Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ferrik klorit indüklenen fare tromboz modellerinde

22.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54479

⸱

5 Eylül 2016

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Bu makalede

Özet

Biz trombüsler oluşumunu tıkayıcı zaman izlemek için intravital mikroskopi kullanılarak etkin bir şekilde karakterize bir rafine demir klorür (FeCl3) karotis ve mezenterik arter üzerinde indüklenen trombozu modelleri prosedürü yanı sıra damar, rapor.

Özet

Arteriyel tromboz (kan pıhtısı), ateroskleroz, diyabet, obezite, kanser ve kronik otoimmün romatolojik hastalıklar dahil olmak üzere kronik inflamasyonla ilişkili birçok sistemik hastalığın yaygın bir komplikasyonudur. Trombüsler çoğu kalp krizi, felç ve ekstremite kaybının nedenidir ve trombozu son derece önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirir. Bu trombüsler uygun olmayan trombosit aktivasyonu ve müteakip pıhtılaşmadan kaynaklandığından, bu sistemlerin terapötik olarak hedeflenmesi daha güvenli tedaviler geliştirmek için önemli klinik öneme sahiptir. Hemostatik sistemin karmaşıklığı nedeniyle, in vitro deneyler kan-damar duvarı etkileşimlerini çoğaltamaz; Bu nedenle, trombüs oluşumunun patolojik mekanizmalarını anlamak için in vivo çalışmalar kritik öneme sahiptir. Bu amaçla, farelerde çeşitli tromboz modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında, ferrik klorür (FeCl3) ile indüklenen vasküler hasar, aseptik kapalı vasküler sistem bağlamında trombosit aktivasyonunu ve agregasyonunu bildiren yaygın olarak kullanılan bir tıkayıcı tromboz modelidir. Bu model, hem antikoagülan hem de anti-trombosit ilaçlarına basit ve duyarlı olan redoks kaynaklı endotel hücre hasarına dayanmaktadır. Kan akışını tıkayan bir trombüsün gelişimi için gereken süre, trombotik hastalıklarla ilgili vasküler hasar, trombosit aktivasyonu ve agregasyonunun kantitatif bir ölçüsünü verir. Bu FeCl3 ile indüklenen vasküler tromboz modelini önemli ölçüde geliştirdik, bu da verileri minimum varyasyonla yüksek oranda tekrarlanabilir hale getiriyor. Burada modeli açıklıyoruz ve bu modelin tromboz araştırmalarında faydasını gösteren çeşitli deney düzeneklerinden elde edilen temsili verileri sunuyoruz.

Giriş

Arter trombozu (kan pıhtısı) ateroskleroz, diyabet, obezite, kanser ve kronik otoimmün romatolojik bozukluklar gibi kronik inflamasyon ile ilişkili birçok sistemik hastalığın sık görülen bir komplikasyondur. uygunsuz trombosit aktivasyonu, agregasyonu ve sonraki coagulatory mekanizmalarından arteriyel dolaşım kök meydana ve trombüs kalp krizi, felç ve ekstremite kaybına neden oluyor. Damar duvarı damar duvarındaki kan hücreleri, hormonlar ve sitokinler yanı sıra antioksidan proteinlerin ifadesini dolaşan, birden fazla hücre tiplerini içerir ve kayma gerilmesi dahil dışsal faktörlerin çok sayıda etkilenir karmaşık bir sistemdir. In vitro deneyler çoğaltma yapamaz Bu kompleks bir ortam ve bu nedenle, hayvan modelleri kullanarak in vivo çalışmalar, trombotik hastalıklarda yer alan mekanizmaların daha iyi anlaşılması izin vermek için çok önemlidir.

Fareler sim sahip olduğu gösterilmiştirtromboz, ateroskleroz, enflamasyon ve diyabet 1,2 açısından insanlara Ilar mekanizmaları. Ayrıca, transjenik ve knockout farelerde kompleks fizyolojik veya patolojik bir ortamda belirli bir gen ürünlerinin işlevi test etmek için oluşturulabilir. Bu tür çalışmalar, insan patoloji taklit ve yeni yollar ve tedavilerin, keşif ile ilgili önemli mekanistik bilgi vermek yanı sıra tromboz uyuşturucu etkileri karakterize önemli ayrıntıları sağlayabilir.

