Method Article

Hassas immünohistokimyasal sitozin Modifiye Formlar Algılama

DOI:

10.3791/54416

⸱

August 16th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Neurophysiologie (CP601), ULB Neuroscience Institute (UNI), Université Libre de Bruxelles, 2Medical Molecular Sciences, Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham, 3School of Life Sciences, University of Nottingham, 4Division of Cancer and Stem Cells, Centre for Biomolecular Sciences, School of Medicine, University of Nottingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, peroksidaz konjuge ikincil antikorların ve tiramid sinyal amplifikasyonunun kullanımına dayalı olarak 5mC oksidasyon türevlerinin uzamsal dağılımını haritalamak için hassas bir immünokimyasal yöntemi açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı genomlarında meydana gelen sitozin bazlarının (5-metilsitozin, 5mC) metilasyonu genellikle transkripsiyonel susturma ile ilişkilidir. 5-hidroksilmetilsitozin (5hmC), 5-formilsitozin (5fC) ve 5-karboksisitozin (5caC), biyolojik işlevleri nispeten belirsiz kalan 5mC'nin enzimatik oksidasyonu ile üretilen yakın zamanda keşfedilen modifiye sitozin bazlarıdır. Çeşitli biyolojik sistemlerdeki bu modifikasyonların genomik dağılımını ve küresel içeriğini incelemek için biyokimyasaldan antikor bazlı tekniklere kadar bir dizi yaklaşım kullanılmıştır. Bu yaklaşımlardan bazıları, 5mC'nin bu modifiye formlarının kantitatif değerlendirmesi için yararlı olabilse de, bu yöntemlerin çoğu, fonksiyonel rollerinin doğru anlaşılması için gerekli olan bu DNA modifikasyonlarının farklı hücre tiplerindeki dağılımına ilişkin herhangi bir mekansal bilgi sağlamaz. Burada, modifiye edilmiş sitozin formlarının immünokimyasal tespiti için oldukça hassas bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bu epigenetik işaretlerin protein soy belirteçleri ile birlikte tespit edilmesine izin verir ve nükleer lokalizasyonlarını incelemek için kullanılabilir, böylece farklı deneysel bağlamlarda potansiyel biyolojik rollerinin deşifre edilmesine katkıda bulunur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA (5MC) sitozin bazlarının metilasyon transkripsiyonel 1 susturulması ile ilişkili omurgalıların genomları bulunan önemli bir epigenetik işareti temsil eder. 5MC tanıttı ve DNA methyltransferases 2-5 muhafaza ve genomik imprinting, X kromozomu inaktivasyonu, hücresel farklılaşma ve gelişme 3, 6. Sonuç olarak, bozulma dahil biyolojik süreçlerin bir dizi önemli rol oynamaktadır gösterilmiştir ediliyor 5MC genomik desenler hastalıklar 7, 8-11 bir dizi ile ilişkilidir. geliştirme ve hastalık 5MC rolünü anlamak ilerlemeye rağmen, hala bu işareti gelişmekte olan ve erişkin dokular çıkarıldı ediliyor ne ölçüde bilinmemektedir olduğunu. DNA, demetilasyon birçok potansiyel mekanizma en son aktif ve pasif demetilasyon mekanizmaları 12, 13, 14, 15 dahil olmak üzere, önerilmiştir. Discovery 1011 translokasyon enzim aracılı 5MC sıralı oksidasyon ürünleriES (tet1 / 2/3) gibi bunların ara maddeleri olarak hizmet edebilir olup 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) ve DNA 16, 17, 18, ​​19 spekülasyonlar istendiğinde ökariyotik 5-carboxylcytosine (5caC) halinde kendi başlarına 13 DNA demetilasyon süreçleri ya da hareket olarak stabil epigenetik işaretler. Baz eksizyon onarım bileşeni, timin DNA glikozilaz (TDG) bağlamak ve DNA 19 den 5FC ve 5caC hem kaldırabilirsiniz gösteri, 20 aktif DNA demetilasyon modifiye 5MC türevleri bir rolü olduğunu iken. 5FC / 5caC transkripsiyonel düzenleme 29 bu markaların potansiyel tutulumu RNA II processivity noktalarının oranını modüle gösteren son kanıtlar. Nedeniyle 5MC oksitlenmiş formları bu potansiyel biyolojik önemi, biyokimyasal ve antikor bazlı tekniklerin bir dizi kendi genomik dağılımı ve küresel içerik 16, 19-24 çalışmak için istihdam edilmiştir.

