Yöntem makalesi

Zebra balığı Embriyolar Endojen Reseptör Affinity Etiketleme Tespiti

DOI:

10.3791/54405

⸱

31 Ağustos 2016

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı embriyolarında bulunan düşük bolluktaki endojen reseptörlerin tespiti için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Buna AFLIP adını verdik çünkü reseptörün immünopresipitasyona bağlı ligandı tarafından afinite etiketlemesinden oluşuyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Affinity Labeling ve Immunoprecipitasyon (AFLIP) güçlerini birleştirerek, zebra balığı embriyolarında düşük bolluk reseptörlerinin tespiti için bir teknik uygulanmıştır. Bu teknik, belirli bir reseptörün, immünopresipitasyonun özgüllüğü ile ligandı tarafından afinite etiketlemesi ile sağlanan seçicilik ve duyarlılıktan yararlanır. Erken zebra balığı gelişimi sırasında betaglikan olarak da bilinen tip III TGF-β reseptörünü (TGFBR3) tespit etmek için AFLIP kullandık. AFLIP, bir TGFBR3 morfant zebra balığı fenotipinin etkinliğini doğrulamada etkili oldu. İlk adımda, embriyo protein ekstraktları hazırlanır ve immünopresipitasyon ile saflaştırılan 125I-TGF-β2-TGFBR3 kompleksi oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, bu kompleksler kovalent olarak çapraz bağlanır ve SDS-PAGE ayırma ve otoradyografi tespiti kullanılarak ortaya çıkarılır. Bu teknik, tespit edilecek reseptör için etiketli bir ligandın ve ona karşı spesifik bir antikorun mevcudiyetini gerektirir ve bu gereksinimleri karşılayan herhangi bir büyüme faktörü veya sitokin reseptörünü tanımlamak için kolayca uyarlanmalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik gelişim sırasında eksprese edilen proteinlerin spesifik tespiti, aynı kökenli mRNA'larının RT-PCR veya in situ hibridizasyon (ISH) ile ölçülmesiyle elde edilen ekspresyon profillerini doğrulamak için gereklidir. Bu genellikle bir batı embriyo ekstraktları lekesi ve ardından spesifik antikorlarla tespit edilerek elde edilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımın çok düşük miktarda bulunan veya lekelenmeleri sırasında kantitatif transferlerini engelleyen özelliklere sahip proteinlere uygulanması zordur. Tip III dönüştürücü büyüme faktörü β (TGF-β) reseptörü (TGFBR3) olarak da bilinen betaglikan, bu zorluklara bir örnektir. TGFBR3, TGF-β'yi çekirdek proteini 1 aracılığıyla bağlayan yarı zamanlı bir membran proteoglikanıdırve onu diğer TGF-β bağlayıcı protein2'den ayıran bir özellik olan TGF-β2 izoformu için belirgin şekilde daha yüksek afiniteye sahiptir. Zebra balığındaki TGFBR3, mRNA3'ünün RT-PCR'si ile tespit edildiği gibi, 8 hpf'den itibaren ifade edilir ve maksimum 72 hpf'ye ulaşır.

Ancak, çok spesifik bir antikor3'ün mevcudiyetine rağmen, çevrilmiş ürününü western blot ile tespit etmeye yönelik her girişim başarısız oldu. TGFBR3'ün proteoglikan doğasının yanı sıra varsayılan düşük bolluğunun bu başarısızlıktan sorumlu olabileceği göz önüne alınarak, TGFBR3'ün TGF-β2 için yüksek afinitesinden yararlanan bir tespit yöntemi olan AFLIP geliştirilmiştir. Bu yöntemde, havuzlanmış embriyolardan elde edilen bir protein ekstraktının 125I etiketli TGF-β2'yi spesifik olarak bağlamasına izin verilir ve reseptör-ligand kompleksleri, SDS-PAGE ile ayrılmadan önce immünopresipitasyon ile saflaştırılır ve çapraz bağlanır. Jellerin otoradyografisi ile gözlemlenen göç modelleri, etiketli reseptör türlerinin varlığını ve doğasını ortaya çıkardı. Bu yaklaşım, afinite etiketlemesinin ligand özgüllüğünü spesifik antikorlar tarafından immünopresipitasyon ile birleştirir, algılama aralığını arttırır ve TGFBR3'ün verimsiz transfer lekelenmesini önler. Doğal özellikleri nedeniyle, AFLIP testi kantitatif bir test değildir, ancak analiz edilen reseptördeki göreceli deneysel farklılıkları güvenle ölçmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarda yürütülen tüm deneyler CICUAL-Protokol numarası altında, Laboratuar Hayvanları Bakım ve México Özerk Ulusal Üniversitesi (UNAM) Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fizyoloji Celular, Universidad Nacional Autonoma de México").