Patolojik arteriyel trombüs subendotelyal matrise 3,4 katman yaralanma veya disfonksiyon ve kan akışının pozlama endotel nedeniyle oluşur. Çeşitli tromboz modelleri, mekanik yaralanma, photoreactive bileşik Rose Bengal tabanlı oksidatif hasarı ve lazer yaralanması 5 olarak bu endotel hasarına neden geliştirilmiştir. Bu spektrumda, Demir klorür (FeCl3) vasküler yaralanma tromboz yaygın olarak kullanılan modeldir indüklenen. Bu reaktif olduğundadamarların dış alana uygulanabilir trombositleri ve pıhtılaşma kademeli dizisinin parçalarına dolaşımdaki endotel hücre koruma kaybı, vasküler hücreler 6-8 oksidatif hasarı neden olur. FeCl3 modeli basit ve hem antikoagülan ve anti-trombosit ilaçlara duyarlı olduğunu ve fareler, sıçan, kobay ve tavşan 6-15 yılında karotis ve femoral arterler, şahdamarından ve mezenterik ve kremasterik arteriyollerde ve venüllerden üzerinde yapılmıştır.

Bu modelde biri ölçülebilir bir parametre Doppler debimetre ile veya Intravital mikroskopi 6,7,9 doğrudan gözlem altında kan akımının kesilmesi olarak ölçülen damar tıkanıklığı, tamamlamak için yaralanma geçen süredir. 5 ila 30 dakika arasında zaman bir dizi işaret, C57BL6 farelerine 7-10,16 farklı çalışmalarında rapor edildiği FeCl3 konsantrasyonları, anestezi cerrahi teknikler, fare yaş, genomik arka, b, ölçüm yönteminin türleriLood akışı ve diğer çevresel değişkenler, bu modelde anlamlı bir etkiye sahiptir. Bu geniş değişkenlik zor farklı araştırma gruplarından çalışmaları karşılaştırmak ve ince farklılıkların tespiti zor hale getirebilir yapar.

Böyle bir değişkenliğe en aza indirmek ve in vivo model sisteminde bir homojen tekrarlanabilir kurmak için bir vizyon ile, minimal değişiklik 6-10,16-19 ile son derece tekrarlanabilir veri yapar FeCl3 indüklenen karotid arter modeli rafine. Bu yazıda tarif ve becerilerini paylaşmak ve bu model yararlanabilir birkaç temsilci deneysel rapor örnekleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler ve hayvanların manipülasyonlar Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi İnsani Bakım Politika ve Hayvanların Kullanımı ve Bakımı NIH Kılavuzu ve uygun Cleveland Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuar Hayvanlarının kullanımı.

1. Hazırlıklar:

  1. Etiketleme plateletler için floresan boya
    1. tuzlu su içinde, rodamin 6G çözeltisi, 0.5 mg / ml hazırlamak ve 0.22 um filtre ile çözelti sterilize edin.
  2. FeCl3 Çözüm
    1. % 30 FeCl 3 taze bir stok solüsyonu olun saf su (Susuz, 1.85 M eşittir), ve 0.45 um filtresi ile filtre. 5 ml taze FeCI istenen konsantrasyonda 3 çözeltisi [örneğin,% 2.5 (0.154 M),% 5 (0.308 M), 7.5% (0.463 M),% 10 (0.617 M) ile% 12.5 (0.771 M)] ile hazırlayın su i ile% 30 FeCl3 çözeltisi seyreltilmesina 6 cm doku kültürü çanak ve kapağı tutmak kapattı.
      NOT: kültür çanak kullanmak daha kolay gibi 1.5 ml mikrosantrifüj tüp olarak, dar bir kaptan onu almak için daha FeCl3 çözeltisi ile doymuş filtre kağıdı almak için yapar. FeCl3 son derece tehlikelidir ve böyle giyen eldiven vb laboratuvar önlüğü, Kişisel Koruyucu Ekipman olarak önlemler, her zaman alınması gerektiğini söyledi.
  3. filtre Kağıtları
    1. 1 mm x 2 mm boyutu filtre kağıdı kesin. Aynı çanak FeCl3 çözeltisi içinde kesilmiş filtre kağıdı yeterli parçalarını bekletin.
  4. Papaverin hidroklorür çözeltisi
    1. su içinde, papaverin hidroklorür çözeltisi (25 mg / ml) hazırlayın ve 0.22 um filtre ile çözelti sterilize edin.
  5. agaroz Jel
    1. , 6-yuvalı doku kültürü plakasında,% 2 agaroz PBS içinde jel veya tuzlu su hazırlama yaklaşık 1 cm kalınlıkta ve Cı~ 3 cm çapında yarım daire için ut.

