Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir

7.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54415

⸱

12 Eylül 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2National Risk Management Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 3Oak Ridge Institute for Science and Education, 4Department of Biological Sciences, McMicken College of Arts and Sciences, University of Cincinnati

Bu makalede

Özet

Mevcut kıt kaynak ortamında, araştırmacıların çalışmaları daha ucuz, daha hızlı ve daha hassas bir şekilde yürütmelerine olanak tanıyan yeni teknolojiler ortaya çıkıyor. Burada, insanların aynı anda birden fazla çevresel patojene maruz kalmasını ölçmek için boncuk bazlı bir tükürük antikoru multipleks immünolojik testin geliştirilmesini açıklıyoruz.

Özet

etiyoloji ve çevresel patojenlere karşı insan maruziyet etkileri dolayısıyla, pozlama ve enfeksiyonlar kullanarak maliyetli, yüksek hacimli yaklaşımları değerlendirmek yeteneği vazgeçilmez olacağını, dünya çapında önemli bir endişe ve. Bu yazıda, aynı anda birden fazla patojen insan tükürük antikorların varlığı ölçebilen bir tane bazlı çoklu immunoassay geliştirilmesi ve analizini açıklamaktadır. o, invaziv olmayan ucuz ve serum daha toplamak için kolaydır çünkü tükürük bu uygulamada özellikle çekici. Çevresel patojenlerinin antijenlerinin karboksillenmiş mikrosferler (taneleri) birleştirilmiş bir tane bazlı, solüsyon faz tahlili kullanılarak insan tükürük örnekleri çok küçük hacimlerde antikorları ölçmek için kullanılmıştır. Boncuk Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviruses (G I.1 ve G II.4) antijenleri ve hepatit A virüsü ile birleştirildi. antijenler yeterli birleştirildi sağlamakboncuklar, birleştirme biyotinlenmiş anti-tür ikincil bir saptama antikorları ve streptavidin-R-fikoeritrin muhabir (SAPE) ile kuluçkalandı ve ardından, türe-özgü, hayvansal kaynaklı primer yakalama antikorları kullanılarak teyit edildi. herhangi bir antijene bağlı değildi dışında spesifik olmayan ölçmek için bir kontrol olarak, bir boncuk grubu diğerlerine aynı işleme tabi tutuldu. antijen bağlı olan ve kontrol tanesi, daha sonra akış sitometrisi ilkelerine göre yüksek bir verim Analyzer üzerinde ölçülen, ileriye yönelik olarak toplanan, insan tükürük numuneleri ile inkübe edilmiştir, ve her bir antijene karşı antikorlar, ortalama florasan yoğunluğu birimleri (MFI) ölçüldü . Bu multipleks immunoassay daha az numune ile daha fazla veri içeren avantajlar, bir numarası vardır; azaltılmış maliyetler ve işçilik; ve yetenek ilgi birçok hedefleri tahlil özelleştirmek için. Sonuçlar tükrük çoklu bağışıklık especia olabilir, daha önceki maruz ve enfeksiyonları belirleme yeteneğine sahip olabileceğini göstermektedirBüyük insan topluluklarını kapsayan gözetim çalışmalarında Lly faydalıdır.

Giriş

Ishal ilişkili hastalık seksen sekiz yüzde dünya çapında yaklaşık 1.5 milyon ölüme neden, kirli su insan maruz güvensiz gıda ve kötü sanitasyon / hijyen ile ilişkilidir, çoğunluğu çocuk 1 bulunmaktadır. Bu halk sağlığı yetkilileri ve politika yapıcılar için endişe önemli bir nedenidir. Su bazlı ve diğer çevresel patojenler ile ilişkili pozlama ve hastalıkları araştırmak için bir çaba, insan örneklerinde 2-4 antikorları ölçmek için bir multipleks immunoassay geliştirdi. Bu yöntem, bu patojenlere maruz kalma belirlemek ve daha iyi immunoprevalence ve olay enfeksiyonları tanımlamak için epidemiyolojik çalışmalar uygulanabilir.

