Yöntem makalesi

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

9.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54426

⸱

27 Eylül 2016

 ,  ,  , 
1Electrical Engineering, National Tsing Hua University

Bu makalede

Özet

İlaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayarak antibiyotik ilaç direncinin karakterizasyonunu sağlayan düşük maliyetli, yapılandırılabilir bir morbidostat tarif ediyoruz. Cihaz, çoğullanmış bir mikroakışkan platform ile entegre edilebilir. Yaklaşım, laboratuvar antibiyotik ilaç direnci çalışmaları için ölçeklendirilebilir.

Özet

Biz antibiyotik direnci evrimsel yolu tanımlamak için düşük maliyetli, yapılandırılabilir morbidostat açıklar. morbidostat sürekli bakteri gelişimini izler ve dinamik onlar ilaç direnci elde etmek için geliştikçe sürekli bakteri meydan okumak için ilaç konsantrasyonunu ayarlayan bakteriyel kültür cihazdır. Cihaz ~ 10 ml çalışma hacmi bulunmaktadır ve tam otomatik ve optik yoğunluk ölçümü ve orta ve ilaç dağıtımı için mikro pompalar ile donatılmıştır. Platformu doğrulamak için, biz 1655 Escherichia coli MG trimetoprim direncinin aşamalı satın ölçüldü ve hücre morfolojisi ve antibiyotik duyarlılıklarının araştırmak için multiplekslenmiş mikroakışkan platformu cihazı entegre edilmiştir. yaklaşım antibiyotik ilaç direncinin laboratuvar çalışmalarına ölçekli yukarı ve metabolik mühendislik ve diğer bakteri kültürü deneylerinde gerilme geliştirmeleri için evrimi adaptif uzatılabilir olabilir.

Giriş

İlk antibiyotik ilaç penisilin tanıtılmasından bu yana, mikrobiyal antibiyotik direnci küresel bir sağlık sorunu 1 dönüşmüştür. Antibiyotik direnci elde edilmesi geriye in vivo olarak incelenebilir karşın, bu deneylerin koşulları genellikle bütün evrim 2 boyunca kontrol edilmez. Alternatif olarak, adaptif laboratuvar evrim bir antibiyotik ilaç 3'ten çevresel streslere veya seçim baskısı altında bir mikrobiyal türlerin moleküler evrim ortaya çıkarabilir. Son zamanlarda, antibiyotik ilaç direncinin çok iyi kontrol evrimsel deneyler antibiyotik ilaç direnci ortaya çıkmasını aydınlatmıştır. Örneğin, Austin'in grup düzgün tasarlanmış mikroakışkan bölmeli bir ortamda 4 hızlı çıkmasını gösterdi. Son zamanlarda geliştirilen morbidostat ilaç seçim baskısı 5,6 altında sistematik mutasyonlar neden olur. morbidostat, mikrobiyal SendaiSürekli neredeyse sabit nüfusu korumak için antibiyotik konsantrasyonunu ayarlar yon cihazı, mikrobiyoloji 7,8 kullanılan dalgalanma testi önemli bir ilerlemedir. dalgalanma testinde, bir antibiyotik ilaç yüksek bir konsantrasyonda enjekte edilir ve kalan mutantlar elenir ve sayılır. Bunun yerine, bir morbidostat içinde mikropların sürekli meydan ve çoklu mutasyonları elde edilir.

Morbidostat kemostat, mikrobiyal nüfusu 9 sulandırarak sırasında sürekli olarak besinleri sağlayarak sabit bir nüfus tutar 1950 yılında Novick'le ve Szliard tarafından icat bir kültür cihazına benzer çalışır. piyasaya sunulmasından bu yana, kemostat gelişmiş ve geliştirilmiştir. Güncel mikroakışkan chemostats nanoliter ve tek hücreli kapasiteleri ulaşmıştır. Bununla birlikte, bu cihazlar, bir çok mutasyon olayları 10,11 ile büyük hücre popülasyonunu gerektiren adaptif evrimi deneyler için uygun değildir. Son zamanlarda, mini~ 10 ml çalışma hacmine sahip chemostats da litre ölçek Biyoreaktörlerde ve mikroakışkan kemostat 12,13 arasındaki boşluğu doldurmak için geliştirilmiştir.