2. FeCl3 Kaynaklı Karotis Arter Yaralanması Tromboz Modeli

  1. Tromboz Model Cerrahi İşlemleri
    1. 12 haftalık C57BL6 fareleri (ya da diğer suşlar olarak gerekli) - 8 kullanın. intraperitonal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile fareler anestezi. ayak sıkıştırarak anestezi derinliği onaylayın.
      NOT: ketamin / xylazine Bu miktar en az 1 saat boyunca stabil anestezi hayvan ve hiç ağrı (kısma ayak yanıt) tutmak için yeterlidir.
    2. küçük bir hayvan elektrikli kesme makinesi ile boyun ve üst göğüs kürk çıkarın. Depilasyon krem ​​gerekli değildir. anestezi sırasında kurumasını önlemek için gözleri nötr petrol göz merhemi sürün.
    3. 15 cm doku kültürü plaka kapağı üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin. hin sabitlemek için uzun bir bant (~ 10 cm) kullanınD bacaklarda ve alt gövde, ve ön ayakları korumak için küçük bir bant (2 cm x 0,5 cm) iki adettir. , Kesici dişlerin etrafına sarmak için 4-0 sütür kullanın fare boyun düz (Şekil 2) tutmak için kapağa sütür iki ucu bantlayın.
    4. cerrahi ışık kaynağı altında operatöre doğru fare kafası ile plaka koyun.
    5. Alkol ped ile cerrahi siteyi sterilize edin. Cildi tutmak için Mikro-Adson Forseps kullanın ve küçük bir kesi yapmak için bir cerrahi makas kullanın (2-3 mm).
    6. forseps ile kesi cilt tutun ve çene kesi içine kapalı cerrahi makas yerleştirin. deri altı tabakadan cildi serbest makas açın manubrium veya çene doğru subkutan makas itin ve.
    7. Hyoid kemik düzeyinde (Şekil 3A ve 3B) için manubrium bir orta hat kesi yapmak için cerrahi makas ile cilt kesin. Açık açık ince fasya (noktalı çizgi içinde teşrih ince hemostatla submaksiller bezleri ve Graefe forseps (Şekil 3B ve 3C arasında Şekil 3B); mavi oklar).
      Not: manubrium (Şekil 3C'de siyah ok) ve trakea (Şekil 3C'de T) adımından sonra görülecektir.
    8. Serbest hemostatı çeneleri açın (Şekil 3C sarı noktalı çizgi) 02:00 konumuna doğru fasya altında hemostat eklemek, yumuşak doku ve Graefe forseps ile manubrium sağında görülen cilt tutun çevreleyen dokudan juguler ven.
    9. Sağ juguler ven (Şekil 3B, ok) ortaya çıkarmak için cerrahi makas ile 02:00 pozisyonunda (Şekil 3C) doğru fasya, yumuşak doku ve cildi kesin.
    10. Daha sonra 22 G iğne ve değişim ile 1 ml şırınga kullanarak 300 ul rodamin 6G çözümü - yaklaşık 200 Beraberliko 30 G iğne.
      NOT: Bu ince ucu hasardan 30 G iğne korur. Doğrudan ucu zarar vermez 30 G iğne ile rodamin 6G çözüm çizim; Ancak enjeksiyon zor hale getirebilir hasara neden olur yanlışlıkla konteyner duvar dokunmadan.
    11. yavaş yavaş rodamin 6G çözüm iterek 30 G iğne yıkayın, hiçbir hava kabarcığı şırınga veya iğne kalır emin olun. Enjeksiyon için 100 ul rodamin 6G çözüm tutun.
    12. Bend 2 - şah damarından çok derin iğne takmadan önlemek ve daha kolay (Şekil 3D) kontrollü enjeksiyon yapar olacaktır iğne tutucu ile 90 ° açı, iğne 3 mm uç.
    13. Etiket trombositlerin sağ juguler ven içine rodamin 6G çözüm enjekte. injection.Af sırasında başka bir eliyle Graefe forseps ile tek elle şırınga ve iğneyi tutun, şırınga stabilize ve pozisyonda iğne tutmak içinter enjeksiyonu, kanamayı önlemek için Graefe forseps ile enjeksiyon bölgesini kelepçe.
    14. hemostatı çeneleri açın ve enjeksiyon yerinde damar duvarını kelepçe Graefe forseps altında yerleştirin ve sonra bir 6-0 sütür ile enjeksiyon bölgesini Arter.