Verilen t en eminO 16-18, 20, 23, 25-27, farklı dokularda okside 5MC türevlerinin uzamsal dağılımını belirlemek deney önemli hale organlar, farklı hücre tiplerini içermektedir ve tadil edilmiş sitosin bazlar dağılımı dokusu ve hücre tipine özel düzenlenmiş olduğu omurgalı onların biyolojik fonksiyonları açıklanması için gerekli görev. Biyokimyasal ve antikor bazlı yaklaşımların çoğu farklı doku ve hücre tiplerinde 5MC biçimlerinin değiştirilmiş biçimleriyle dağıtımı ile ilgili bir mekansal bilgi sağlamaz. Buna karşılık, immunokimya tabanlı teknikler 5MC 28 ve oksitlenmiş türevleri 20 mekansal dağılımı ve nükleer lokalizasyonu değerlendirmek için hızlı bir araç sağlayabilir. Bu fare genomuna 18 (her 10 6 sitozin 3) bildirilen çok düşük 5FC bolluk (20 her 10 6 sitozin olarak) ve 5caC standart immünokimyanın için önemli bir sorun teşkil etmektedir, söylenir.

İşte,Bu sağlam sağlayan son derece hassas immünokimyasal yöntem ve Memeli beyin dokusundaki sitozinin oksitlenmiş biçimde bir hızlı algılama tarif eder. Bir sinyal amplifikasyon aşaması ile birleştirilmiş peroksidaz-konjuge sekonder antikor ilave ederek, bu yöntem 5FC ve 5caC çok düşük miktarlarda tespit zorlukları aşılmaktadır. Buna ek olarak, bu teknik etkili bu epigenetik işaretlerin biyolojik fonksiyonları durulaştırmada diğer yaklaşımları tamamlayan, soy özel işaretleri ile sitozin birlikte tespit modifiye formları kullanılabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan-ilgili prosedürler Üniversitesi'nin Nottingham etik inceleme kurulu ile uygun olarak yapıldı.

1. immün için uygundur Doku Hazırlama seçilmesi

  1. Daha önce tarif edildiği gibi, 25 vahşi tip CD1 fare embriyoları ve yetişkin beyin dokularının parafine gömülü bölümü oluşturur. % 4 formaldehit (FA) veya yöntemi 25 immün süreyle% 4'lük paraformaldehit (PFA) ile ya tespit edilmiş olan beyin doku bölümleri kullanın.
    NOT: parafin doku kesitlerinin kullanılması antikor etiketleme önce de-ağda gerektirir. 2 ile tedavi, -, DNA'nın denatüre edilmesi için protokol kullanılır 4 M hidroklorik asit (HCI) çoğu antijen alma stratejileri ile uyumlu değildir, Protein ile 5MC oksidasyon türevlerinin eş saptanması için kriyo-mikrotom veya bir kısmından kullanılmasını tavsiye belirteçler.

2. Mum Parafin Gömülü Doku Bölümler < / P>

  1. Çalışan bir sınıf II güvenlik kabininde, ksilen, oda sıcaklığında 10 dakika için 2 defa her biri ile dolu bir Coplin kavanoz parafine gömülü doku kesitleri yıkayın.
    NOT: Eksik parafin giderme tutarsız boyanma yol açabilir gibi taze ksilen kullanmak önemlidir.
  2. de-ağda sonra hızlı bir şekilde art arda 95, 75 yıkanarak doku bölümleri rehidrate, ve oda sıcaklığında 10 dakika her biri% 50 etanol.

3. Sabitleme ve kriyo ve Mikroskobik Bölümler Permeabilization

  1. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca buz gibi soğuk% 4 PFA ya da 4% F ya yerleştirilerek rehidre doku bölümleri düzeltildi.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümler (Fosfat tampon salin) yıkanarak fazla Fiksatif çıkarın.
  3. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (PBS içinde% 0.5 Triton X-100) PBX ile doldurulmuş bir Coplin kavanoza yerleştirilmesiyle doku bölümleri geçirgenliği. PBT (PBS içerisinde% 0.01 Tween 20) ile kısa bir süre bölümleri yıkanarak fazla PBX çıkarın.
Oxi-5MC Türevleri jove_title "> 4. Immün