Burada bir antibiyotik ilaç direnci çalışma için tasarım ve düşük maliyet, otomatikleştirilmiş morbidostat sunuyoruz. Önerilen modül minimum donanım gereksinimi ile bir mikrobiyoloji laboratuvarında bir çalkalama inkübatör kullanılabilir. Açık kaynak yazılım aynı zamanda kolayca metabolik mühendislik 3 olarak adaptif evrim özel uygulamalar, için özel olarak tasarlanmıştır. Son olarak, morbidostat antibiyotik duyarlılık testi 14 için multiplekslenmiş mikroakışkan platforma entegre edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Morbidostat Cihaz 1. Montaj ve Ön test

  1. Morbidostat Meclisi
    1. 18 G şırınga iğne ile kültür flakon kapağı 3 delikler. ~ Uzunluğunda 7 cm polietilen boru üç parça kesin. kap polietilen boru bu üç parça yerleştirin.
    2. polidimetilsiloksan (PDMS) karışım için döküm olarak hizmet kapağın kenarını sarmak için bant kullanın. bir kürdan ile elle karıştırma ile bir bileşenin 5 g ve 150 ml'lik plastik bir kap içinde PDMS B bileşeninin 0.5 g karıştırın. 10 ml şırınga içine karışımı yerleştirin.
      1. şırınga ile kap PDMS karışımı dökün. 70 ° C'de bir fırında 8 saat PDMS tedavi etmek için, tüm kapak fırında.
    3. Bir havya ile karbon direnci ile 24 ayar tel ve LED katot LED anot lehimleyin. 24 G teli ile bir 680 Ω karbon direnç lehim. Elektrik bandı kullanarak tel bağlantısı izole.
    4. Yani24 G tel ve 100 kÊ karbon direnci ile photodetector verici ile photodetector kollektör lder. Elektrik bandı kullanarak tel bağlantısı izole.
    5. kültür flakon tutucu ışık yayan diyot yerleştirin. Ek Şekil 2'de devre şeması takip ederek, LED IR (örneğin, bir cep telefonu kamera) tespit edebilen bir dijital fotoğraf makinesi kullanılarak çalıştığından emin olun 5 V güç kaynağı ile diyot ve güç onu yayan ışık bağlayın.
    6. Kültür şişe tutucu fotodetektör yerleştirin. Ek Şekil 2'de devre şeması takip ederek, elektronik kontrol yönüyle voltajı ölçmek için foto detektör dirençlerin her iki tarafına kabloyu 5 V güç kaynağı ile fotodetektör ve güç bağlayın.
    7. Manyetik karıştırıcı birim olarak görev soğutma fanı, şaftı üzerinde bir mıknatıs Tutkal. alignm Notkültür flakon fan ve kültür şişe ve mıknatıs arasındaki boşluk milin ent manyetik karıştırma ünitesinin düzgün fonksiyonu için çok önemlidir.
    8. Mikro-pompalar, orta şişe ve atık şişe silikon tüp karşılık gelen parça içine kültür flakonun polietilen boru her parça bağlayın. 1 saat pompa açın ve toplam hacim pompa hızını belirlemek için kültür şişesine orta şişeden pompalanan ölçün. Tipik pompalama oranı seyreltme oranı D = 0.33 sa -1 kültür flakon hacmini çalışan bir 12 ml karşılık ~ 4 ml / saat, olması gerektiğini unutmayın.
    9. Bir orta ölçekli (34 cm x 34 cm x 43.5 cm) çalkalama inkübatör bütün aksamını yerleştirin.
  2. Morbidostat ön test
    1. 5 V serin fan set güç kaynağı voltajı manyetik karıştırma çubuğu test etmek onun motoru başlatmak için. karıştırma işlemi görsel olarak kontrol edilebilir unutmayın. sürücü gerilimisoğutma fanı motoru tam darbe genişlik modülasyonu (PWM) tarafından kontrol edilir s.
    2. Yabani tip E. bir dizi hazırlanması 600 optik yoğunlukları ile coli örnekleri genellikle 0.07 den kalibrasyonu 0.3 arasında değişen nm. Bir testi E. yerleştirin Kültür şişede coli numune ve fotodetektör voltajı kaydedin.
      1. Yeri ~ 100 plaka okuyucu aynı numunenin ul ve optik yoğunluk kaydedin. kalibrasyon eğrisini çizmek için optik yoğunluk verilerinin karşı fotodetektör voltajını kullanın. tipik optik yoğunluk bir birim değişikliği burada kullanılan önyargı düzeni ile fotodetektör olarak ~ 7.6 V değişiklik karşılık unutmayın.