      Not: Adım 2.1.15 bir alternatif olarak, kanamayı durdurmak 2 dakika boyunca bir parmak ile enjeksiyon yerinde basınç uygulamak; Bununla birlikte, bu yöntem, bundan başka neden enjeksiyon yerinde pıhtı kaza kaldırılırsa, kanama riskine sahiptir.
    15. Açıkça hemostat ve Graefe forseps ile sol alt çene bezi etrafındaki yumuşak doku ve fasya teşrih ve sol sternokleidomastoid kası (Şekil 3E mavi ok) açığa çıkarmak için 07:00 pozisyonuna (Şekil 3E) doğru bezi çekin.
    16. Açık açık bıraktı sternokleidomastoid kas ve omohyoid kas veya sternohy arasındaki fasya (Şekil 3E, noktalı çizgi) teşrihhemostatla trakea sol sitesine bulunan oid kas (Şekil 3E, yeşil ok).
    17. Sternokleidomastoid kasının (Şekil 3E mavi ok) orta altında 6-0 ipek sütür (yaklaşık 15 cm uzunluğunda) ile bir iğne geçirin birlikte sütür iki ucu koymak ve 10:00 pozisyonunda doğru yanal sütür çekin .
      Not: Bu yordam sternokleidomastoid kasının dışında bulunan, sol juguler ven, bir zarar gelmemesi için dikkatle yapılmalıdır.
    18. Açık açık ince sternohyoid kas ve / veya sternokleidomastoid kas çekerek sonra karotid arter (CA) (Şekil 3F ok) açığa omohyoid kas ayırın. gerektiğinde sternohyoid kas ve / veya omohyoid kas kesin. CA'yı dokunmadan CA yumuşak dokuyu ayırmak için hemostat kullanın
      NOT: CA vagus siniri eşlik ediyor, beyaz yapı görülen Şekil 3G (yeşil ok) ve ince sternohyoid kas ve / veya (Şekil 3F sarı noktalı çizgiler arasında) omohyoid kasın altında çoğu durumda.
    19. vagus siniri ve CA'yı kaçınarak CA etrafında yanal fasya almak için bir ince uçlu forseps kullanın CA ve vagus siniri arasındaki fasya bir delik yumruk başka ince uçlu forseps kullanın.
    20. delikten kanca geçirin ve hafifçe CA kaldırın ve ardından CA altında ince uçlu forseps yerleştirin adventisyal yumuşak doku şerit CA boyunca zıt yönlerde kanca ve forseps taşıyın. Çevreleyen dokudan CA (Şekil 3H, mavi ok) Serbest en azından ~ 5 mm uzunluğunda.
    21. Düz bir siyah plastik kahve karıştırıcı sonuna basın, arka plan floresan engellemek için, 3 mm parçası haline kahve karıştırıcı kesen ve ardından "U" şeklinde plastik (Şekil 3H, yeşil iki parça almak için kat kenarları boyunca uzunlamasına kesilmiş ) ok.
    22. Serum fizyolojik ile bu "U" şeklinde plastik bir parça durulayın ve forseps ile tutun ve yavaşça kanca (Şekil 3H, yeşil ok) ile CA kaldırırken CA altına yerleştirin. Hemen CA'yı kurumasını önlemek için tuzlu su 2-3 damla uygulamak
  2. Gerçek zamanlı Kaydı Video
    1. 10X su mercek altında uygun bir konumda mikroskop sahne ve yere birlikte fare ve plaka kapağı aktarın. 10X objektif ve tuzlu su ile CA arasındaki boşluğu doldurmak.
    2. Dijital video kayıt yazılımı uygulamasını başlatın ve yeni bir dosya başlatmak ve buna göre adlandırın. Normal damar görüntüleri kaydetmek ve video kayıt durduğunda kare numarasını yazınız.
      NOT: Kayıt için bilgisayarda bir video kayıt yazılımı Referans. Biz dijital video kayıt yazılımı kullanmak ve aşağıdaki açıklamaları bu uygulama dayanmaktadır.
      NOT: Mekanik tra yanauma endotel zarar ve trombüs oluşumu 20 yol açabilir, FeCl3 yaralanma öncesi damar duvarına cerrahi yaralanma olduğunu doğrulamak için gereklidir. FeCl3 indüklenen yaralanma etkisini bir bariyer oluşturur ve zayıflatmak olabilir CA etrafında kalan doku, olduğunu doğrulamak için de gereklidir. kolay, daha sonra geçen süreleri göre videoları analiz yapacak kayıtların kare sayısını yazın.