Embriyo Protein Özü 1. Hazırlık

  1. Her koşul örneği 72 saat sonra döllenme (hpf) için, istenilen aşamada (morphants vs yabani tip) karşılaştırmak için 200 embriyolar - 100 toplayın.
  2. Balık su içeren Petri yerleştirin embriyolar (Tablo 1) ve elle ince uçlu forseps kullanarak embriyolar dechorionate. hedeflenen reseptör sindirmek olabilir bu aşamada (ya da protokol boyunca başka herhangi bir proteaz) sırasında pronase kullanmaktan kaçının.
  3. 1.5 ml mikrofuge'de tüp yerleştirin embriyolar ve embriyo tw yıkama1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile buz (Tablo 1 e bakınız).
  4. Deyolk tampon 500 ul ekle (Tablo 1 e bakınız).
  5. (- 40 kez yaklaşık 30) çözelti içinde embriyolar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme sarısı en bırakın. 72 hpf ve 48 hpf embriyolar için sırasıyla mavi ve sarı pipet uçları kullanın. Sarı ipuçları biraz embriyoların yok önlemek için kesmek gerekebilir. Başarılı sarısı bırakma mikroskop altında embriyoların gözlemleyerek kontrol edilebilir.
  6. 15 saniye boyunca 600 x g'de santrifüj ile embriyolar toplayın.
  7. Bir pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın.
  8. Yıkama embriyolar iki kez 500 ul yıkama tamponu ile hafifçe düşük hızda karıştırın (Tablo 1 e bakınız).
  9. 15 saniye boyunca 600 x g'de santrifüj ile embriyolar toplayın.
  10. Buradan itibaren, 4 ° C'de prosedürü devam etmektedir.
  11. Bir pipet kullanarak dikkatlice süpernatant atın.
  12. lizis tamponu 350 ul süspanse embriyolar (Tablo 1 'e bakınız) ve plastik bir havan tokmağı kullanılarak homojen hale getirilir.
  13. 4 ° C de bir test tüpü rocker lize embriyolar çalkalama ile 30 dakika kuluçkalayın.
  14. Santrifüj çözünmeyen artık çıkarmak için 15 dakika 11,000 x g'de embriyolar parçalanmıştır.
  15. Transferi yeni bir tüp bir pipet kullanarak süpernatant temizledi.
  16. Bradford protein deneyi 4 veya başka bir uygun yöntem vasıtasıyla, toplam protein belirler. Bradford tahlili kullanıldığında, bunlar 4 Standart proteinin tahmin edilmesine neden olarak, liziz tamponunda deterjanlar sunar eşdeğer konsantrasyonlarının varlığında kalibrasyon eğrisi gerçekleştirin.