2. Morbidostat Koşu

  1. Günlük Deneme Başlamadan Önce Hazırlık
    1. girişleri bölümünde olduğu gibi cihaz oluşturmak için iç çapı 1/32 inç ve dış çapı 3/32 inç üç ultra-kimyasala dayanıklı Tygon boru donanımları ile kültür flakon hazırlayın1.1 ve Ek Şekil 1'de.
    2. M9 minimal ortam (% 0.2 glukoz) ve trimetoprim (TMP) ilaç içeren bir ortam hazırlar. 121 ° C'de bir otoklav içinde orta, orta şişe, ilaç orta şişe, atık şişe ve kültür flakon sterilize edin.
      Not: TMP, daha sonra Tablo 1 'de konsantrasyonları ve ortam içeren TMP ilaç otoklava değildir elde etmek için kullanılan bir hazır bir çözümdür.
  2. Morbidostat Koşu
    1. Deneyin ilk gününde, donmuş vahşi tip 1 ml E. çözülme Oda sıcaklığında ve transfer ihtiva eden kültür şişesine hücreler 120 ul, 5 dakika boyunca coli MG1655 hücreler, M9 büyüme ortamı 12 ml. İlk günden sonra, dondurulmuş E. 1 ml çözülme coli 5 dakika ve transfer içeren yeni bir kültür şişesine hücrelerin 120 ul için önceki gün hücreleri ~ M9 büyüme ortamı 12 ml.
    2. çalkalayıcı inkübatör açın ve tempe ayarlamak Resim çalkalanarak 30 ° C'ye kadar süreyle.
    3. mikro-pompa, manyetik bir karıştırma birimi, ve optik yoğunluk ölçümü açarak morbidostat işlemi başlatır.
      NOT: Çalışma sırasında, bir geri besleme eşik algoritması ilaç enjeksiyonu kontrol etmek için kullanılır. ölçülen optik yoğunluk önceden belirlenmiş bir eşiği aştığında, ilaç enjeksiyon pompası açık olacak ve orta pompa kapalı olacaktır. Aksi takdirde, ilaç enjeksiyon pompası devre dışı kalır ve orta pompa açıktır.
    4. mikrobiyal büyüme olmadığından emin olmak için zaman zaman gerilim izleyin.
      Not: Çünkü donma ve çözülme döngüsü, E. coli hücreleri, her gün büyüme sırasında yaklaşık 4 saatlik bir gecikme sergiler.
    5. ~ 23 saat sonra, onun besleme gerilimini kapatarak mikro pompayı durdurun ve kültür şişesini çıkarmak. Kültür şişeye% 15 gliserol ekleyin ve depolama için -80 ° C'de örnek dondurma.
    6. Tekrarlayın 2.2.5 2.2.1 adımları.
le "> 3. Antibiyotik Duyarlılık Ölçümü 96 Kuyu Formatında

NOT: antibiyotik direnci seviyesini belirlemek için 96 kuyu biçiminde bir plaka okuyucu büyüme hızı ölçümü yapın.

