Method Article

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran E. E. coli Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

DOI:

10.3791/54434

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Escherichia coli'deki replikasyon çatallarını durdurmak ve çökertmek için bölgeye özgü, geri dönüşümlü in vivo protein bloğu kullanan bir sistemi tarif ediyoruz. Replikasyon bloğunun kurulması floresan mikroskobu ile değerlendirilir ve replikasyon ara ürünlerini görselleştirmek için nötr-nötr 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sıkıca bağlı proteinler çeşitli lezyonlar dahil olmak üzere, DNA üzerindeki engeller, ciddi hücre çoğaltma makine ilerlemesini inhibe edebilir. Bir replizom duraklaması çoğaltma çatal yıkılışına yol açan, kromozomdan, ya kısmen ya da bütünüyle onun ayrışma yol açabilir. Bu çöküşün kurtarma hücresine doğru tam kromozomal çoğaltılması ve daha sonra bölmek için bir zorunluluktur. çoğaltma DNA çatal geri yükleme ve izin gerçekleşecek çöküş meydana geldiğinde, bu nedenle, hücre gelişti çeşitli mekanizmalar yüksek sadakat ile tamamlanacak. Daha önce, bakterilerden bu çoğaltma onarım yolları bilinen siteye lokalize olmama dezavantajına sahiptir, UV hasarı, kullanılarak incelenmiştir. Bu yazıda durdurduklarını ve replikasyon çöküşü fo uyarabilir bir siteye özgü protein bloğu oluşturmak için bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sistemi (FROS) kullanan bir sistemi açıklamaktadırEscherichia coli RKS. replikasyon durumu, flüoresans mikroskopisi ve DNA replikasyon ara maddeleri kullanarak tek bir canlı hücrelerde görselleştirilebilir PROTOKOLLERİN detay 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi ile analiz edilebilir. Replizom bileşenleri (örneğin DnaBts) sıcaklığa duyarlı mutantlar çoğaltma çatal senkron çöküşü uyarılması için sisteme dahil edilebilir. Bundan başka, bu işlemlerde söz konusu rekombinasyon protein ve helikazlar rolleri bu sistem içinde, genetik Knockouts kullanılarak incelenebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA replikasyonu sırasında, replizom ilerlemesini bozan DNA engellerle karşılaşır. DNA lezyonları ve boşluklar da dahil olmak üzere hasar yanı sıra anormal yapılar 1 geçmeden gelen replizom önleyebilir. Son zamanlarda, DNA bağlanmış proteinler Çatal ilerlemesini 2 çoğaltma engel en yaygın kaynağı olduğu bulunmuştur. Bir nükleoprotein bloğu ile replizom karşılaşmasını izleyen olayların bilgisi önceden bilinen bir yerde canlı bir hücrenin kromozomu böyle bir blok ikna etmek yetersizlik ile sınırlı kalmıştır. In vitro analizi kinetik davranışları anlayışımızı arttırmıştır bir nükleoprotein tıkanması 3, hem de replizom kendisinin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FROS ile çoğaltma Engelleme