    3. 10X objektif dışarı plaka kapağı fareyi hareket ettirin. ince ve ince ucu yapmak ve dikkatle CA etrafında tuzlu leke kullanmak için bir kağıt havlu bir köşesini katlayın cerrahi alanındaki diğer yerlerde yanı sıra (CA dokunmaktan kaçının). Bu, kullanılan FeCl3 çözeltisinin seyreltilmesinden kaçınmak önemlidir.
    4. Ince bir uç forseps kullanın ve FeCl3 çözeltisi ile doymuş filtre kağıdı bir parça alıp CA doğrudan yerleştirin ve 1 dakika boyunca sahada tutmak.
      NOT: To kan ve hasat doğru veri yardım görselleştirme, yakın maruz CA (Şekil 3I) distal ucuna filtre kağıdı yerleştirin ve geç kan akışını gözlemlemek için (Şekil 3I yeşil ok) proksimal yerinde kısa bir segmenti bırakın faz (aşağıya bakınız).
    5. Filtre kağıdı çıkarın (bu zaman noktası başlangıcı olarak tanımlanan "yaralanma sonrası") ve tuzlu su (en az 2 mi) ile CA yıkayın.
    6. geri 10X objektif plaka kapak ile fare koymak; gemi gözlemlemek ve video görüntüleri başlar. Kaydın ilk dakika sonunda video çerçeve numarasını yazın.
      Not: Trombüs formasyonu bilgisayar ekranında ya da mikroskop altında gerçek zamanlı video görüntüleri görülmektedir flüoresan trombositler birikimi ile tanımlanır. Tutanak video görüntüleri hemen mikroskop altında geri fare koyarak sonra. f çıkardıktan sonra ilk dakika sonuna kadar kayıt tutmakilter kağıdı. Yaralanma hakkında bilgi edinmek için proksimal sitelerine uzak gelen tüm gemi gözlemlemek ve sonra ilgi alanı odaklanmak daha görüntüleme için (genellikle yaralı bölgenin merkezidir).
    7. 10 saniye ilk 10 dakika deneyin sonuna kadar (örneğin, 3:05 ile 02:55) ve daha sonra 10 sn her dakika için her dakika için rekor video görüntüleri. Her bir kayıt durduğunda çerçeve numaralarını yazın.
      NOT: Modelin bitiş noktaları şunlardır: 1) kan akımı> 30 sn sona erdiğinde; veya 2) tıkanıklığı yaralanma sonrası 30 dakika içinde görülen değilse. Bu durumda, istatistiksel analiz için 30 dakika kullanımı. başında 10 msn gibi video kaydının Pozlama Saati ayarlayın, böylece trombüs üzerinde kan akışını gözlemlemek kolay olacaktır. trombüs büyük olur ve floresan kameranın sensörü doyurur, bu trombüs üzerinde kan akışını tespit etmek zorlaşır. Bu sorunu çözmek için, görüntüleme ce hareketkan akımı hala net bir şekilde görülebilir proksimal yaralanmamış sitesinden (Şekil 3I, yeşil ok) nter. Proksimal un yaralı sitede odaklanarak zaman kan akımı daha net görülebilir, böylece biz de, 15 veya 20 msn Açığa Zaman artırmak. kan akışı duracak zaman, çok sayıda büyük hücreler (lökositler) trombüsün proksimal yerinde damar duvarında rulo başlar. Büyük hücrelerin görünümü sonra 3 dakika - Akış genellikle 2 içinde durur. değişti ise kayıt kağıda Zaman Açığa yazın. normal doğal suş C57BL6 fare kullanılması durumunda, genellikle, deneyin sonuna kadar anestezi yaklaşık 30 dakika sürer.
      DİKKAT NOT: doğru veri vermeyecektir kan akımı kesilmesi, işareti olarak beyaz toplanan trombosit pıhtı kullanmayın ve maruz kalma süresi etkilenir. beyaz pıhtı (bkz temsili video 1) durdurdu kan akışını anlamına gelmez damar lümeni kaplı.
    8. Deney sonunda, hiçbir nefes ve kalp atışı onayladıktan sonra servikal dislokasyon tarafından takip aşırı doz ketamin / ksilazin (200/20 mg / Kg) kullanarak fareler euthanize.

