Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Özet

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Özet

bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) -restriction parça uzunluk polimorfizm (RFLP), sıvı kromatografisi / elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi (LC / ESI-MS) ile, toksik pufferfish türleri genotipleme için yöntemin geliştirilmiş bir versiyonu açıklanmıştır. DNA izolasyonu bir silis membran bazlı DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Bir deterjan içermeyen PCR tamponu kullanılarak PCR amplifikasyonu sonra restriksiyon enzimleri Reaksiyon çözeltisi arıtılması olmaksızın çözeltiye ilave edilir. Ters-faz silis yekpare kolonu ve bir Fourier değiştirilmiş Kingdon'un tutarak analiz sahip olan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi, sırasıyla, ayırma ve saptama için kullanılır dönüşümü. 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol 'den ibaret hareketli faz, 15 mM trietilamin (pH 7.9) ve metanol, 0.4 ml / dk'lık bir akış oranında verilmektedir. LC / ESI-MS analizi için devir süresi sütun dengeleme dahil 8 dakikadır. Bir izotop dağıtım modeli o sahip Dekonvolüsyonun yazılımoligonükleotidin f kütle spektrumu karşılık gelen monoizotopik kütle hesaplamak için kullanılır. Oligonükleotidler (aralık 26-79 nükleotid) analizi için, kitle doğruluk oldu 0.62 ± 0.74 ppm (n = 280) ve mükemmel doğruluk ve hassasiyet bir kilit kütle standardı kullanılmadan 180 saat boyunca devam etti.

Giriş

Kütle spektrometrisi (MS) iyonizasyon ^1,2 için kullanılan nükleik asit, matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma (MALDI) ile elektrosprey iyonizasyon (ESI) arasında hızlı ve güvenli bir tanımlama için kabul edilen bir teknolojidir. MALDI tekniği genellikle bir süre-of-flight (TOF) analiz ile birleştirilir; Ancak, MALDI-TOF MS uygulaması kısa oligonükleotidler ile sınırlıdır (~ 25 nükleotid (nt)) sonraki parçalanma, adükt oluşumu ve düşük iyonlaşma verimliliği ^1,2 sayesinde. Bunun aksine, ESI uzun oligonükleotidler (> 100 nt) için geçerlidir, ancak birden çok yük durumları ([M-NH] ^n-) biomacromolecules aynı anda üretilir ve bu nedenle de bir analit kütlesi üst aşabilir yüklü iyonlar spektrometre m / z aralığı sınırı. Bu karşılık gelen kütle içine kıvrık spektrumları yorumlanması, yani bir şarj durumu serisinin dönüşümünü gerektirirDekonvolüsyonun yoluyla.

Küçük molekül kütlesi ölçümü, monoizotopik kütle zirve, yani söz konusu olduğunda, her bir elemanın, sadece en yaygın izotop ihtiva eden bir molekül kütlesi en bol ve ³ doğal görülmektedir. Molekül ağırlığı arttıkça, daha yüksek, m / z ve monoizotopik tepe izotopik dağıtım değişimleri taban gürültü ^3-5 kararmaktadır. Monoizotopik pik artık kDa ^3, 10 daha büyük kitleler için tespit sonra, ortalama moleküler ağırlıklı monoizotopik kütle ⁵ yerine ölçülmesi için kullanılır. Bu gibi durumlarda, tek tek zirvelerin her biri 1 Da tarafından ayrıldığı izotopik dağılımı sadece gözlemlenebilir zaman TOF, Fourier Kingdon'un tutarak analiz ⁶ değiştirilmiş dönüşüm ya da bir Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans gibi yüksek çözünürlüklü kütle analizörü analiz analizi için kullanılır. Ancak, en bol zirve sometimes ortalama moleküler kütlesi ⁵ ile tutarlı değildir. Bu sorunlar doğru analitin belirlenmesi için zorluk yol açabilir.

Kararlı izotopların doğal bolluk içinde değişim ve ortalama molekül kütlesi belirlenmesinde zorluklar göz önüne alındığında, Monoizotopik kitle ölçüm biyomoleküllerin ^3,4 kitle karakterizasyonu için idealdir. Pratikte, monoizotopik pik uygulanıp olup olmadığını, monoizotopik kütle model analit ^4,7-10 hesaplanan teorik bir gözlenen izotopik dağılım modelini karşılaştırarak tahmin edilebilir. Uydurma algoritması ⁸ şimdi sahipli yazılım içine dahil edilmiştir.

ESI-MS bağlamında, bir DNA çift yönlü, saflaştırma ve tuzsuzlaştırma ayrışma nedeniyle iyon bastırılması ve adükt oluşumu ^2,10-14 için iyonizasyon başarısızlığını önlemek için doğrudan ölçümü için gereklidir. Bu prosedürler troubl olanesome Ancak tam otomatik analitik sistemler patojenlerin ^15-20 tespiti için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), numune hazırlama ve ESI-MS ile ilgili ticari olarak geliştirilmiştir. Başka bir yaklaşım ayrılması için sıvı kromatografisi (LC) sunuyor. LC eşlik eden maddelerden analitlerin bir on-line olarak ayrılmasına sunar ve ^21,22 İyonizasyon öncesinde laboratuarda örnek hazırlama gerektirmez. Bununla birlikte, MS-uyumlu bir mobil faz kullanılarak nükleik asit ayrılması bu tür nükleotidlerin polianyonik doğası nedeniyle ilaç, peptidler ve proteinler gibi pek çok başka bileşikler için daha zordur. LC / ESI-MS en başarılı örnekler, ters fazlı LC iyon çifti kullanılmasını içerir. 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol, hareketli aşamada (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol ilk Apffel ve arkadaşları tarafından önerilmiştir. Ayırma ve kısa oligonükleotitler ²³ tespit edilmesi için. differentiatio LC / ESI-MS genotipleme Uygulamapatojen türleri, tek nükleotid polimorfizm ve kısa tandem tekrarı n uzun oligonükleotitler ^1,21,24-33 ayırabilen bir kılcal polimer yekpare kolonu kullanılarak rapor edilmiştir.