  1. Çoğaltma Blokaj uyaran
    1. Bir E. taze bir gecede kültür sulandırınız OD 600 Nm = seyreltik kompleks ortam içinde 0.01 bir teto dizi ve pKM1 18 taşıyan E. coli suşu (% 0.1 tripton,% 0.05 maya özü,% 0.1 NaCl, 0.17 M KH 2 PO 4, 0.72 MK 2 HPO 4) antibiyotik gerektiğinde seçimi için.
      Not: Bu sistemle uyumlu değil gibi seçim için tetrasiklin katmayın. Gerekli örnek başına 10 ml eşdeğer kültür hacmini olun. Örneğin, Şekil 1 'de deney dizaynı kültür hacmi 60 ml'dir.
    2. OD 600 nm = 0.05-0.1 kadar ç....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FROS canlı hücreler 12,18 görselleştirilebilir çoğaltma ara maddeleri sağlayan uyarılabilir, sahaya özel nükleoprotein bloktur. Hücreler numune için genel bir deney tasarımı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Genetik temelinde numune alma ve varyasyonlar ve zamanlaması, böyle bir bloğun onarım çalışmaları için çok yönlü bir sistem tercih. Şematik bir önceki 18 kullanılan bu tür dnaB TS ve TS dnaC olarak, sıcaklığa duyarlı mutantlar, bu s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromozom duplikasyonu sırasında, replikasyon mekanizması ilerlemesini engelleyen çeşitli engellerle karşılaşacaktır. Tek orijinli kromozomun tamamının kopyalanmasını sağlamak için, bakteriler DNA'nın onarımı için çok sayıda yola sahiptir ve bu da daha sonra replizomun yeniden yüklenmesini sağlar20,21. Lezyonlar, tek sarmallı kırılmalar, çift sarmallı kırılmalar ve DNA'ya sıkıca bağlı proteinlerin her biri, bu yollarda önemli bir örtüşme olması muhtemel olsa da, özel bir yol kullanılarak ele alınabilir. Canlı h.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi [DP11010246] tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TriptonSigma-Aldrich16922Büyüme ortamı bileşeni
Sodyum KlorürVWR27810.364Büyüme ortamı bileşeni
Maya özütüSigma-Aldrich92144Büyüme ortamı bileşeni
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichP9791Büyüme ortamı bileşeni; Potasyum tampon bileşeni
Potasyum fosfat dibazikSigma-AldrichP3786Büyüme ortamı bileşeni; Potasyum tampon bileşeni
L-ArabinozSigma-AldrichA3256TetR-YFP üretiminin indüksiyonu için
Anhidrotetrasiklin hidroklorürSigma-Aldrich37919Replikasyon bloackage'ının serbest bırakılması
Axioskop 2 Floresan mikroskobuZeiss452310Hücrelerin görselleştirilmesi
eYFP filtre setiChroma Technology41028YFP
CCD kameraHamamatsuOrca-AG'ninMetaMorph hücrelerinin görselleştirilmesi
  Yazılım (Moleküler Cihazlar)SDR Scientific31282Sürüm 7.8.0.0 Bu makalenin hazırlanmasında kullanılan
AgaroseBiolineBIO-41025Agaroz tapaları ve jel elektroforezi için
Orijinal Cam Su İtici (Rain-X)AutobarnDIO1470Agaroz tapa üretimi için
TRISVWRVWRC103157PTE, TBE tampon bileşeni
Etilen diamintetraasetik asitAjax FinechemAJA1800.5 M EDTA disodyum tuzu çözeltisi, NaOH ile pH 8.0'a ayarlanmıştır.
Sodyum azidSigma-AldrichS2002Bakteriyostatik ajan
Hidroklorik asitSigma-Aldrich258148TE tampon bileşeni
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750Hücre lizis tampon bileşeni
N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu (Sarkosyl)Sigma-AldrichL5125Hücre lizisi ve ESP tampon bileşeni
Rnase ASigma-AldrichR6513Hücre lizis tampon bileşeni
LizozimAmresco6300Hücre lizis tampon bileşeni
Proteinaz KAmrescoAM0706ESP tampon bileşeni
Alt Hücre Modeli 192 HücreBioRad1704507Elektroforez sistemi
UV transilluminator 2000BioRad1708110DNA'nın
GörselleştirilmesiEtidyum BromürBioRad1610433DNA'nın Görselleştirilmesi
Borik asitVWRPROL20185.360TBE bileşeni
Hybond-XL naylon memrbaneAmershamRPN203SZeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) de kullanılabilir
3MM Whatman kromatografi kağıdıGE Healthcare Yaşam Bilimleri3030690Güney lekeleme
HL-2000 HybrilinkerUVP95-0031-01/02DNA'nın çapraz bağlanması ve hibridizasyon
Somon sperminden deoksiribonükleik asitSigma-Aldrich31149Hibridizasyon tampon bileşeni
Sodyum hidroksitSigma-AldrichS5881Denatürasyon tamponu bileşeni
Trisodyum sitrat dihidratVWRPROL27833.363Transfer tamponu
Sodyum dodesil sülfat (SDS)Amresco227Yıkama tamponu bileşeni
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA7906Hibridizasyon tamponu bileşeni
Rastgele Heksamer PrimerleriBiolineBIO-38028
Klenow parçasıNew England BioLabsM0212L
dNTP SetiBiolineBIO-39025
Adenozin 5'-trifosfat-< sup>32P-ATPPerkinElmerBLU502A
Depolama Fosfor EkranGE Sağlık Yaşam BilimleriGEHE28-9564-76BAS-IP MS 3543 E çok amaçlı standart 35 cm x 43 cm ekran
Typhoon FLA 7000GE Sağlık Yaşam Bilimleri28-9558-09şişesinin görselleştirilmesi
UVP07-0194-0235 mm x 300 mm
görselleştirilmesi Leke Hibridizasyon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Repressor Operator SystemSite Specific Replication BlockageEscherichia coli Replication ForkFluorescence Microscopy VisualizationTwo Dimensional Gel ElectrophoresisTemperature Sensitive MutantsGenetic Knockout AnalysisDNA Replication IntermediatesAgarose Plug PreparationSouthern Hybridization Detection

Related Articles