Tükürük insan biyomarker araştırma için serum alternatif olarak önemli söz sahibidir. Tükürük kullanmanın avantajları arasında non-invaziv ve numune toplama, düşük maliyet kolaylığı vardır, ve numuneler kolayca çocukların 5-7 / Sup>. Serum ve tükürük örnekleri H. karşı antikorlar için yoğun çalışmalar yapılmıştır pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatit virüsleri A ve C 13-14, Noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dang humması virüsü 16, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), 17 ve Escherichia coli O157: H7 18.

Bir çoklu immünolojik eş zamanlı olarak tek bir örnek hacmi içinde ve bir döngü veya çalışmasında çok analit analizi sağlar. C Çoklanmış antijenler jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatit A virüsü, ve iki Noroviruses bir kullanarak bu patojenler, insan tükürük IgG 2-4 ve IgA 3,4 ve plazma IgG 2,3 antikor tepkilerini ölçmek için kullanılmıştırBoncuk esaslı çoklayıcı immüno. su, toprak ve gıda mikroplara maruz kalma epidemiyolojik çalışmalar ile birlikte kullanıldığında, bu çalışmada açıklanan testin tipi çevre patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların anlayışı geliştirmek için değerli bilgiler verebilir. Ayrıca, bu tür çalışmalarda elde edilen tükürük antikor veriler risk değerlendirmesi modelleri 19-22 geliştirmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Onay (KİK # 08-1844, Kuzey Karolina, Chapel Hill, NC, USA Üniversitesi) Boquerón Beach, Porto Riko, en beachgoers gelen uyarılmış oluğu tükürük örneklerinin toplanması için Amerika Birleşik Devletleri'nde bir parçası olarak Kurumsal Değerlendirme Kurulu elde edildi çevre Koruma Ajansı (USEPA) Milli Epidemiyolojik ve Dinlenme (NEEAR) Su Çalışması 23 çevresel Değerlendirme yüzme ilişkili risklerini ve hastalıkları değerlendirmek için. Çalışma konuları bilgilendirilmiş onam sağlanan ve eğitimli USEPA yükleniciler tarafından tükürük toplama cihazının kullanımı ile ilgili talimatı verildi. Tükürük numuneleri alınması üzerine, bu santrifüjlenmiş ve 4 anlatıldığı gibi -80 ° C'de saklandı, buz üzerinde taşınmıştır ve bulundu.

1. Boncuk Aktivasyon

  1. Vorteks ve 20 saniye sonicating ve mikrosantrifüj tüplerine stok boncuk (400 ul) transferi yaklaşık 5.0 x 10 6 tarafından süspanse boncuk seti stokları.
    Not: TO 12.5 x 10 6 boncuk / ml'lik bir konsantrasyonda temin edilmektedir boncuk.
  2. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de santrifüj edilerek stok boncuk pelet.
  3. 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile damıtılmış su (dH 2 O) Süpernatantı ve 100 ul pelet boncuklar tekrar süspansiyon. Adımı tekrarlayın 1.2.
  4. Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 100 mM sodyum fosfat monobazik, pH 6.2, 80 ul yıkandı boncuklar tekrar süspansiyon.
  5. Kullanımdan hemen önce, 10 mg Sülfo-NHS kana 200 ul dH 2 O eklenerek 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sülfo-NHS) çözüm. girdap ile karıştırın.
  6. Boncuklar 50 mg / ml Sülfo-NHS 10 ul ekle. girdap ile karıştırın.
  7. Kullanımdan hemen önce, 10 mg EDC kana 200 uL damıtılmış su (DH 2 O) eklenerek 50 mg / ml 1-etil- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) çözüm. girdap ile karıştırın.
  8. 50 10 ul ekleyintanelere mg / ml EDC çözeltisi. girdap ile karıştırın. 10 dakika aralıklarla girdap karıştırma ile, karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
  9. Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile, 50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit (MES), pH 5.0, 250 ul içinde yeniden süspanse boncuklar.
  10. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
  11. Tekrarlayın 1.9 ve 1.10 adımları.
    Not: Bu, 50 mM MES, pH 5.0 ile iki kez yıkamadan toplam sağlar.
  12. 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 50 mM MES, pH 5.0, 100 ul boncuk tekrar.