2. Tespit Endojen Reseptör Protein

  1. Affinity Etiketleme ve Immunoprecipitation (bütün bu adımlar 4 o C'de)
    1. 1.5 ml mikrofuge'de tüp içinde toplam embriyo protein, 500 mg ve tamponu 1 (bakınız Tablo 1) ile 1 mcg / ul sulandırmak - 400 yerleştirin.
      Not: yaklaşık 100 toplam embriyo proteinin 500 ug elde etmek için - 200 embriyo ilk işlenmelidir. 72 HPF embriyolar rutin Betaglikan tarama için yeterli olana toplam embriyo proteininin ~ 5 ug verim.
    2. 150 pM'lik bir nihai konsantrasyon elde edildi ve 4 ° C 'de, bir test tüpü külbütör 2 saat ajitasyonla inkübasyona etiketli TGF-β2 stokunun yeterli hacim. AFLIP başlatılmadan önce Cheifetz ve ark., 5 ile tarif edildiği gibi, TGF-β2 kloramin T yöntemiyle 125I ile etiketlenmesi gerekir.
      DİKKAT: Ben ligand etiketli 125 taşıma sırasında maruziyeti en aza indirmek için koruyucu.
    3. 100 seyreltme ve (kuluçka O / N olabilir), 4 ° C'de başka bir 2 saat daha inkübasyona devam: 1 ulaşmak için ilgi alıcısına karşı seyreltilmemiş antikorun yeterli hacim. Bu, bu çalışmada kullanılan ve başka bir yerde tarif edilen 3, ama kalitesine bağlı olarak, antiserum # 31 optimal dilüsyonudurtibody daha büyük veya daha küçük bir seyreltme uygun olabilir.
    4. Uygun bir immünoglobulin bağlama, boncuk tanelerin 50 ul ekle (örneğin, daha önce TNTE içinde dengelenmiş 1 yeniden süspanse edildi, G-proteini-Sefaroz: TNTE orjinal hacminin 5) ve 4 ° bir test tüpü rocker çalkalama ile 50 dakika boyunca inkübe C.
    5. 20 saniye boyunca 11.000 xg mikrosantrifüj boncuk kurtarın.
    6. Uygun bir radyoaktif çöp konteyner içinde süpernatant atın.
    7. 20 saniye, her seferinde 11,000 xg, vorteks ve mikro santrifüjleme IP yıkama tamponu (bakınız Tablo 1) 1 ml IP boncuk üç kez yıkayın.
    8. Süspanse IP-boncuk, IP yıkama tamponu 250 ul.
    9. (10 mg / ml DMSO içinde çözülmüş DSS) disüksinimidil suberat 1.5 ul ekle. Sadece bu aşamada kullanılmadan önce DSS çözeltisi hazırlayın.
    10. çalkalama ile 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    11. Çapraz bağlama reaksiyonu söndürmek için 500 ul o eklemeYeterince Tris-Cl, pH 7.4 stok ile desteklenmiş F IP yıkama tamponu, 25 mM Tris-Cl ulaşmak için. Tris serbest amino grupları reaksiyona girmemiş DSS yakalamak.
    12. 20 saniye boyunca 11.000 xg'de Santrifüj IP boncuk toplamak ve süpernatant atmak için.
    13. Süspanse IP boncuk Laemmli tamponu indirgeme 30 ul.
    14. Kaynama örnekleri 94 ° C 'de 5 dak.
    15. İsteğe bağlı olarak, imalatçının protokolü kullanılarak bir gamma sayacında örnekleri analiz eder.
  2. numune Analizi
    1. SDS-PAGE denatüre Konu örnekler. reseptör kütlesi için uygun oranda poliakrilamid kullanın ve standart prosedür altında jel çalıştırın.
    2. Sabitleştirici çözeltide jel daldırın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (bakınız Tablo 1).
    3. 15 dakika boyunca damıtılmış su ile jel yıkayın.
    4. Daha önce sulu filtre kağıdına jel yerleştirin ve Saran wrap film ile kaplayın.
    5. 1 saat boyunca 80 ° C'de kuru jeli.
    6. Beyaz Fosfor bağırıyorum üzerinde jel AçığaRT O / N en-.
    7. Üreticinin protokolü kullanılarak bir fosforimager kullanılarak maruz ekranı tarayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, AFLIP ile elde edilen temsili bir sonuç göstermektedir. 125 I-ligand gelen Lane 1 Sinyaller kovalent (150 kDa işaretleyici altında BG çekirdek) zebrabalıkları Betaglikan çekirdek protein veya glikozaminoglikan eki (GAG, smear tarafından proteoglikan forma işlendikten BG çekirdek ya bağlı ), 170 kDa, jelin en arasında değişmektedir. Göç Bu model, keskin çekirdek proteini ek olarak (nedeniyle GAG zincirlerinin uzunluğu heterojenliği) bir bulaşmış proteo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilgi konusu bir proteinine karşı spesifik bir antikor ile Western lekeleri kullanımı embriyojenez sırasında ifadesini 7 incelemek için değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yüksek-glikosile proteinlerin immünoblot yetersizlikler nedeniyle transfer ve nitroselüloz ya da PVDF zarlarına 8,9 zayıf bağlanma için çok başarılı olmamıştır.

Proteoglikanlar çünkü negatif yüklü ve polistiren yüzeyler veya hidrofobik lekeleme membranların ya iyi bağlamaz onların kovalent bağlı gli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, balık bakımı ve bakımı için Gilberto Morales'e ve tavşan bağışıklaması konusundaki yardımları için Dr. Claudia Rivera ve Hector Malagòn'a (IFC-UNAM Hayvan Tesisi) teşekkür eder. Bu çalışma CONACYT 131226 ve PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916 tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Diseksinimidil suberat (DSS)ThermoFisher Scientific21555
Protein G Sefaroz 4 Hızlı AkışGE Healthcare Yaşam Bilimleri17-0618-01
Jel Kurutucu Model 583 & nbsp;BIO-RAD1651745
Typhoon 9400GE Sağlık Yaşam Bilimleri63-0055-78
Cobra II Otomatik gama sayacıPackard
Pozlama KasetiMoleküler Dinamik63-0035-44
NaClJ.T. Baker3624
KClJ.T. Baker3040
Na2HPO4JT Fırıncı3828
K2HPO4JT Fırıncı3246
CH3OHJ.T. Fırıncı9070
CH3COOHJT Fırıncı9508
HCHOJ.T. Fırıncı2106
SDSSigma-AldrichL4509
EDTASigma-AldrichED
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC3306
NaHCO3< / sub>Fisher ScientificS233
PMSFSigma-AldrichP7626
Kristal Deniz Marine MixDeniz İşletmeleri Uluslararasıhttp://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
  2. Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
  3. Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
  4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  5. Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
  6. López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  8. Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
  9. Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
  10. Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
  11. Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
  12. Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
  13. Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
  14. Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
  15. Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
  16. Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mm nopresipitasyonTGFBR3 TespitiRadyoaktif LigandSDS PAGEAutoradyografiMorpholino ile NakavtBetaglikanB y me Fakt r Resept rleri

İlgili makaleler