Japonya ve Amerika Birleşik Devletleri'nde, ciddi gıda zehirlenmesi hatalı tanımlama ve puffer uygunsuz hazırlanması nedeniyle oluştu ve bu puffer dağıtım ve hazırlık kesinlikle gıda güvenliği mevzuatı ^34,35 tarafından kontrol edilir gerçeğine rağmen. Ayrıca, pufferfish ekstresi kullanarak kasıtlı cinayet Japonya'da ³⁶ meydana geldi. Bu nedenle, pufferfish türlerin farklılaşması kamu sağlığı ve adli soruşturma açıdan hem de gereklidir. Takifugu rubripes puffer diğer türlü çok daha pahalı olduğu için, ayrıca, bir farklılaşma kabiliyeti de gıda dolandırıcılık araştırmaların kapsamında gereklidir.

Burada, m belirlemek için detaylı bir yöntemters-fazlı silika yekpare kolon ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılarak LC / ESI-MS ile bir PCR ürününün onoisotopic kütlesi tarif edilmektedir. Özellikle, bu yaklaşım MS kullanılarak hayvan türlerinin farklılaşması için ilk örnektir PCR restriksiyon parça uzunluk polimorfizm (RFLP) ile ³⁷ kullanımına dayanmaktadır toksik pufferfish türlerinin farklılaşmasını izin vermek için geliştirilmiştir.

Protokol

1. DNA ekstraksiyonu

Not: jel elektroforez ve LC / ESI-MS gibi DNA ekstraksiyonu ve PCR sonrası sınavları için ayrı bir oda kullanın. tampon 1 (ihtiva guanidin hidroklorid) ve DNA ekstraksiyon kiti protokolüne göre, yıkama tamponu 2 (guanidin hidroklorid içeren olan) yıkama etanol ekleyin. Balık örnekleri Japonya'da balık toptancılar ve perakende pazarlar elde edilmiştir.

1. 0.5 ml ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde balık doku 30-50 mg yerleştirin. (Fin ve cilt için hariç), bir mikro-spatula kullanılarak doku Squash.
   Not: fin durumunda, ıslatılması için 0.5 ml'lik bir tüp kullanın.
2. liziz tamponu 180 ul ve kısaca proteinaz K ve vorteks 40 ul ekle. 2 saat veya gece boyunca bir blok ısıtıcı üzerinde 56 ° C'de inkübe edin. kısaca inkübasyon sırasında her 15 dakikada bir vorteks ile karıştırın.
   Not: Tam lizis gerekli değildir.
3. 13.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Santrifüj işleminden sonra, eğer küçük amoyağ unt karaciğer gibi bir yağlı örnek durumunda yüzey üzerinde var, atın. yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
4. guanidin hidroklorür içeren kaotropik tampon 200 ul ekleyin ve vorteks karıştırın. Yine vorteks etanol (% 99.5) ve karışımı 200 ul ekle.
5. 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde yerleştirilmiş spin kolon içine karışımı aktarın. 13.000 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj. flow-through atın.
   Dikkat: Guanidin çamaşır suyu ile son derece reaktif bileşikler oluşturabilir çünkü atık çamaşır suyu katmayın.
6. 13.000 x g'de 1 dakika için yıkama tamponu 1 (ihtiva guanidin hidroklorür) ve santrifüj 500 ul ekle. akışını ve toplama tüpü atın.
7. kiti ile sağlanan yeni 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin. 20.000 x g'de 3 dakika boyunca yıkama tamponu 2 ile santrifüj 500 ul ekle. Flow-through ve toplama tüpü atın. Yeni spin kolon aktarın1.5 ml mikrosantrifüj tüp.
8. Pipet spin kolon membranın merkezi elüsyon tamponu 200 ul. 1 dakika sonra, 6000 x g, 1 dakika süre ile santrifüjlenir.
9. Pipet 50 tek kullanımlık bir UV küvete eluat ul 220-300 nm'de, sıyırma sıvısının UV spektrumu ve bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de absorbans ölçümü.
10. 260 nm'de zirve ile DNA'nın UV spektrumu edin. basit bir denklem kullanılarak yaklaşık DNA konsantrasyonu hesaplamak "DNA konsantrasyonu (ng / ml) 260 nm x 50 absorbans =".
    Not: puffer kanatlarına elde Tipik DNA konsantrasyonu 63 ± 30 ng / | il (n = 20) 'dir.
11. DNA konsantrasyonu daha yüksek 10 ng / | il ise, / ml, 5 ng Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (pH 8) ile birlikte DNA örnekleri seyreltin.
12. -20 ° C'de örnek Mağaza ya da PCR büyütmesi (bölüm 2) geçin.