  1. DNA depürinasyon oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 2 N HCI içinde geçirgen kesitleri yerleştirin.
    NOT: Her ne kadar HCl daha yüksek konsantrasyonlarda (örneğin, 4 H) talebi daha verimli, DNA'nın denatüre edilmesi için, bunlar DAPI ile oksi-MCS eş saptanması için uyumlu değildir.
  2. HCl'yi nötralize etmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) bölümleri yerleştirin. Alternatif olarak, 5 dakika PBS içinde her seksiyonu üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBT bölümleri inkübe edin.
  3. Dikkatle hafifçe slayt sallayarak herhangi bir aşamada tamamen kurumasını doku bölümü izin vermeden doku bölümü çevredeki sıvıyı çıkarın. bölüm dokunmadan bölümü kuşatmak için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın.
    NOT: hidrofobik bariyer kalem doku leke ve birden çok bölüm ayırıcı ile boyanmış izin verebilirsiniz gerekli antikor hacmini azaltırAynı slaytta t antikorlar.
  4. nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi (PBS içinde% 10 sığır serumu albümini) 100 ul bölümleri inkübe edin.
    NOT: Bu adımı atlama modifiye sitozin bazları boyama verimini etkilemez olmaz.
  5. Fare monoklonal anti-5hmC 5,000 seyreltme ve 1: nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi tavşan poliklonal anti-5caC birincil antikor 1000 seyreltme 1 100 ul doku bölümleri inkübe edin. Gerekirse Alternatif olarak, 4 ° C'de bir gece inkübasyona gerçekleştirin.
    NOT: Primer antikor olmadan işlenen Bölümler boyama işlemi için uygun olarak negatif kontroller hizmet edebilir. 12.5 gün pozitif kontrol olarak kullanılabilir 5caC, 5FC ve 5hmC 20 zenginleştirilmiş coitum murin embriyonik beyin kesitlere.
  6. Bir Cop içinde 5 dakika boyunca PBT ile dolu bir Coplin kavanoza her üç kez bölümleri yıkanarak fazla antikorlarıRT'de lin kavanoz.
    NOT: yıkama solüsyonlarının hacmini arttırmak arka plan boyama azaltabilir.
  7. Fazla PBT çıkarın ve gerekirse PBT hidrofobik bariyer zayıflatabilir deterjan ihtiva gibi hidrofobik bariyer kalem ile tekrar bölümleri kuşatmak.
  8. Keçi anti-tavşan HRP ile konjüge edilmiş antikor 400 seyreltme ve 1: çözümü engelleme eşek anti-fare 555 bağlı antikor 400 seyreltme 1 sağlayın.
  9. Nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat Aşama 4.9 ikincil antikor karışımı, 100 ul doku bölümleri inkübe edin.
  10. Oda sıcaklığında her biri 5 dakika PBT ile üç kez dolu bir Coplin kavanoz doku bölümleri yıkayın.
  11. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tiramid sinyal amplifikasyonu tamponunda tiramid 200 seyreltme: 1 100 ul doku bölümleri yerleştirin.
  12. Hemen PBT 5 dakika boyunca slaytlar her üç kez yıkanarak fazla tiramid çözüm kaldırmak.
  13. dikkatliy aşırı PBT çıkarın ve hemen kapak bölümleri bir Montaj Orta bir damla (Malzeme Listesine bakınız).
  14. Yavaşça doku kesitlerinde bir lamel yerleştirin ve hemen oje ile lamel mühür.
  15. Mikroskopik incelemede önce birkaç saat 4 ° C'de doku bölümleri saklayın. (- 40X büyütme 10) 405, 488 ve / veya 555 nm'de floresan mikroskop altında inceleyin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin dokusu bölümlerinde 5hmC dağılımını belirlemek için, özellikle bu işareti ile etkileşir, ancak ticari anti-5hmC antikoru kullanılarak, post-mitotik nöronlar, neun için bir marker ile epigenetik modifikasyon eş algılama gerçekleştirilmez değiştirilmiş formları ile sitosin 20, 25., yetişkin beyinde 5hmC ve 5caC dağılımları immünohistokimyasal analizi, önemli 5hmC boyama NeuN pozitif hücrelerle birlikte lokalize ise NeuN negatif glial hücreler genomik 5hmC (Şekil 1), 20 daha düşük seviyelerde sahip olduğunu ortaya koydu.