2. Boncuk Kaplin

  1. Çift Tablo 1 'de gösterilen konsantrasyonları kullanılarak kordon kümelerine antijenler.
  2. aktive boncuklar, her antijen ekleyin ve 50 mM MES, pH 5.0 içinde 500 ul toplam hacim getirmek. antijenleri karıştırın birgirdap tarafından d boncuklar.
  3. karanlıkta, oda sıcaklığında dönme (~ 15 dak) karıştırma ile 2 saat süre ile, antijenleri ve boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile bağlanmış boncuk Pelet.
  4. Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ul içinde yeniden süspanse boncuklar (PBS) -bovine serum albümini (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolaurat (Tween-20) -sodyum azid (PBS-TBN) girdap ve sonikasyon ile pH 7.4 ile yıkanır. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak.
    Dikkat: Sodyum azid bir akut toksik bir kimyasaldır. Yutma veya cilt ile temasında alırsa o ölümcüldür. Toz / duman / gaz / sis / buhar veya sprey teneffüs etmeyin. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) 'ın işlerken giyin ve uygun kanunlara uygun olarak bertaraf edin.
  5. 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile PBS-TBN 1 ml boncuk tekrar.
  6. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüje edilerek boncuk Pelet.
  7. Tekrarlayın 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın.
    Not: Bu PBS-TBN ile iki yıkar toplam sağlar.
  8. 1 ml PBS,% 1 BSA,% 0.05 azid, pH 7.4 içinde bağlı ve yıkandı boncuk süspanse. karanlıkta 2-8 ° C buzdolabı bağlanmış boncuklar saklayın.

3. Boncuk Sayısı

  1. su veya PBS tamponu içinde bağlanmış boncuk 1:10 seyreltme hazırlayın.
  2. Yük örnek tanıtım noktasında bir hemasitometre üzerine boncuk seyreltme 10 ul.
  3. 4 x 4 köşe ızgaraları birinde görülen boncuk sayın. Kont (4 x 4 ızgara 1 köşesi) x (1 x 10 4) x (seyreltme faktörü) ml x tabanda hacmi: aşağıdaki formül kullanılarak birleştiğinde boncuk toplam sayısını hesaplayın.

Antijen bağlamalar 4. Onay

  1. 20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile ilgi antijenlere birleştiğinde boncuk stok karışımı tekrar süspansiyon.
  2. nihai bağlanmış boncuk stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayınPBS-% 1 BSA tamponu (PBS% 1 BSA, pH 7.4) içinde belirlenen her bir benzersiz boncuk / ml, 100 boncuk konsantrasyonu.
  3. en az 7 PBS-% 1 BSA tamponu ile 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın üreticinin tavsiyelerine göre IgG primer antikor anti-tür seri seyreltileri iki misli hazırlayın.
  4. Yıkama tamponu, 100 ul her bir antijen birleştirme doğrulama testi için 96 oyuklu filtre taban plakasının ayrı bir 8 oyuklu kolonu (8 sıra) önceden ıslak ve vakum ile süpernatantı. Önceden ıslak oyuklara boncuk karışımı (antijene bağlanan boncuklar) Çalışma 50 ul ekle.
  5. Arka plandaki kuyulara olarak hizmet seyreltilmiş antikor yerine 8 satır 96-çukurlu bir filtre plakasının her bir sütunun satır 1-7 ve PBS% 1 BSA tamponu 50 ul antikor seyreltileri 50 ul ekle. pipetleme ile 5 kez aşağı çok kanallı bir pipet ile karıştırılır. Her antijen birleştiğinde boncuk seti için aynı prosedürü uygulayın teyit edilecek.
  6. Kapak ve oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin500 rpm'de bir mikro çalkalayıcı içinde 1 saat süre ile kısa süreli olarak. vakum ile süpernatantı.
  7. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. 1x tekrarlayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
  8. PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile anti-türe özel IgG sekonder antikor saptama seyreltilir.
  9. aşağı 5 kez yukarı pipetleme ve her kuyuya seyreltilmiş ikincil antikor 50 ul ekleyin.
  10. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  11. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
  12. PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
  13. her muhabir 50 ul iyi ekleyin ve yukarı pipetleme ve 5 kez aşağı karıştırın.
  14. Cve filtre plakası üzerine bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  15. Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı 29 ile 50 ul analiz eder.
    Not: tane bazlı çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. hataları önlemek için varsa, her zaman, yazılım kılavuzunun en son sürümü bakın.