2. PCR

1. Her extr için 25 ul PCR kurmakDNA örneği, pozitif kontrol kirlenmesini önlemek için temiz bir bankta Tablo 1 ve 2'ye uygun olan buz üzerinde ve negatif kontrol (DNA yerine örnek ultrapurified su) (TE tamponu pH 8.0 içinde, hedef dizisine sahip olan oligonükleotid sentezlenmiş 0.2 um) vermiştir.
   Not: Kolay kullanım için, şablon DNA olmadan tüm reaktifleri içeren kokteyl yeterli miktarda yapmak ve dağıtmak. PCR ürününün 3 'A çıkıntılar eklenmesini önlemek için DNA polimeraz olan redaksiyon aktivitesini kullanın.
2. Tablo 3'te gösterilen döngü programı kullanılarak, bir termal döngü PCR yürütmek.

3. Enzimatik Sindirim

1. PCR çözeltisi 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM _MgCl2, 10 mM ditiotreitol ve 500 mM NaCl içeren çözeltinin 2 ul ekle.
2. her biri, sınır enzimi 1 ul (DRA I ve Msp I) ekleyin ve yavaşça karıştırın. th 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edinErmal cycler.
3. Msp I tarafından üretilen yapışkan ucunu doldurur diğer DNA polimeraz, aktive etmek için 72 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe
4. İsteğe bağlı: 15 3.33 (ağırlıkça%) bir çapraz bağ oranı (% C, bisakrilamid yüzdesi) ve poliakrilamid jel konsantrasyonu (% T) ile poliakrilamid jel elektroforez ile reaksiyon çözeltisinin, her 2.5 ul analiz (% ağırlık / hacim) ^38. floresan DNA leke kullanılarak jel Leke ve kehribar ekranını kullanarak bir mavi ışık transilluminator'de çift iplikli DNA gözlemleyin.
5. Analitik sütun hasara sebep olabilir, tıkanmayı önlemek için 0.2-0.5 um santrifüj filtre cihazı ile, reaksiyon çözeltisi filtre.
6. analize kadar -20 ° C'de, bir şevli polipropilen şişe ve saklamak için filtrat aktarın.