Son zamanlarda Tet bağımlı 5MC oksidasyonu nöral kök hücre (NSC'lerde) 20 soy tarifnamede esnasında etkin olduğunu göstermiştir. NSC'lerde immünokimyasal belirlenemeyen olmasına rağmen, 5FC ve 5caC nöronal a doğru NSC'lerde farklılaşma erken aşamalarında belirgin immün sergilemek nd glial soy. Her iki işaretleri geçici erken nöronal ve glial farklılaşma 20 belirteçlerinin görünümü ile eş zamanlı olarak birikir. Bu glial farklılaşmanın başlaması için 3 gün NSC'lerde sabit bir kültür glial markör GFAP ile işareti ko-lekeleme gerçekleştirildi NSCs ayırt 5caC dağılımını belirlemek. NSC'lerde veya erişkin astrositlerin farklı olarak (veriler gösterilmemiştir), bu kültürlerde GFAP eksprese eden hücreler (Şekil 2), 20 nispeten büyük oranda güçlü 5caC sinyal görülmüştür.

figure-results-1
5hmC DAPI (mavi) ile zıt Yetişkin Beyin Doku Neun (kırmızı) ile (yeşil). Bireysel kanalları ve birleştirilmiş görünümü Şekil 1. Eş-immün gösterilmektedir. Ölçek çubukları 25 mikron bulunmaktadır."Blank> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil Glial Farklılaşma Gün 3 de MGK Kültür GFAP ile 5caC 2. Eş-immün. Bireysel kanalları ve birleştirilmiş görünümü gösterilmektedir. Ölçek çubukları 20 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bazı dokularda 5MC oksitleme türevleri 5FC ve 5caC bildirilen düşük bolluk standart İmmünokimya protokolü için önemli sınırlamalar mevcut olsa da, peroksidaz-konjuge sekonder antikor dahil sabit doku ve hücrelerin bu sitozin modifikasyonların saptanmasına olanak (Şekil 2) . Ancak, tiramid çözümü ile optimum inkübasyon süresi sinyal yoğunluğu ve tiramid tabanlı sinyal amplifikasyon süresi arasında doğrusal bir ilişki ayrıntılar için, gözlenen tiramid sinyal amplifikasyon kiti her parti için deneysel optimize edilmelidir Almeida ve ark bakın. 2012 26 . Buna ek olarak, sinyal / arka plan oranı önemli ölçüde aşırı antikorların etkin şekilde çıkarılmasını sağlamak için bir Coplin kavanoza yıkama yaparak arttırılabilir. tiramid çözeltisi ile inkübasyondan sonra, hemen d PBT çözeltisi içinde yıkanarak reaksiyonu durdurmak önemlidirecrease plan boyaması. Bölümler işlem sırasında herhangi bir noktada kurumasına izin vermemek önemlidir.

DNA, depürinasyon etkinliği 37 ° C sıcaklıkta depürinasyon reaksiyonun gerçekleştirilmesi ile geliştirilebilir. Bu çift sarmallı DNA ile özel olarak etkileşim edildiği gibi 4 N HCI kullanılarak yerine 2 birlikte, N, DAPI ile birlikte boyama izin değil, DNA depürinasyon 4 N HCI kullanılarak 5MC biçimlerinin değiştirilmiş biçimleriyle lekelenmesini artırır.

Bu teknik, sitosin bazlar burada tespit modifiye formlarının güçlü bir yarı kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için birlikte, 5MC veya oksitleme türevleri mutlak düzeylerini değerlendirmek için kullanılamaz. Bu nedenle, diğer tamamlayıcı kullanılmasını öneririz ama niceliksel 16, 19 -24 yaklaşır. Memeli genomlarında 5MC oksitleme türevlerinin keşfinden beri çeşitli yaklaşımlar biyolojik rolleri 16, 19-24 çalışma geliştirilmiştir. Bu arayışlara rağmenches 5MC oksidasyon türevlerinin mutlak seviyelerini belirlemede değerli olabilir, onların uzaysal dağılımı 20, 26 ile ilgili bilgi vermemektedir. Biz başarıyla farklı hücre tiplerinde 5MC oksidasyon türevlerinin mekansal dağılımını ve yerelleştirme harita Burada anlatılan yöntemi kullandık gelişmekte olan ve yetişkin beynin 20

