Method Article

Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

DOI:

10.3791/54421

⸱

September 18th, 2016

 ,  ,  , 
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu antijen güdümlü kolit modelinde, kırmızı bir floresan proteini eksprese eden OT-II CD4+ T hücreleri, mononükleer fagositlerde (MP'ler) yeşil bir floresan proteini eksprese eden RAG-/- farelere evlat edinilmiş olarak aktarıldı. Ev sahipleri, bir camgöbeği floresan proteinine (CFP) kaynaşmış ovalbümin proteinini (OVA) eksprese eden Escherichia coli (E.coli) ile sorgulandı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), gastrointestinal sistemi (GIT) etkileyen kronik bir inflamasyondur. Hastalık sırasında yer alan immünolojik mekanizmaları incelemenin en iyi yollarından biri, kolitin T hücresi transfer modelidir. Bu modelde, immün yetmezliği olan fareler (RAG-/- alıcıları), sağlıklı vahşi tip konakçılardan alınan naif CD4 + T hücreleri ile yeniden oluşturulur.

Bu model, bağırsak iltihabının devam ettiği ancak tanımlanmış bir antijene bağlı olmadığı durumlarda, hastalığa ve kronik inflamasyona yol açan en erken immünolojik olayların incelenmesine izin verir. Antijen sunan hücrelerin (APC'ler) hastalık sürecindeki potansiyel rolünü incelemek için, tanımlanmış bir kommensal kaynaklı antijenin kolite yol açtığı antijen güdümlü bir hastalık modeline sahip olmak yararlıdır. Bu nedenle bir antijen güdümlü kolit modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, OVA proteinindeki sadece spesifik epitopları tanıyabilen OT-II CD4 + T hücreleri, CFP-OVA eksprese eden E. coli ile mücadele edilen RAG-/- konakçılara aktarılır. Bu model, lamina propriadaki APC'ler ve T hücreleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bağırsak dış ortama maruz vücudun büyük bir yüzeydir. yerleşik mikropların geniş diziler bağırsak Mikrobiyota (veya mikroflora) oluşturmak için insan bağırsağa kolonize. Bu kadar 100 trilyon mikrobiyal hücrelerin oluştuğu tahmin ve biyoloji 1-3 bilinen en yoğun nüfuslu bakteriyel habitatların biri oluşturmaktadır. GIT bakteriler hayatta ve 4 çarpın bir bağırsak niş kolonize. Buna karşılık, Mikrobiyota genomu 1 kodlanmış almayan ek fonksiyonel özellikleri ile ev sahibi endows. Örneğin Mikrobiyota, epitel hücrelerinin çoğalmasını uyarır kendileri tarafından ev sahipliği üretemez vitamin üretir, metabolizmasını düzenler ve patojenlere

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fareler yetiştirilen ve Ulm Üniversitesi (Ulm, Almanya) hayvan tesisinde spesifik patojen free (SPF) koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri yerel hayvan kullanımı ve bakımı komitesi ve Ulusal Hayvan Refahı Kanunu kurallarına göre yapılmıştır.

PCFP OVA Plazmid 1. İnşaat

  1. Ve plazmıd pCI-OVA (dayanıklı ampisilin) ​​bir şablon olarak kullanılması 42 primerleri Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') ve Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 ile tam boy OVA genini çoğaltmak. Belirli bir OVA-plazmid elde etmek için primerler ve vektör Spel ve Clal ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antijen tahrik kolit modeli, bir E. kurmak coli suşu güçlü yapısal promotör P hiper (Şekil 1A) kontrolü altında ifade edilir CFP gen tavuk ovalbümin proteininin füzyon yapısı için kodlama dizisine kaynaşmış olduğu bir plazmidi içeren inşa edilmiştir. Floresan mikroskopi gösterir Rekombinant E. E. coli pCFP OVA, fakat ana E. E. coli DH10B, CFP (Şekil 1B) ifade eder. E. ür.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

her modelde olduğu gibi, yukarıda tarif edilen antijen odaklı kolit modeli tekniği gerçekleştiren araştırmacı farkında olmalıdır birkaç sorunları ortaya çıkabilir. OT-II hosts / Kırmızı +, CD4 + T CD62L + hücreleri enjekte zaman araştırmacı periton boşluğuna iğneyi çok nazik ve dikkatli olmak gerekir. Aksi takdirde, ölüme yol açabilecek bir fare ya da bir hastalık oluşturmak olmaz hücre deri altına bağırsak yırtılabilir.