4. LC / ESI-MS analizi

1. HFIP 67.2 g (yaklaşık 42 mL) ve bir 1 L şişe içinde TEA, 1.52 gr (yaklaşık 2.0 mi) tartılır. ultrapurified su (LC / MS gra 955 ml ilave edilirReaktifler tamamen eriyene kadar de) ilave edin ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak. çözeltisinin bir bölümü almak ve pH kontrol (7.85 ve 7.95 arasında, ideal pH = 7.9) bir pH metre kullanılarak.
   Not: metal iyonları ile kirlenmesini önlemek için şişeye kısım iade etmeyin. pH değildir 7.9 ise, pH'ı ayarlamak ve yeniden pH ölçmek için HFIP veya çay küçük bir miktar ilave edin.
2. buharlaşmasını önlemek için (ev kullanımı için) doğrudan soğutma taşınabilir buzdolabı kullanarak şişe soğutma sıvı kromatograf A hattına şişe bağlayın. B hattına metanol ile dolu bir şişe bağlayın
3. koruma sütunu ve sıvı kromatografı analitik kolon (2.0 x 50 mm, mezogözeneklere size = 30 nm) bağlayın. Sütunları dengelemek için ilk mobil faz (% 95 A ve% 5 B) akmaya başlar.
4. Kalibran ³⁹ olarak 0.5 mg / ml sodyum trifloroasetat (pH 3.5) hazırlayın.
   1. Trifluoroasetik ac 50 mg (yaklaşık 34 ul) tartılırBir beher id.
   2. ultrapurified 30 mL su ilave edin ve bir pH ölçer yardımıyla, 10 mM sodyum hidroksit ile pH 3.5'e titre edilir.
   3. ultrapurified su ile 50 ml'ye kadar doldurun. 50 ml asetonitril (LC / MS grade) ilave et ve karıştır.
   4. çalışma çözeltisinin bir kısmını almak ve oda sıcaklığında saklayın. 4 ° C'da, çözelti geri kalanını saklayın.
5. aşağıdaki gibi C-tuzak azot basıncını azaltın.
   Not: Son Fourier, bozulmamış protein analizi için uygun olan kütle spektrometre, dönüşümü basıncını kontrol etmek için kontrol yazılımı.
   1. kütle spektrometresi sol üst kapağını çıkarın. C-tuzak valf sol ön planda köşesinde yer almaktadır.
   2. kontrol yazılımı alet durum penceresinde yüksek vakum basınç değerini kontrol edin.
      Not: değer tipik olarak, 3 x 10 ^-8 bar.
   3. Kilidi açmak ve yüksek vakum basın azaltmak amacıyla çok yavaş Düğmeyi saat yönünün tersine çevirmek için düğmeyi çekin1/3 (tipik olarak 1 x 10 ^-8 bar) ure. belirtilen basınç gecikmeli bir şekilde yavaş yavaş değişmelidir. Alçak basınç hakkında uyarı mesajını görmezden. kilitlemek için düğmeyi itin.
   4. güvenliği için üst kapağı geri yükleyin.
6. Sodyum trifloroasetat ³⁹ kullanılarak kütle spektrometresi ayarlayın.
   Not: Günlük kitle kalibrasyon bu protokol ile değiştirilebilir, ancak üretici tarafından önerilen önerilen kalibrasyon Bu kalibrasyon öncesinde tamamlanmış olması gerekir.
   1. aşağıdaki gibi tarama parametreleri ve ayar yazılımı enstrüman kontrol kutusu ısıtmalı ESI kaynak parametrelerini ayarlayın: Tarama tipi tam MS; tarama aralığı m / z 500-4,000; parçalanma (in-kaynak çarpışma kaynaklı ayrılma (CID) gerilim 60 eV, polarite negatif, kılıf gaz akış hızı 5;; aux gaz akış hızı 0; süpürme gazı otomatik kazanç kontrolü (AGC) 1 x 10 ^6, maksimum enjekte süresi 50 msn hedef hızı 0 akış, gerilimi sprey 3 kV kılcal sıcaklık 320 ° C; S lens radyofrekans (RF) seviyesi 100; Isıtıcı sıcaklığı 30 ° C.
      1. Negatif iyon girişi listesi m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045 olarak izlenecek.
   2. kütle spektrometresi (pozisyon B) arayüzüne yakın ısıtılmış ESI probu hareket ettirin. prob ve bir boru ile bir şırınga bağlayın.
   3. Gömülü şırınga pompası kullanılarak 10 ul / dk'lık bir akış hızında, sürekli kalibrant infüze. Özelleştirilmiş kalibrasyon tablosunda sadece 6 alt kitle iyonları (m / z 792,85908-2152,60717) kontrol edin.
      1. sinyallerin yoğunluğu stabilize edildikten sonra kalibrasyon ile devam edin. Kalibrasyon sonra, sadece altı yüksek kütle iyonları (m / z 1.880,65755-3376,38045) kontrol ve kalibrasyon ile devam edin. başarısızlığı önlemek için bir kerede tüm iyonları kullanılarak kalibre kaçının.
7. ÖDENEK probu taşı0.4 ml / dk (pozisyon D) bir akış hızı için te konumu nötr bir metal boru ile sıvı kromatografı bağlanabilir.
8. aşağıdaki gibi ayar yazılımı enstrüman kontrol kutusu ısıtmalı ESI kaynak parametrelerini ayarlayın: kılıf gaz akış hızı 50; aux gaz akış hızı 15; gaz akış hızı 1 süpürme; gerilimi 2.5 kV sprey; kılcal sıcaklığı 350 ° C; S-lens RF seviyesi 100; Isıtıcı sıcaklığı 350 ° C'dir.
9. enstrümantal ayar penceresinde kütle spektrometresi ayarlayın edinimi parametreleri aşağıdaki gibi: yöntem süresi 8 dakika; vana, kütle spektrometresi 3,5-6 dakika, 0-3,5 ve atık 6-8 dk aktarma; 6 dk çalışma zamanı 3.5; negatif polarite; Kaynak CID geriliminin 15.0 eV olarak; microscans 3; Nominal çözünürlük gücü (m / z 200) 140000; AGC hedef 1 x 10 ^6; Maksimum iyon süresi 50 msn; taramaları 1 sayısı; tarama aralığı m / z 700-3,500; spektrum veri türü profili.
10. sıvı kromatografı Set parametreleri aşağıdaki gibi: kolon fırını sıcaklığı 20 ° C; sample tepsi sıcaklığı 10 ° C; gradyan programı 0-0.5 dakika% 5 B, 0.5-1 dakika% 5-30 B, 1-3,5 dakika% 30-40 B, 3.5-5 dakika 40-98% B, 5-6 dk% 98 B, 6- 6.05 dakika 98-5% B, 6,05-8 dakika% 5 B; oranı 0.4 ml / dk akış.
11. Boşaltma şişeleri dipleri dokunarak kabarcıklar. Numune raf örnek şişeleri ayarlayın ve analiz başlatmak için otomatik numune alıcı kullanarak bir örnek 1.0 ul enjekte edilir.
12. tarayıcı yazılımı ile ham veri dosyaları açmak ve tüm satın almalar başarıyla pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere, bitmiş olduğunu onaylayın.
    Not: Genellikle, iki ya da üç adet tepe noktası 4-5,5 dakikalık bir alıkonma zamanında, toplam iyon akımı kromatogramda görülmektedir olur pufferfish DNA, başarılı bir şekilde yükseltilir ve hazmedildiginde.

5. Dekonvolüsyon ve Yorumlama

1. Dekonvolüsyonun yazılımını başlatın. "(Izotopik çözüldü) oto özü" Select deneme türü.
2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir yöntem düzenleyin: çıktı kütle M; S / N threshold3, göreceli bolluk eşiği 0; negatif yük evet; Geçerli kromatogram (XIC) iyon çıkarılan hesaplamak evet; m / z aralığı 700-3,500; Taşıyıcı H ⁺ şarj; tespit edilen ücret 3 minimum sayıda; izotop oranı nükleotid; uygun faktör% 80; kalan eşiği% 0; evet çakışmalar düşünün; aralığı 3-50 ücret; Minimum yoğunluğu 1 'dir; beklenen yoğunluk hatası 3.
   1. yeni bir yöntem olarak kaydet ve onu seçin.
3. Ham veri dosyaları mevcut dizini seçin. analiz edilecek ham veri dosyaları seçin ve düğmesine tıklayın 'Sıraya Ekle'.
4. dekonvulasyon başlatmak için 'Run Queue' sekmesinde 'Çalıştır' düğmesine tıklayın.
5. Sıra tamamlandıktan sonra, bir satır seçin ve Dekonvolüsyonun sonuçlarını elde etmek için üst başlık olarak 'Aç Sonuç tıklayın.
6. Tablo 4 kullanılarak 4-5,5 dakikalık bir retansiyon zamanında zirvelerinden elde edilen Monoizotopik kitlelerden sonuçları yorumlama.