  1. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, her gün, dondurulmuş numune çözülme ve • 15 mi M9 ortam ihtiva eden kültür şişesine hücre 15 ul transfer. Onları ~ 0.1 ulaştığı 600 nm'de optik yoğunluk kadar büyümeye izin verin. 1 ml'lik şişeler içine 15 ml ayırın ve Tablo 1 'de gösterildiği gibi, istenen ilaç konsantrasyonları elde etmek için bu adımda TMP ilaç ekleyin.
  2. Plaka okuyucu içinde her kuyuya adım 3.1 ve yerden numune 200 ul almak ve onları 12 saat 5 için büyümeye olanak sağlar. Dalga boyu 600 nm olduğunda optik yoğunluk ölçümü sırasında otomatik olarak kaydedilir.
    NOT: Her bir veri noktası için, üçlü ölçümler kaydedilir ve veri tutarlılığı sağlamak için ortalaması alınır. zamana karşı optik yoğunluk veri olabilir be büyüme oranı elde etmek için kullanılır.
  3. IC 50 elde etmek için ilaç konsantrasyonuna karşı büyüme oranı verilerini çizilir. IC50 büyüme maksimal büyüme oranı 5 yüzde elli olan ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanır unutmayın.

Mikroakışkan Cihazlar 4. Tek Hücre Morfolojisi ve Antibiyotik Duyarlılık Ölçme

  1. Başka yerde 15 açıklandığı gibi PDMS katmanlı yumuşak litografi yoluyla mikroakışkan cihazların imalatı gerçekleştirin.
    1. Kontrol ve akış tabakaları için fotorezist kalıp yapmak fotolitografi kullanın. Kontrol katmanı için, bir çıplak silikon bir kalıp üretmek için negatif ışığa (~ 15 mikron yükseklik) ve pozitif ışığa (~ 8 mm yükseklik) kullandığını unutmayın.
    2. sırasıyla, kontrol tabakası ve akış tabakası, 1: 1 ve 20: 5 çapraz bağlantı oranları PDMS karışımları hazırlayın. kabarcıkları uzaklaştırmak için vakum altında bir desikatör içinde karışımlarını koyun1 saat için.
    3. (TMSC) buhar trimetilklorosilan silikon gofret kontrol katmanı fotorezist kalıpları Açığa. PDMS karışımı döküm ~ 6 mm kalınlığındaki kontrol katman olun (çapraz bağlama oranı 5: 1) denetim katmanı fotorezist kalıp üzerine silikon gofret. Fırında, 1 saat boyunca 80 ° C'de 40 dakika boyunca kontrol katmanı fırında.
    4. (: 1, sıkma devir 60 saniye boyunca 3.000 rpm çapraz bağlama oranı 20 ile) bir akış tabakası fotorezist kalıpta bir PDMS karışımı kaplama Spin akış katman olun. Fırında, 1 saat boyunca 80 ° C'de 30 dakika boyunca akış tabakası fırında.