Mekansal dağılımı 20 ortaya çıkararak, bu teknik, biyolojik etkileri ve 5MC bu değiştirilmiş türevleri hücresel farklılaşma, geliştirme ve hastalık dahil tespit edilebilir çeşitli biyolojik bağlamlarda 5MC oksitlenmiş türevleri kaderini anlamak için önemli olabilir. Buna ek olarak, burada tarif yöntemi tyrami farklı inkübasyon sürelerindeki (boyama yoğunluğuna orantılı) peroksidaz reaksiyon kinetiği değerlendirerek farklı dokularda 5MC oksitlenmiş türevleri yarı-kantitatif değerlendirmeler verebilirDE 26.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İleri Mikroskopi Ünitesi'ne (Yaşam Bilimleri Okulu, Nottingham Üniversitesi) ve MRC İnsan Üreme Bilimleri Birimi'nin (Edinburgh) Histoloji ekibine, ULB'deki Nörobilim Enstitüsü'ne ve FNRS'ye yardım ve destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Coplin kavanozuCole-ParmerUY-48585-30Camdan yapılmış
KsilenYalnızca Sınıf II güvenlik kabininde kullanın
Fosfat tampon tuzlu su (PBS)Fisher Scientific12821680pH 7.5, kullanımdan önce filtrelenmiş
%4 paraformaldehit (PFA)Sigma AldrichP6148Bir kez yapıldıktan sonra -20 °C'de saklanabilir; Birkaç ay boyunca aliquotes içinde C
% 4 formaldehit  (FA)Sigma AldrichF8775Bir kez yapıldıktan sonra -20 ° C'de saklanabilir; Birkaç ay boyunca aliquotes'ta C
Etanol, susuz denatüre edilmiş, histolojik dereceSigma Aldrich64-17-5PBS'de 95, 75, 50
0.01% PBS'de Tween 20Sigma AldrichP9416PBT
%0.5 Triton X-100 PBSSigma AldrichX100PBX
2 N HClSigma Aldrich71826dikkat son derece toksik
100 mM Tris-HCl PromegaH5121pH, 8.5'e ayarlanmış
hidrofobik bariyer kalemiİmmünohistokimya içinAbcamab2601
Slayt nem odasıBilimsel Cihaz Laboratuvarı197-BL
anti-5mC fare antikoruDiagenodeC15200081monoklonal birincil antikor
Anti-5hmC antikoruAktif Motif39791tavşan poliklonal birincil antikor
Anti-5caC antikoruAktif Motif61225tavşan poliklonal birincil antikoru
Peroksidaz konjuge anti-tavşan ikincil antikoruDakoK1497
555-konjuge keçi anti-fare antikoruMoleküler problarA-11005  ikincil antikor
% 10 BSASigma AldrichA9418Engelleme çözeltisi
22 x 32 mm Cam kapak kızaklarıBDH406/0188/24
Tiramid Sinyal Amplifikasyon SistemiPerkin ElmerNEL741001KTDiğer floroköz konjuge sekonder antikorlar, oksi-5mC 'nin birlikte tespiti için kullanılabilir;
  DAPIVector LabsH-1200
Renksiz oje
tavuk poliklonal anti-GFAP poliklonal antikoruThermo ScientificPA5-185981:400 seyreltme
anti-NeuN fare monoklonal antikoruMerck miliporeMAB377B 1:400 seyreltme
% ile Montaj Ortamı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).">Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
  2. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).">Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
  3. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).">Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
  4. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).">Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
  5. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).">Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  6. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).">Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
  7. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).">Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  8. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).">Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
  9. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).">Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
  10. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).">Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
  11. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).">Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
  12. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).">Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
  13. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).">Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
  14. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).">Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
  15. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).">Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
  16. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).">Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
  17. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).">Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  18. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).">Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
  19. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).">He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
  20. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).">Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
  21. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).">Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
  22. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).">Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
  23. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).">Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367(2010).
  24. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).">Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).
  25. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).">Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
  26. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).">Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
  27. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).">Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).
  28. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).">Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
  29. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).">Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modified Cytosine DetectionImmunohistochemistry ProtocolTyramide Signal Amplification5hmC 5caC AnalysisDNA Methylation StudyEpigenetic Mark DetectionNuclear Localization AnalysisCo detection With MarkersTissue Section ProcessingConfocal Imaging Application

Related Articles