5. Tükürük Multiplex İmmunoassay

  1. -80 ° C dondurucu tükürük alınır ve oda sıcaklığında erimeye sağlar.
  2. Süspanse antijen 20 saniye vorteks ve sonikasyon ile boncuk stokları birleştiğinde.
  3. PBS-% 1 BSA tampon içinde benzersiz her boncuk grubunun / ml, 100 boncuk nihai konsantrasyona bağlı kordon stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayın.
  4. tükürük 4 seyreltme w: 1 hazırlayınPBS-% 1 BSA, 96 tampon de, derin oyuklu plakaya i.
  5. Ön ıslak filtre yıkama tamponu 100 ul ile plaka ve vakum ile süpernatant kaldırmak.
  6. 8 nihai seyreltme: çalışan bir boncuk karışımı ve 1 96 oyuklu filtre plakası 95 oyuklarına seyreltildi tükürük, eşit hacimde 50 ul ekle. Çok kanallı bir pipet ile reaksiyonları karıştırın. de birinin kontrol edilmesi için, 50 ul antijen bağlanan boncuklar artı (tükürük için bir yedek olarak) PBS-% 1 BSA tampon 50 ul ekle.
  7. Kapak 500 rpm'de bir mikro-plaka çalkalayıcıda 1 saat süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe sağlar. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  8. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
  9. PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile edilmiş keçi anti-insan IgG ikincil antikoru saptama seyreltilir.
  10. her çukuruna ikincil antikor seyreltilmiş 50 ul ekle ile karıştırınÇok kanallı bir pipet.
  11. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  12. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
  13. PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
  14. her 50 ul muhabiri de ekleyin ve çok kanallı pipet ile karıştırın.
  15. Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
  16. Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı 29 ile 50 ul analiz eder.
    Not: çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) birimleri cinsinden ölçülür. Her zaman ifadeYazılım kılavuzun en son sürümü, varsa hataları önlemek için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir benzersiz Boncuk değişkenlik örnek için spesifik olmayan bağlanma ölçmek ve kontrol numunesi olarak kullanılmıştır. Bu boncuklar da birleştirme aşamasında herhangi bir antijen ile inkübe değil haricinde antijene bağlanmış boncuklara benzer şekilde muamele edilmiştir. ayrıca serumdan şüpheli kirlenme nedeniyle analizleri ve kalan yanıtlar dağıtılan log edildi tüm tükürük örnekleri ile inkübe kontrol boncuk elde edilen MFI değerleri> 500 çıkarıldı. dişeti toplama cihazına veya çalış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu sonuçlar, çok katlı bir bağışıklık deneyi, immünopozitif ya immunonegative olan tükürük örnekleri arasında ayrım için yararlı olduğunu göstermektedir. immunopozitivitesi belirlemek için, tek bir kesim noktası ortalama artı tükürük örneklerinin her test kontrol Kuplajsız boncuk log dönüştürülmüş MFI yanıtları üç standart sapma hesaplanırken tarafından geliştirilmiştir. kesim noktası, ya bir tek ya da çok patojenlere maruz kalma ve immunoprevalence değerlendirme yeteneği elde edildi. Bu ayrımcı güç, çevresel ve diğer p...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Araştırma ve Geliştirme onun Ofisi aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı tarafından finanse edilen ve burada açıklanan araştırma başardı. Bu Kurumun idari inceleme tabi ve yayın için onaylanmıştır. ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon kullanımı için onay ya da tavsiye niteliğinde değildir.