3. FeCl3 Kaynaklı Mezenterik Arter / Ven Trombozu Modeli

  1. Bölüm 2.1.1 belirtildiği gibi 12 haftalık C57BL6 fareler - 8 uyutmak. anestezi sırasında kurumasını önlemek için gözleri veteriner merhem sürün.
  2. intraperitoneal bağırsak peristalsis inhibe Papaverin çözeltisi (toplam 0.4 mg / fare) enjekte edilir.
  3. Bir hayvan elektrikli kesme makinesi ile boyun ve karın kürk çıkarın. Depilasyon krem ​​gerekli değildir.
  4. 15 cm doku kültürü plaka kapağı üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin. Tüm bacakları sabitlemek için küçük bir bant (2 cm x 0,5 cm) dört adet kullanın. Kesici etrafında sarmak için 4 -0 sütür kullanın, boyun düz (Şekil 2) tutmak için kapağa sütür iki ucu bantlayın.
  5. prosedürleri 2.1.4 izleyin -2.1.15 etiket trombositlerin için rodamin 6G enjeksiyonu için juguler ven ortaya çıkarmak.
  6. Cerrahi makas (Şekil 4A) kullanarak karın daha düşük kılıç şeklinde deri yoluyla orta hat kesi gerçekleştirin. (Olarak da adlandırılır linea alba, Şekil 4A, ok) açıktır ve herhangi bir kan damarları vardır Graefe forseps ile, yaklaşık 2 asansör orta periton Pick up - kesme sınırının altında hiçbir bağırsak onaylamak, 3 mm yüksekliğinde ve açık periton kesip uzunlamasına ince makas (Şekil 4B) ile.
  7. Sağ lateral pozisyonda fareler yeniden sabitleyin. Karın yakın yarım daire agaroz jel yerleştirin ve yavaşça bağırsak exteriorize ve Graefe forseps (Şekil 4C) ile jel üstünde yayıldı. Tromboz deney (Şekil 4C, ok) için ikinci şubesi kullanın.
    NOT: bağırsakları exteriorize yardımcı hemostat veya Micro-Adson forseps kullanın. zarar kaçınınbağırsak ve damar.
  8. bağırsak ve geminin nem tutmak için 6 damla serum fizyolojik - 5 yerleştirin. Mikroskop sahneye birlikte plaka kapaklı fare aktarın ve 10X kuru mercek altında uygun konuma yerleştirin.
    NOT: jejunoileal membran tuzlu su çözeltisi tutamayacak, çünkü kuru bir lensi kullanın. nemli tutmak maruz kalan dokularda tuzlu su çözeltisi damla emin olun.
  9. tedaviden önce mezenterik arter ve ven çevresinde tuzlu kurulayın.
  10. % 12.5 FeCl3 çözeltisi ile doymuş filtre kağıdı bir parça alıp 1 dakika (Şekil 4D) için mezenterik arter ve ven doğrudan yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın. Filtre kağıdı çıkarın ve tuzlu su ile yaralanan mezenterik arter ve ven durulayın (en az 2 ml) (bu zaman noktası "yaralanma sonrası" başlangıcı olarak tanımlanır).
  11. geri 10X kuru mercek altında plaka kapak ile fare koymak; gemileri gözlemlemek ve rec başlar2.2'de belirtildiği gibi Ord video görüntüleri).
    NOT: Bu deneyin bitiş noktaları şunlardır: 1) kan akımı> 30 sn sona erdiğinde; ya da 2) tıkanması yaralanma sonrası 30 dakika içinde görülür değilse, ve bu durumda, istatistiksel analiz için 30 dakika kullanın.
  12. Deney sonunda, hiçbir nefes ve kalp atışı teyit sonra servikal dislokasyon tarafından takip aşırı doz ketamin / ksilazin (200/20 mg / Kg) kullanarak fareler euthanize.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Karotis Arter Trombozu Modeli
C57BL6 kökenli farelerde, biz bir başlangıç ​​noktası olarak 1 dakika boyunca gemi tedavisi için% 7.5 FeCl 3 kullanmanızı öneririz. % 7.5 tedavisi FeCl3 altında, yaralı alanı ve normal damar duvarında sınırları kolayca (Bkz online video 1) mikroskop altında tespit edilir, endotel tabakası önemli ölçüde hasar gördü düşündürmektedir. Trombüs FeCl3 tedavi üzerine hemen oluşmuş ve yaralanm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