    5. İstenilen yonga boyutu kontrol tabakası (genellikle 3 cm x 2 cm) kesilir ve elle kontrol tabakası kalkmasına bir jilet kullanın. Akış tabakasının üstüne denetim katmanı yerleştirin ve bir stereomikroskop altında bunları hizalayın. Fırın gece boyunca 80 ° C 'de hizalanmış montaj Cure. Daha sonra, bakiye TMCS çözmek için 5 saat için plastik bir kap içinde deiyonize su, 250 ml montaj emmek.
    6. Daha sonra, 20 G iğne ile giriş delikler ve (PDMS çapraz Oranı 5 bağlama: sıkma devir 2.000 rpm sn 30, 1) boş bir PDMS tabaka ile kaplı bir cam slayt için tüm elastomer bağ 40 sn için hava plazma muamelesi ile 1.2 Torr hava basıncı.
    7. PDMS gelen sitotoksik etkilerini azaltmak için 80 ° C'de 36 saat boyunca yoğun pişirme yürütmek. Bu pişirme adımı bakteriyel hücrelere toksisite en aza indirmek için kritik olduğunu not edin.
  2. Chip Büyüme Deney üzerinde
    1. mikroakışkan cihazın içine yerleştirmeden önce, 1 saat süre ile, 1 saat, M9 ortam için deiyonize su ile yıkayın.
    2. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, her gün, dondurulmuş numune çözülme ve taze M9 ortam ile yeni bir test tüpü inoküle. gece boyunca 37 ° C'de çalkalamalı bir inkübatör içinde örnek yerleştirin.
    3. M9 orta mikrobiyal örnek 10 kat sulandırmak ve 5 psi mikrobiyal örnek kabı baskı ile mikroakışkan cihazın içine yükleyin. Daha sonra, TMP ilaç yükü5 psi ilaç ortamı kap baskı çip halinde araç. 15 dakika mikroakışkan yonga üzerinde iki oda arasında Mikromekanik valfi harekete geçirerek mikrop ve ilaç arasındaki karıştırma yürütün.
    4. ters mikroskop üzerine monte mikroskop inkübatör mikroakışkan çip yerleştirin. CCD kamera ile 8 saat boyunca saat ters mikroskop üzerine monte edilmiş bir büyüme odasında hücre görüntü elde.
    5. Hücre görüntü verileri 18 bir eşik algoritma ile hücre sayıları hesaplamak için özel program komut dosyasını kullanın. hücre sayısı verileri genellikle üzerinde üç mikroakışkan odaları ortalama unutmayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan morbidostat Şekil 1'de şematize edilmiştir. Deneysel evrim, antibiyotik duyarlılık testi ve hücre morfolojisi kontrolü dahil olmak üzere ortak morbidostat işlemleri, bir E. valide edildi (TMP) trimetoprimin maruz coli MG1655 kültürü, yaygın olarak kullanılan bir antibiyotik ilaç 5,6. TMP ilaç direnci çok belirgin adım adım artar uyarır ve mutasyonlar dihidrofolat redüktaz (DHFR) geni etrafında kümelenir. Bu nedenle, TMP...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

