliakrilamid jeller 
PageRuler protein standardıThermo Fisher Scientific26614Western blotting için kullanılan boyanmamış protein standardı
SDS koşu tamponuYaşam TeknolojileriNP00011x NuPAGE MOPS SDS Tampon
TAP antikoruThermo Fisher ScientificCAB1001CBP etiketine karşı birincil antikor
İkincil antikorThermo Fisher Scientific31341Keçi anti-tavşan alkalin fosfataz konjuge
BCIP / NBTThermo Fisher Scientific340425-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat / nitro mavi tetrazolyum ve nbsp;
Dialaysis üniteleriThermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer mini diyaliz üniteleri
Santrifüj filtre üniteleri, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Ultracel-100 membranlı Amicon Ultra-0.5 Santrifüj Filtre Ünitesi
Deterjan emici boncuklarBio-Rad Laboratories, Inc.1523920Biyo-boncuk SM-2 emiciler
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564Nükleik asit boyama için floresan boya, SYPRO Ruby ile tespit edildiğinde, 488 nm'lik uyarma dalga boyu ve 532 nm'lik emisyon dalga boyunu kullanın
SYPROYakut Moleküler ProblarS-12000Protein boyama için floresan boya, SYBR Green II mevcut olduğunda tespit ederken, 457 nm'lik uyarma dalga boyu ve 670 nm'lik emisyon dalga boyunu kullanın
Bakır ızgaralarElektron Mikroskobu BilimleriG400-CP
Çözünmeyen hücresel materyal Ti 60 sabit açılı santrifüj rotoru Beckman Coulter, Inc. paketlemek ve yıkamak için kullanılır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tandem Affinity PurificationNative Complex PurificationStructural Homogeneity AssessmentYeast Cell LysisIgG Sepharose BindingTEV Protease CleavageCalmodulin Affinity BindingNegative Stain EMSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

Related Articles