FeCl3 indüklediği modeli trombosit fonksiyonu ve tromboz 7,8,16,19,31-33 genetik değişiklikler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir sadece en yaygın olarak kullanılan tromboz modellerinde biridir, ama aynı zamanda değerli bir araç olabilir aterotrombotik hastalıkların 11,17,34-37 tedavisi ve önlenmesi için terapötik bileşikler ve stratejiler değerlendirilmesi için. Burada biz modifikasyonları ve bu modelin iyileştirmeler gösterildiği antikoagülan (tPA), anti-trombosit ilaçlar (PAR4 ant...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) tarafından R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) ve R01 HL098217 (PI: Nieman) ödül numaraları altında desteklenmiştir. Bu yayının içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cerrahi Makas - Tungsten Karbürİnce Bilim Aletleri 14502-14Kes ve Tut
Cilt Mikro-Adson Forseps - Tırtıklı/Düz/12 cmİnce Bilim Aletleri 11018-12Kesme ve Tutma
Cildi Metzenbaum Fino Makas - Tungsten Karbür/Kavisli/Künt-Künt/14,5 cmGüzel Bilim Aletleri 14519-14   Yumuşak dokuyu incelemek ve ayırmak için
Ultra İnce Kanama Durdurucu - Pürüzsüz/Kavisli/12,5 cmİnce Bilim Aletleri 13021-12yumuşak dokuyu incelemek ve ayırmak için
Graefe Forseps - Tırtıklı/Düz/10 cmİnce Bilim Aletleri 11050-10yumuşak dokuyu incelemek ve ayırmak için
Dumont #5 İnce Forseps - Biyoloji İpuçları/Düz/Inox/11 cmİnce Bilim Aletleri 11254-20 Damarı çevreleyen dokudan izole edin
Dumont #5XL Forseps - Standart Uçlar/Düz/Inox/15 cmGüzel Bilim Aletleri 11253-10Damarı çevreleyen dokudan izole edin
Künt Kanca - 12 cm / 0.3 mm Uç Çapıİnce Bilim Aletleri 10062-12Damarı çevreleyen dokudan izole edin
Castroviejo Mikro İğne TutucularGüzel Bilim Araçları 12061-02İğne tutucular
Sütür İpliği 4-0Güzel Bilim Aletleri 18020-40Kesici dişleri plakaya sabitlemek için
Sütür İpliği 6-0Güzel Bilim Aletleri 18020-60Tüm cerrahi ve ligasyon için
Kalt Sütür İğneleriGüzel Bilim Aletleri 12050-03
rodamin 6G Sigma83697-1GTrombositleri lebel etmek
için FeCl3 (Susuz)Sigma12321Damar yaralanmasını indüklemek için
Papaverin hidroklorürSigmaP3510Bağırsak peristaltizmini inhibe etmek için.
Medline Cerrahi Alet Sterilizasyon Buharlı Otoklav BantlarıMedline111625Fareyi plakaya sabitlemek için
Fisherbrand™   Şırınga Filtreleri - Steril 0.22 & mFisher09-720-004Farelere enjekte edilen solüsyonların sterilizasyonu için
Fisherbrand™   Şırınga Filtreleri - Steril 0.45 & mikro; mFisher09-719DFeCl3 solüsyonunu filtrelemek için
Steril Alkol Hazırlama PediFisher06-669-62Cerrahi bölgeyi sterilize etmek için
Agarose BioExpressE-3120-500Jel aşaması yapmak için
Leica DMLFS floresan mikroskobuLeicaIntravital mikroskobu,
CEBELITARIK Platformu ve ısıtma plakası takılı XY Aşama Sistemi.npi electronic GmbHhttp://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix sürüm 3.17.2 yazılımıNorPixhttps://www.norpix.com/
,

Kaynaklar

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J. Jr, et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K. 3rd, Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ferrik Klor r TrombozuKarotis Arter Modelintravital MikroskopiTrombosit AktivasyonuTrombus Olu umuVask ler HasarAntikoag lan la larAntiplatelet la larRodamin 6G EtiketlemesiPAR4 Antikoru
Ferrik klorit indüklenen fare tromboz modellerinde
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.