Sonuçlar

Üç ticari olarak temin edilebilen sütun 100-400 ul / dakika akış hızlarında, uzun oligonükleotitlerin ayrılması için değerlendirildi. Geniş gözenekli oktadesil karbon zinciri _(C18) n-bağlı parçacık silika kolon (a) ticari olarak temin edilebilen poli (stiren-divinilbenzen) (PS-DVB) yekpare kolonu (b) ve bir _C18-bağlı silika monolit kolonu ( c)) (Şekil 1 karşılaştırıldı. DNA duplekslerine (26, 37 ve 53 bp) üç çift tüm sütunları kullanılarak ayrıldı ve _C18-bağlı silika monolit sütunu daha sonraki çalışmalarda kullanılmıştır.

T. kas özü Bir DNA analizi için Örnek sonuç rubripes Şekil 2 'de gösterilmiştir. izotopik çözüldü zirveleri, Şekil 2a'da gösterildiği gibi, başarılı bir şekilde monoizotopik kütle hesaplamak için gereklidir. Teorik ve ölçümT. edili- monoizotopik kütle rubripes Şekil 2B'de gösterilmiştir. endonükleazlar ile sindirim saflaştırılmadan hemen PCR amplifikasyonundan sonra yapıldığından, Msp I endonükleaz tarafından oluşturulan 3'-yapışkan ucu Kalan DNA polimerazı ile doldurulur. Sentetik DNA şablonları türetilen amplikonların analizine göre, kütle hassasiyeti -2.48 den 2.40 ppm (ortalama 0.62 ± 0.74 ppm, n = 280) arasında değişmektedir. Bu nedenle, 3 ppm'lik bir kütle tolerans türleri (Tablo 4) ayırt etmek için kullanıldı. Tabloyu kullanarak, marketler ve mağazalar alınan pufferfish örneklerinin tamamı düzgün spesifik türlerin ³⁷ olarak ayırt edildi.

T. sentetik DNA şablonundan elde edilen numunenin periyodik analizine göre Chrysops, analitlerin tüm Monoizotopik kütleleri başarıyla de le için ± 3 ppm içinde belirlenmiştirherhangi bir kitle kalibrasyon olmadan ast 180 saat (Şekil 3). Bu kütle kalibrasyonu haftalık olarak gerekli olduğu anlamına gelir.

Şekil 1: T. sentezlenen DNA şablonundan elde edilen PCR-RFLP ürününün toplam iyon akımı kromatogramları PARDALIS bir _C18-bağlı parçacık halindeki silis kolonu (a, 3 x 250 mm, parçacık büyüklüğü 3 um), bir poli (stiren-divinilbenzen) kullanılarak (PS-DVB) yekpare kolonu (B, 1.0 x 250 mm) ve bir C ₁₈ n-bağlı monolit silika kolon (Cı, bu yöntem,) (a) için şartlar:. akış hızı, 0.2 ml / dakika; metanol oranı, 0-2 dakika% 5, 2-5 dakika% 5% 25, ​​5-20 dakika% 25 -40%, 20-35 dakika% 40 -98,% 35-50 dakika% 98, 50- 51 dk% 98% -5, 51-65 dakika% 5. Koşulları (b):oranı 0.1 ml / dk; metanol oranı, 0-2 dakika% 5, 2-5 dakika% 5% 25, ​​5-35 dakika% 25 -40%, 35-40 dakika% 40 -98,% 40-55 dakika% 98, 55- 56 dk% 98% -5, 56-70 dakika% 5. Her iki sütun için sıcaklığı 20 ° C idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: T. ham kas analiz etmek için Temsilcisi sonuçlar rubripes. (a) Tipik toplam iyon akımı kromatogramlar ve kütle spektrumu. (B) T. sentezlenen DNA örneğinin elde edilen PCR-RFLP ürünlerinin teorik ve ölçülen Monoizotopik kitleler rubripes. Büyük görmek için buraya tıklayınızBu rakamın r sürümü.

Şekil 3:. T. sentetik DNA elde edilen Stabilite testi Sindirilmiş amplikonlarının Chrysops her 10 saat analiz edilmiştir. Kütle kalibrasyon testi sırasında yapılmadı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

isim	Sıra
lago86F	5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3'
taki114F	5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3'
fugu86-114R	5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3'

Tablo 1: PCR primerleri.

PCR reajan	Cilt kullanılan	Nihai konsantrasyon
Ultrapurified su	15.75 ul
Deterjan içermeyen 5x Tampon	5,0 ul	1x
dNTP karışımı (10 mM)	0.5 ul	0.2 mM
Primer karışımı (TE tamponu pH 8.0 içinde 10 uM lago86F, taki114F ve fugu86-114R her)	1.0 ul	0.4 uM her
DNA polimeraz (2.5 birim / ul),	0,25 ul	0.1 ünite / ul
TE tamponu pH Şablon DNA, 8.0 (5,0-10 ng / ekstre örnek uL, pozitif kontrol olarak, sentetik DNA 0.2 uM)	2.5 ul	0.5-1.0 ng / ekstre DNA ul, sentetik DNA için 20 nM
	Toplam: 25 ul

Tablo 2: 25 ul ölçek PCR bileşenleri.

devir	Şart	işlev
1	95 ° C'de 2 dakika	ilk denatürasyon
2	95 ° C'de 30 saniyelik	denatürasyonu
3	56 ° C'de 30 saniyelik	tavlama
4	72 ° C'de 30 saniyelik	Uzama
5	2-4 (toplam 30 kez) tekrarlayın
6	72 ° C'de 7 dakika	nihai uzama
7	Numunenin çıkarılana kadar 12 ° C'de tutun

Tablo 3: PCR programı.