düşük maliyetli bileşenleri Düşük ayak izi morbidostat cihaz gösterilmiştir. Cihaz tarafından kayıtlı ilaç direnç seviyesi artar önceki raporlarda 5 ile tutarlıdır. ilaç direnci evrimsel çalışmalar için tasarlanan cihaz, diğer birçok deneylere potansiyel uygulanabilir. İlk olarak, ilaç kaynaklı mutasyon Ayrıntılı bir klinik açıdan önemli antibiyotik büyük bir set için kurulabilir. Örneğin, çoklu ilaç direncinin evrimsel yolun sadece deneyde kullanılan ilaç sayısını artırarak ele alınabilir. Burada bildirilen ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, teorik analiz ve sayısal simülasyonda yararlı tartışmalar ve yardımları için Prof. Sze-Bi Hsu ve Bayan Zhenzhen'e teşekkür eder. Y. T. Y., MOST 103-2220-E-007-026 ve MOST 104-2220-E-007-011 hibe numaraları altında Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan ve 103N2042E1 hibe numaraları altında Ulusal Tsing Hua Üniversitesi'nden fon desteğini kabul etmek ister, 104N2042E1 ve 105N518CE1.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Çevresel Çalkalayıcı İnkübatörBioSanES-20
Arduino Leonardo kartıArduinoLeonardo
680 Ohm Karbon DirençDigikeyÖnyargı direnci LED
100k Ohm için Karbon dirençFototransistör içinDigikey
940 nm ışık yayan diyotParlak LED ElektronikBIR-BM13E4G-2Optik yoğunluk ölçümü
940 nm fototransistörKodenshi ST-2L2BOptik yoğunluk ölçümü
Darlington çift IC ToshibaMouserULN2803APGbu IC sürücüler mikro pompalar ve manyetik karıştırma ünitesi
5 V DC fırçasız fanADDAAD0405LX-G70özellikleri: 5 V besleme gerilimi ve 80  yüksek lisans;
Piezoelektrik mikro pompaCurieJetPS15I-FT-5LBasınç > 3  kPa; Akış hızı >5 ml / dak
Tygon 3350 SaintGobainABW00001ID: 1/32 "OD: 3/32" L: 50' 
Manyetik Karıştırma çubuğuCOWIEkonik şekil karartma: 10   mm x 4 mm
Cam sintilasyon 20 ml flakonDGSPyrex cam 28 mm (çap) x 61 mm (yükseklik)
Kültür flakon tutucuÖzel olarak Poliformaldehitten yapılmıştır ve nbsp;
Cam şişeyi kapatmak için kullanılanSilikonDow CorningSylgald 184
Orta şişeVWR66022-065
Difco M9 minimum tuz 5xBDOrta
Cadamino AsitBDOrta
glikozSigma
Agar BateriolojikOxoidagar plakası için
Luria Bertani ortamı
Ters mikroskopLeica MicrosystemsLeica DMI-LED40X objektif kullanın NA = 0.55
Mikroskop İnkübatörüCanlı Hücre AletiMikroakışkan ölçümü için kullanılanCU-109
Solenoidal valflerPnömadin:S10MM-31-12-3Normalde açık 1.3 Watt 12 Vdc
USB arabirim kartıHobby MühendislikUSBIO24-R Dijital I/O Modülü mikroakışkan ölçümü için
Hava kompresörüRocker ScientificROCKER 440Mikroakışkanlar için basınç kaynağı; Basınç 80 psi
Mikroakışkan kontrol için kullanılan1/8" diken ValuePlastics.com MTLL230-1'e kadar erkek luer kilit bağlantı parçaları
Mikroakışkan kontrol için kullanılanB-1ValuePlastics.com/8" diken - 10-32 dişli bağlantı noktası
10-32 dişli bağlantı noktasına kadar dişi luer kilit bağlantı parçalarıValuePlastics.comMikroakışkan kontrol için kullanılanKFTL-1
NPN darlington transistör 500 mA, 40  V (2N6427)DigiKey.comMikroakışkan kontrol için kullanılan2N6427GOS-ND
10 kOhm, karbon film direnci, mikroakışkan kontrol için kullanılan 0,25 WDigiKey.comP10KBACT-ND
Tantal kondansatör, 10  μ F, 25 V, %10DigiKey.comMikroakışkan kontrol için kullanılan478-1841-ND
Andor CCD kameraAndorZyla 4.2 Plus SCMOSçip üzerinde mikroakışkan görüntüleme için kullanılır
ELISA plaka okuyucu
iki bileşenli Silikon Mikroakışkan çip üretimi için kullanılanMomentiveRTV 615
SU-8 fotorezistMikroakışkan çip üretimi için kullanılanMicrchemSU8 2015
AZ4620 fotorezistClariantAZ 4620mikroakışkan çip üretimi için
kullanılır Mikroakışkan çip üretimi için kullanılanplazma temizleyiciHarrick PlasmaPDC 32G
20 Gauge Şırınga İğnesiBDmikroakışkan çip üretimi için kullanılır
LabcyclerSensoquestLabcyclerPCR
DNA polimerazToyoboKDO PlusPCR amplifikasyonu
TrimetoprimSigma
Plaka okuyucuBiotekSynergy H1 hibrit Antibiyotik Direnç Ölçümü
Bias direnci www.jameco.com mevcut Ayarlama Mikroakışkan ölçüm için kullanılan 1,

Kaynaklar

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451(2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64(2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262(2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. Nat. Protocols. 9, 1713(2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126(2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. Digital image using Matlab processing. , Pearson Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267(2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antibiyotik DirenciBakteriyel EvrimOptik Yo unluk l mMikro pompa ile letimTrimetoprim DirenciEscherichia coliMikroak kan Platformla Konsantrasyon Ayarlamas

İlgili makaleler