Teşekkürler

Clarissa Curioso, ABD Enerji Bakanlığı ve ABD EPA arasındaki kurumlar arası bir anlaşma yoluyla Oak Ridge Bilim ve Eğitim Enstitüsü tarafından yönetilen ABD Çevre Koruma Ajansı'ndaki Araştırma Katılım Programına atanarak desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman ve Yazılım
MikrosantrifüjThermo Electron Corporation75002446Numuneleri santrifüjlemek için kullanılır
Vorteks KarıştırıcıVWRG560Numuneleri karıştırmak için kullanılır
Sonikatör (mini)Fisher Scientific15-337-22Boncukları ayırmak için kullanılır
Pipetleyiciler P10, P20, P100, P1000, 8 kanal. CappÇeşitli Hemasitometre
(Parlak Çizgi)Housser Scientific 3200Birleştirilmiş boncukları saymak için kullanılır
Çok Ekranlı Vakum ManifolduMilliporeMSVMHTS00Süpernatan MicroShaker'ı çıkarmak için yıkama adımlarında kullanılır
VWR12620-926İnkübasyonlar sırasında boncukları çalkalamak için kullanılır
Tüp rafı (1,5 ml ve 0,5 ml) (çeşitli)VWR30128-346
Tartı Tartısı, Mettler veya diğerTampon yapmak için yıkama reaktiflerini ölçmek için kullanılır
Dynabead Numune KarıştırıcıInvitrogen947-01Birleştirme inkübasyon adımı
MatLab (R2014b)kullanılırThe MathWorks, Inc.Antikor yanıt verilerini analiz etmek için kullanılır
Microsoft Excel 2014Microsoft CorporationAntikor yanıt verilerini analiz etmek için kullanılır
xPonent 3.1 yazılımına sahip Luminex AnalyzerLuminex CorporationLX200-XPON3.1Testi çalıştırmak için kullanılan cihaz ve yazılım
Antigens
GI.1 Norwalk Virüsü: p-parçacıkXi Jiang (CCHMC)*NA*Cincinnati Çocuk Hastanesi. Son conc. 5 &mikro;g.
GII.4 Norovirüs VA387: p-parçacıkXi Jiang (CCHMC)*NA*Cincinnati Çocuk Hastanesi. Son conc. 5 &mikro;g.
Hepatit A Virüsü: hücre kültüründen derece II konsantreMeridian Life Sciences8505Antijen 100 & mikro'da birleşmiş; g
Helicobacter pylori: lizatMeridyen Yaşam BilimleriR14101Antijen 25 & mikro'da birleşmiş; g
Toxoplasma gondii< / em>: rekombinant p30 (SAG1)Meridyen Yaşam BilimleriR18426Antijen 25 & mikro'da birleşmiş; g
Campylobacter jejuni: ısıyla öldürülen bütün hücrelerKPL50-92-93Antijen 50 & mikro'da birleşmiş; g
Birincil Antikorlar< / güçlü >
kobay anti-Norovirüsü(CCHMC) *NABirleştirme onayı için kullanılır
Fare anti-Hepatit A IgGMeridyen Yaşam BilimleriC65885MBirleştirme onayı için kullanılır
Fare anti-Hepatit A IgGMeridian Yaşam BilimleriC65885MKaplin onayı için kullanılır
BacTraceAffinity Helicobacter pyloriKPL01-93-94'esaflaştırılmış
Keçi pAb'nin Toxoplasma gondiiAbcamiçinonayı için kullanılır
BacTrace Keçi anti-Campylobacter türleriKPL01-92-93Kaplin onayı
için kullanılırİkincil  Antikorlar< / güçlü >
Biotin-SP-Konjuge AffiniPure Donkey anti-Keçi IgG (H + L)Jackson705-065-149Birleştirme onayı için kullanılır
Biyotinillenmiş Tavşan anti-Keçi IgG (H + L)KPL16-13-06Eşleşme onayı için kullanılır
Biyotinile Keçi anti-Fare IgG (H + L)KPL16-18-06Kaplin onayı
için kullanılırAfinite Saflaştırılmış Antikor Biotin Etiketli Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)KPL176-1506Kaplin onayı için kullanılır
Sarf malzemeleri< / güçlü >
1.5 ml kopolimer mikrosantrifüj tüpleriABD Scientific1415-2500Düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri
10 ve mikro olarak kullanılır; l pipet ucu yedekleriBioVentures5030050C
200 & l pipet ucu yedekleriBioVentures5030080C
1.000 & l pipet ucu yedekleriBioVentures5130140C
Alüminyum folyoKullanılan Çeşitli SatıcılarKuluçka sırasında boncukları karanlıkta tutar
Derin Kuyu plakalarıVWR40002-009Tükürük örneklerini seyreltmek için kullanılır
Çok Ekranlı Filtre PlakalarıKırlangıçMABVN1250Tahlilleri çalıştırmak için kullanılır
Oracol tükürük toplama sistemiMalvern Medical Gelişmeler SınırlıTükürük toplama için kullanılır
Reaktifler< / güçlü>
Karboksilatlı mikroküreler (boncuklar)Luminex CorporationBoncuk setine bağlıAntijenler mikrokürelere bağlanır