4,0-5,5 dakika tutma süresi zirve sayı	aralığında bir üçüncü zirvenin monoizotopik kütle (dA)		aralığında, ikinci tepe monoizotopik kütle (dA)		pufferfish türler
	küçük şerit	büyük iplik	küçük şerit	büyük iplik
2	→	→	15890,707-15890,803	16177,531-16177,629	L. inermis
			15921,702-15921,797	16146,537-16146,634	L. gloveri
			15930,713-15930,809	16137,525-16137,622	L. lunaris
			15937,697-15937,792	16131,537-16131,634	L. wheeleri
			24173,034-24173,179	24566,905-24567,053	T. Chrysops
3	16295,706-16295,804	16467,610-16467,709	11341,851-11341,919	11466,875-11466,944	T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus
			11654,908-11654,978	11770,920-11770,991	T. niphobles
	16296,701-16296,799	16468,605-16468,704	→	→	T. rubripes
	16311,701-16311,799	16452,610-16452,709	→	→	T. poecilonotus T. exascurus
	16320,713-16320,811	16443,599-16443,697	→	→	T. porphyreus T. obscurus
	16599,751-16599,851	16780,667-16780,767	→	→	T. vermicularis

Tablo 4: LC / ESI-MS türetilmiş Monoizotopik kitlelerden puffer Farklılaşma.

Tablo 5: Amplifiye DNA sekansı: (a) sırası ile aynıdır.Bu Tablo 4'te açıklandığı gibi diğer balon balıkları türlerinin. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

DNA elde etmek için, kan ve doku DNA elde etmek için bir ticari kit küçük değişiklikler (proteinaz K miktarına ve lizis çözeltisinin santrifüj) ile üreticinin protokolüne uygun olarak kullanılır. Bununla birlikte, herhangi bir ekstraksiyon kiti sürece hücresel DNA, PCR için uygun geri kazanım ve saflıkta elde edilebilir olarak kullanılabilir. Bu yöntem kas, fin, karaciğer, yumurtalık ve cilt ³⁷ kullanılarak test edilmiştir. Fin için, dondurulmuş, kurutulmuş kaynatıldı ve pişmiş pufferfish örnekleri başarılı ³⁷ test edildi proteinaz K Fresh ile hızlı bir lizis geniş bir yüzey alanına, özellikle uygundur.

PCR primer seti (Tablo 1) puffer için tasarlanmış ve puffer mitokondrial 16S ribozomal RNA geni güçlendirir edilir. Yükseltmek için hedef DNA 114-115 bp'lik (cinsi Takifugu) ve 86 bp'lik (cinsi Lagocephalus) (Tablo 5). yöntem, developme kolaylaştırmaknt hedef sekansları olan sentez oligonükleotitler yerine özgün pufferfish numuneleri toplamak ve referans olarak kullanılmıştır. primer seti amacı yanıt olarak başka bir primer dizisi ile ikame edilmiş olabilir, bununla birlikte, enzimatik sindirimden sonra nihai DNA uzunluğu başarılı dekonvolüsyon için gerekli olan kütle spektrumu kalitesini koruma açısından nt az 100 olmalıdır. Buna ek olarak, C-tuzak azot basıncı hedef oligonükleotid uzun yaklaşık 75 nt uzun olduğunda azalır ve kütle spektrum kalitesi başarılı Dekonvolüsyonun için yetersiz olmalıdır. Bu tür sınırlamalar protokolü bölümünde tarif edildiği gibi başka bir kasa içinde Cı-trap valf ayarlı olması gerekir, gösterge yazılım son gelişmeler ile kontrol edilebilir. Numune hazırlama için olduğu gibi, deterjan içermeyen reaktiflerin kullanılması uygun pik şekli, yeterli bir tepe şiddetine ve sabit tutma süresi ³¹ açısından daha sonra LC için önemlidir.

bir PS-DVB kapiler monolit kolonu ^21,24-33, bir _C18 ters-faz parçacık silika kolon ^23,40,41 ve bir hidrofobik etkileşim kromatografisi (HILIC) sütunu ⁴² LC kullanılmıştır / oligonükleotidlerin ESI-MS analizi. Bunlar arasında, kılcal monolit sütun ayırma kapasitesi açısından diğerlerinden üstün olduğunu, ancak, geçmiş çalışmalarda kullanılan kılcal monolit sütun in-house yaptı ve enstrümantasyon gerektiren düşük akış hızı (2 ul / dak), işletilmiştir mikro LC adanmış. Kolay işlemini kolaylaştırmak için, ticari olarak temin edilebilen sütun daha yüksek akış oranları (100-400 ul / dakika) uzun oligonükleotitlerin ayrılması için değerlendirildi. DNA dubleksleri (26, 37 ve 53 bp) üç çift yukarıda belirtilen sütunları kullanılarak ayrıldı, ancak, _C18-bağlı partikül silika kolonu ve PS-DVB monolit sütun çevrim süreleri sırasıyla 65 ve 70 dk idi , C oysa _{18-bağlı silika monolit sütun 8 dakika (Şekil 1). Dikkate hızlı analiz alarak, C18-bağlı silika monolit sütun sınırlı ayırma kapasitesine rağmen bizim amaçlarımız için seçildi; Bununla birlikte, geliştirilmiş ayırma gerekli olduğunda, kalan iki sütun kullanılabilir. Teorik olarak, bir monolit kolonu durumunda, hiçbir geçiş hacmidir ve mobil faz, böylece etkili bir ayırma ²⁷ etkinleştirme tutarlı yol uzunluğuna korurken katı faz gözenekleri boyunca akmaya zorlanabilir olacaktır. Bu tür işlemler, büyük moleküller yavaş difüzyonu gibi, böyle bir oligonükleotidin özellikle biomacromolecules analizinde, ortaya olacaktır. Bir monolit sütun pratik yararları bir tane arka basınç, bir parçacık halinde silika kolonu ²⁷ daha düşük olmasıdır. yüksek akış hızı (400 ul / dak) ve düşük kolon sıcaklığı (20 ° C), maksimum geri basınç rağmenSistem MPa ³⁷ 12.5 idi. Bu, uzun bir oligonükleotidin hızlı analizi için bir C18-bağlı silika monolit sütunun avantajı ilk örnek bu olmuştur. Yüksek akış hızı sayesinde, ara yüzeyde mikro LC tam bir bağlantı için özel bir alet gerekli değildir. Bunun yerine, bir ısıtılmış ESI prob, DNA dubleks ayırmak, daha sonra tarif edildiği gibi DNA iyonizasyonu yardımcı olmak için gereklidir.}