Tipik olarak, fareler, hücr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JHN, İsviçre Ulusal Vakfı (SNSF 310030_146290) tarafından desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LB Et Suyu, Miller (Luria-Bertani)Difco244620
Döner SallamaReiss Laborbedarf e. K.Model 3020 GFL
2 mm boşluklu couvette Peqlab Biotechnologie GmbH71-2020
GliserolSigma-AldrichG5516-100ML
Gen Pulser Xcell sistemi BioRad Laboratories GmbH1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Difco244510
AmpisilinSigma-AldrichA9393-5G
SOC OrtaSigma-AldrichS1797-100ML
Yüksek Saf Plazmid İzolasyon KitiRoche11754777001
AgaroseCarl Roth GmbH & Co3810.1
EDTASigma-AldrichE9884-100G
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Buzlu asetik asitSigma-Aldrich537020 ve nbsp;
Jel odası PEQLAB Biotechnology GmbH40-0708
Yükleme BoyasıThermo FisherR0611
GeneRuler 1 kb DNA Merdiveni Thermo FisherSM0312
Etidyum bromür çözeltisiCarl Roth GmbH & Co. KG2218.3
Fotoğraf dokümantasyon sistemi Decon Science Tech GmbHDeVision G 
DNA dizilimi MWG-Biotech GmbH
Fosfat tamponlu salin (PBS)BiochromL182-50
Floresan mikroskobu ZeissHBO 100
Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad Laboratories GmbH1658005
PageRuler Boyalı Protein Merdiveni Fermentas, St. Leon-Rot, Almanya
IstanBlue SolutionExpedeon, Cambridgeshire, Birleşik Krallık
Nitroselüloz membran Macherey-Nagel GmbH & Co. KG741280
Elektro kurutma kağıdı& nbsp;Biometra GmbH846-015-600
Sığır Serum Albüminleri (BSA)Sigma-AldrichA6003-25G
Anti-Ovalbumin antikoru Abcamab181688
Anti-tavşan IgG  HRPSigma-AldrichA0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting SubstratePierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc32132
ForeneAbbott2594.00.00
FBSInvitrogen10500-064
Falcon Hücre SüzgeçleriFischer Scientific 08-771-2
Amonyum klorürSigma-Aldrich254134-5G
Tris BazSigma-Aldrich10708976001
CD4+< / sup> CD62 L + < / sup> T izolasyon kiti ve nbsp;Miltenyi Biotec130-093-227 
MACS LS Sütunları Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MS Sütunları Miltenyi Biotec130-042-201
MidiMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-302
MiniMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Besleme İğnesi 20GSouthPointe Surgical Supply, IncFN-7903
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10Sigma-AldrichHT501128
ParafinSigma-Aldrich1496904
HematoksilenSigma-AldrichH9627
Eozin YSigma-Aldrich230251 
DithiothreitolSigma-AldrichD9779 
Kollajenaz tip VIIISigma-AldrichC-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamıAppliChemA2044, 9050
Sodyum azidSigma-Aldrich438456
Fare BD Fc BlokBD Pharmingen553141
FITC konjuge mAb bağlayıcı V & szlig; 5.1, 5.2 & nbsp;BD Pharmingen553189
APC konjuge mAb bağlayıcı CD4 GK1.5 eBioscience17-0041-83
FACS Calibur BD Biosciences
FCS Express V3 yazılımıDeNovo
Meta taramalı konfokal mikroskop ZeissLSM 710 
Zeiss İş İstasyonuZeissLSM 7
Zeiss ZEM yazılımı Zeissv4.2.0.121
Maxisorp immün plakalar NUNC, Roskilde442404
Streptavidin konjuge alkalin fosfatazJackson İmmüno Araştırmaları016-050-084
Alkalin fosfataz substratı 4-Nitrofenil fosfat disodyum tuzu hekzahidratSigma-Aldrich71768-5G
mAb R4-6A2BD Biosciences551216
mAb XMG1.2 BD Biosciences554410
TECAN mikroplaka-ELISA okuyucuTecan
EasyWin yazılımıTecan
DNase I rekombinant4536282001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (200....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen Driven Colitis ModelT Cell Transfer ModelColonic Lamina PropriaAntigen Presenting CellsOT II CD4 T CellsCFP OVA Expressing E coliFlow Cytometry AnalysisConfocal Microscopy ImagingCell Isolation ProtocolTissue Digestion Method

Related Articles