EDC (1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür)Pierce77149 veya 22980Boncuk aktivasyonunda kullanılır
Sülfo-NHS ( N< / em >-hidroksisülfosüksinimid)Pierce24510Boncuk aktivasyonunda kullanılır
Steptavidin-R-fikoeritrin (1 mg / ml)Moleküler ProblarS-866Muhabir olarak kullanılır
MES (2- [ < / em>-Morfolino] etansülfonik asit)SigmaM-2933
Tween-20 (Polioksietilenorbitan monolaurat)Sigma'yıbirleştirmek için kullanılırP-9416Spesifik olmayan bağlamayı çıkarmak için yıkama tamponunda kullanılır
Protein Tamponları
PBS-TBN Engelleme / Depolama Tamponu (PBS,% 0.1 BSA,% 0.02 Tween-20,% 0.05 Azide, pH 7.4)< / güçlü > **Filtre Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; C
PBS, pH 7.4SigmaP-3813138 mM NaCl, 2.7 mM KCl
BSASigmaA-7888%0.1 (a/h)
Ara-20SigmaP-9416%0.2 (h/h)
Sodyum Azid (%0.05 azid)**SigmaS-8032**Dikkat: Sodyum azid akut toksiktir. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Uygun KKD'ler giyin. Yürürlükteki yasalara göre imha edin.
MES / Birleştirme Tamponu (0.05 M MES, pH 5.0)< / güçlü >
MES (2- [ N < / em >-Morfolino] etansülfonik asit)SigmaS-3139
5 N NaOHFisherSS256-500
Tahlil Tamponu (PBS,% 1 BSA, pH 7.4)   Filtre Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; C
PBS, %1 BSA, pH 7.4SigmaP-3688138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, %1 BSA
Aktivasyon Tamponu (0.1 M NaH2PO<>4, pH 6.2) < / güçlü >Filtre Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; C
NaH2< / sub>PO4< / sub> (Sodyum fosfat, monobazik susuz)SigmaS-31390.1 M NaH2< / sub>PO4< / sub>
5 N NaOHFisherSS256-500
Wash Buffer (PBS,% 0.05 Tween-20, pH 7.4) < / güçlü >Filtre Sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; C
PBS, %0,05 Ara-20, pH 7,4SigmaP-3563138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, %0,05 TWEEN
sırasında karşı antikor kullanılır Birleştirme

Kaynaklar

  1. Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
  2. Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
  3. Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
  4. Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
  5. Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
  6. Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
  7. Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
  8. Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
  9. Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104(2011).
  10. Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
  11. Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
  12. Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
  13. Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
  14. Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
  15. Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
  16. Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).
  17. Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
  18. Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
  19. Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
  20. Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
  21. Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
  22. Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
  23. Wade, T. J., et al. Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
  24. Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).
  25. Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
  26. Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
  27. Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
  28. Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
  29. Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
  30. Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Boncuk Tabanl AnalizAk SitometrisiAntijen Kenetlenmesinsan T k rSekonder TespitStreptavidin R PEMedyan Floresan iddeti
Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.