İyon çifti kromatografisi yaygın oligonükleotid MS uyumlu ayrılması için kullanılır. Bununla birlikte, bir iyon çifti reajanı genellikle ESI işlemi ile karışır ve ESI-MS duyarlılığını azaltır. Bu nedenle, HFIP sık oligonükleotidin hassasiyetini artırmak için mobil faz için kullanılır. Bununla birlikte, HFIP (kaynama noktası 59 ° C) metanol (kaynama noktası 65 ° C) ve bu nedenle, çözgen ve bu kayıp pH artar ve iyon çifti ayıracı ayrışmasını teşvik (örneğin, çay) önce, ara yüzeyde hızlı buharlaşanoligonükleotidden. Mevcut buluş, 350 ° C 'de sıcak azot gazı ile eluatın nebulizes ısıtılmış ESI sonda kullandığı için, bu etki aşırı önem olabilir. Çünkü eser metal iyonları ^33, adükt oluşumunun bir azalma genotipleme analizi için, bunun yerine HFIP TEA tampon maddesi, Erb ve Oberacher cyclohexyldimethylammonium asetat (pH 8.4 CycHDMAA) önerilir. Yazarlar CycHDMAA kendisini metal ilave maddesinin oluşumunun bastırılması çıkarılabilir. Literatürde rağmen, önemli bir adükt oluşumu, bu yöntemde gözlenmemiştir. Buna ek olarak, HFIP TEA-metanol sistemi kayda değer faydası HFIP TEA-metanol sistemi ile elde edilen tepe alanı T. 86 bp'lik bir amplikon analiz ederken CycHDMAA asetonitril sistemi elde edilenden 17 kat daha fazla olmasıdır poecilonotus (veriler gösterilmemiştir). HFIP TEA-metanol sisteminin bir dezavantajı, CycHDMAA asetonitril sistemine artan maliyet göredir.

monoizotopik kütle hesaplanması çok yüklü iyonların izotopik tepe ayrılmasını gerektirir. Bu nedenle, çözünürlük, bu analiz için kritik önem taşır. gerekli çözünürlük gücü analitin baz çifti uzunluğuna bağlıdır, ancak bin onlarca bir çözünürlük gücüne sahip olan geleneksel TOF analiz, kısa oligonükleotidlerin analizi için sınırlanabilir.

Tablo 4'te gösterilen teorik monoizotopik kütleler analitlerin karşılık gelen baz bileşimlerinin hesaplandı. Seçenek olarak ise, Muddiman ve ark. Doğru kütle ⁴³ baz bileşimin hesaplanması için bir yazılım uygulaması geliştirilmiştir. Benzer bir program otomatik ESI-MS sisteminde ^16-18 entegre edildi. ölçülü monoizotopik kütle her zaman özel bir baz bileşimi o karşılık gelmez, çünkü bu algoritmaların kullanımı, bu yöntemin sağlamlığını artırabilirkaçınılmaz ölçüm hatasından kaynaklanan 3 ppm kitle tolerans kanat. Ne yazık ki, biz bu çalışmada bu yazılım ürünleri elde edemezler.

Bu yöntem temel bileşimi üzerine kurulmuştur ve özellikle de puffer için tasarlanmış bir işlem ile ilgili değildir, bu monoizotopik kütle bazlı türler belirlenmesi puffer farklılaşması için değil, aynı zamanda diğer DNA polimorfizmlerinin tespiti için de uygun olabilir. DNA polimorfizmi tespit edilmesi için de, özel bir ESI-MS sistemi, patojenlerin ^{15,17,18,20,30} tespiti gibi tanısal kullanım için uygun olabilir, tam otomatik ve kullanımı kolaydır. Bunun aksine, mevcut metot, bir araştırma kullanımları için uygun olan, bu nedenle ortak araştırma aletleri ve cihaz ve, ile mümkündür. ESI-MS önce bu tip bir tekli nükleotid polimorfizm ^13,28,32, kısa tandem tekrarı ²⁶ insan DNA polimorfizmi uygulanmıştır, Ve mitokondriyal DNA ^16,19 ANALİZİ. Mikro RNA da kılcal LC / ESI-MS ⁴⁴ ile analiz edildi. Bu yayınlanmış başvurular da mevcut yöntem ile gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem, düşük sıcaklık ayrılmasına bağlı antibiyotik etkileşim ve ribozomal RNA ^45'e oligonükleotid ve düşük molekül ağırlıklı bileşikler arasındaki etkileşiminin izlenmesi için de uygun olabilir. Bu gibi durumlarda, oligonükleotitlerin ve düşük molekül ağırlıklı bileşikler LC / ESI-MS kullanılarak bir avantaj olduğu, aynı zamanda tespit edilmelidir.

Aletler örneğin Sanger sekanslama ve gerçek zamanlı PCR gibi geleneksel tekniklerle olarak paralel bir analiz gerçekleştirmek için uygun olmayan bir sınırlama yoktur. Ek olarak, mevcut yöntem, yalnızca baz bileşim ve aynı molekül içinde bir baz ikame ayırt edilemez tanımlar. Ancak, burada açıklanan MS tabanlı DNA analizi hâlâ dönemde hak olabilirjel elektroforezi ve gerçek zamanlı PCR gibi boya bazlı teknikler DNA bağlama ile karşılaştırıldığında doğruluğu s.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DNeasy Kan & Doku Kiti (50)	Qiagen	69504	DNA ekstraksiyon kiti
Proteinaz K	Qiagen	19131
Etanol (99.5+ hacim%)	Wako	054-07225	Yıkama tamponlarının seyreltilmesi için
TE tamponu (pH 8.0)	Wako	310-90023	DNA örneğinin seyreltilmesi için
PCR astarı	Fasmac	NA	Tedarikçi tarafından ters fazlı kartuş sütunu ile saflaştırılmıştır
Şablon DNA	Eurofins Genomics	NA	Tedarikçi tarafından HPLC ile Saflaştırıldı
Ultra saflaştırılmış su	NA	NA	Numune hazırlama için kullanılan Milli-Q Doğrudan su arıtma sistemi (Merck Millipore) ile üretilmiştir
Deterjan İçermeyen 5x Phusion HF Tampon	Thermo Fisher	F-520L	Sağlanan DNA polimeraz tamponu yerine
kullanın Pfu-X DNA polimeraz	Jena Bioscience	PCR-207S
dNTP karışımı (her biri 20 mM)	Jena Bioscience	NA	DNA polimeraz ile
10 kez verilir;			100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol ve 500 mM NaCl
Dra I	Thermo Fisher	FD0224	Restriksiyon enzimi
Msp I	Thermo Fisher	FD0544	Restriksiyon enzimi
1,1,1,3,3,3-heksafloro-2-propanol (HFIP)	Fluka	42060-50ML	LC-MS sınıfı için Eluent katkı maddesi.
Trietilamin (TEA)	Fluka	65897-50ML	LC-MS sınıfı için Eluent katkı maddesi.
Trifloroasetik asit	Sigma-Aldrich	T6508	Kalibrantın hazırlanması için.
Sodyum hidroksit (1.0 M)	Fluka	72082	Ultra saflaştırılmış su ile 10 mM'ye seyreltin ve trifloroasetik asidin titrasyonu için kullanın.
Asetonitril	Fluka	34967	Kalibrantın hazırlanması için, LC / MS sınıfı.
Metanol	Kanto	25185-76	Mobil faz için, LC / MS sınıfı.
Su	Thermo Fisher	W6-1	Mobil faz için, LC / MS sınıfı.
Mikrosantrifüj tüpü (0,5 ml)	Eppendorf	0030123301	PCR temiz dereceli
Mikrosantrifüj tüpü (1,5 ml)	Eppendorf	0030123328	PCR temiz sınıf
UVette	Eppendorf	0030106300	Tek kullanımlık UV küveti.
Jel Yeşil	Biotium	41004	Floresan DNA lekesi
Cosmospin filtre G (0.2 & mu; m)	Nakalai Tesque	06549-44	Hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) membrandan yapılmıştır. Herhangi bir santrifüj filtre ünitesi (gözenek boyutu, 0.2– 0.5 ve mu; m) hidrofilik PTFE'den yapılmış veya başka bir düşük bağlayıcı membran uygulanabilir.
300 μ l PP vidalı şişe	Amerikan Kromatografi Malzemeleri	V0309P-1232
Önceden monte edilmiş vidalı kapak ve septa	Finneran	5395-09R
Monobis C18 analitik kolon (2.0 ve kez; 50 mm, mezopore boyutu = 30 nm)	Kyoto Monotech	2050H30ODS	Japonya dışında, distribütörleri aracılığıyla GL Sciences'tan satın alınabilir. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 koruma kolonu	Kyoto Monotech	GCSET-ODS3210	Tutucu dahildir.
Cadenza CW-C18 (3.0 kez; 250 mm)	Imtakt	CW036	C18 bağlı partikül silika kolon
ProSwift RP-4H (1.0&;times; 250 mm)	Thermo Fisher	066640	Poli(stiren-divinilbenzen) monolit kolon
Themo Mikser C	Eppendorf	5382 000.023	Balık dokularının sindirimi için.
Spektrofotometre	Shimadzu	UV-3150	DNA konsantrasyonunun miktar tayini.
Termal döngüleyici	Bio-Rad	T100
Portatif buzdolabı	Twinbird	D-CUBE	HFIP'nin buharlaşmasını önlemek için sulu mobil faz için. Bu bir buz kutusu ile değiştirilebilir.
Ultimate 3000 sıvı kromatografı	Thermo Fisher	NA
Q Exactive kütle spektrometresi	Thermo Fisher	NA	Fourier dönüşümü kütle spektrometresi, modifiye edilmiş Kingdon tuzağı analizörü ile donatılmıştır.
Protein dekonvolüsyon 3.0	Thermo Fisher	NA	İzotopik pıtırtı nükleotid modeline sahip sürüm 3.0 veya üstünü kullanın.