Yöntem makalesi

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

DOI:

10.3791/54484

⸱

28 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hücreler içindeki halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin daha sonra spesifik bir şekilde belirlenmesi için küçük kan örneklerinden lökositlerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesini tanımlar. Yöntem, insan ve insan olmayan materyallere uygulanabilir ve yeni inflamatuar belirteçlerin değerlendirilmesine katkıda bulunabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda küçük tam kan örneklerinden lökositlerin hızlı ve standardize zenginleştirme için bir protokol tanımlanmıştır. Bu prosedür, eritrositlerin hipotonik liziz dayalıdır ve insan olmayan kökenli kan hem de insan örnekleri uygulanabilir. yaklaşık 50 ile 100 ul az ilk örnek hacmi küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneğinin, bu yöntem uygulanabilir hale getirir. Ayrıca, lökosit zenginleştirme birden laboratuvar ortamlarında bu yöntem uygulanabilir hale dakika içinde ve kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük malzeme çabaları ile elde edilir.

Lökositlerin standardize saflaştırma son derece seçici bir hema peroksidaz halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi için boyama yöntemi, miyeloperoksidaz (MPO), eozinofil peroksidaz (EPO) örneğin, hipokloröz ve hipobromus asitinin (HOCI ve HOBr) oluşumu ile birleştirilir. MPO güçlü neut'ait olarak ifade edilirkenrophils, insan kanında olarak monositlerde en bol immün hücre tipi, ilgili enzim EPO özel eozinofil olarak ifade edilir. Bu enzimlerin halojenleme aktivitesi neredeyse HOCl- ve HOBr'nin özgü boya aminofenil fluoresein (APF) ve primer peroksidaz substrat hidrojen peroksit kullanılarak giderilir. daha sonra akım sitometrisi analizi üzerine tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, monositler, eozinofil) ayırt edilebilir ve halojenleme peroksidaz aktivitesi belirlenebilir. APF lekeli hücre yüzeyi markerlerinin uygulama ile birlikte olabilir için, bu protokol, spesifik olarak, lökosit alt parçacığı gidermek için uzatılabilir. yöntem, insan ve kemirgen lökositleri hem HOCl ve HOBr'nin üretimi tespit etmek için de geçerlidir.

kronik inflamatuvar hastalıklarda bu enzimatik ürünlerin yaygın ve çeşitli şekillerde tartışılan immünolojik rol göz önüne alındığında, bu protokol daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilirlökosit kaynaklı heme peroksidaz immünolojik alaka.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimorfonükleer lökositler (PMN olarak da adlandırılır granülositler) ve monositler kan 1,2 olarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücresel bileşenleri temsil eder. Patojenlere karşı ve kazanılmış bağışıklık sistemi aktivasyonu ve sistemik enflamatuar tepki 2-4 başlatılmasından birincil savunma katkıda bulunur. Oysa özellikle nötrofiller, granülosit en bol türü ve monositler de önemli ölçüde akut inflamatuar olayların 5 düzenlenmesi ve fesih katkıda bulunur. Bu nedenle, bu hücreler aynı zamanda römatoid artrit, 6,7 gibi kronik iltihaplı hastalıklarda önemli bir rol oynayabilir. Aslında, astım, kronik enflamasyonlu hava geçiş yolu hastalığı olarak, eozinofil bozulmuş apoptoz, kan 8'de ikinci granülosit Çeşidi ile karakterize edilir. Oysa granülosit apoptoz ve makrofajlar tarafından onların hızlı çıkarma hücresel sonlandırma sırasında iki temel adımlardırinflamasyon 9-11.

Adı bağışıklık hücreleri, iki yakın ilişkili enzimler, yani miyeloperoksidaz (MPO, nötrofiller ve monositler) ve eozinofil peroksidaz (EPO, eozinofiller) 'de 12,13 bulunabilir. Bu hem peroksidazlar klasik iki-elektronik ilgili hipo (sözde) ila (sözde) halidler bakterisid özellikleri 14-16 için bilinen halojen asitleri okside olarak humoral bağışıklık tepkisi ile ilişkilidir. Fizyolojik koşullar altında MPO esas olarak form hipokloröz asit (HOCI) ve hypothiocyanite (- OSCN) ikinci ve hipobromus asit (HOBr'nin) EPO 17-19 oluşturduğu getirilmektedir. Yeni sonuçlar, bu (sözde) halojenasyon enzim aktivitesi aynı zamanda inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde ve bağışıklık reaksiyonları 20,21 feshi katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Aslında, MPO ve elde edilen ürünlerin tarafından HOCl üretimi T hücre tabanlı adaptif immün yanıtları 22-2 bastırmak gösterilmiştir4.

Bu fizyolojik fonksiyonu MPO ve EPO katkısı kronik inflamatuar hastalıklarda doğuştan gelen bağışıklık sisteminden lökositlerin immünolojik rolüne daha fazla anlayışlar kazanmak için ve belirlemek için hızla bir sonraki özgü küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi bu hücrelerde halojenleştirici peroksidaz etkinliğinin belirlenmesi. eritrosit tükenmesi için biz düşük malzeme maliyetleri hızlı bir lökosit zenginleşmeye yol açar damıtılmış su ile iki müteakip hipotonik lizis adımları içeren bir standart yöntem seçtiniz. Sonraki halojenleme MPO belirlenmesi ve EPO faaliyeti için HOCl- ve HOBr'nin özel boya aminofenil floresein (APF) 25-27 kullanılmıştır. Spesifik olmayan peroksidaz boyama yöntemleri 28,29 uygulanması aksine olarak, bu yaklaşım, genellikle ciddi iltihaplanmaya karşı en bozulur halojenleme peroksidaz aktivitesi seçici algılama sağlar,amasyon 30,31.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün insan kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve uygulanan lökosit zenginleştirme protokolü Leipzig Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik komisyonu yönergeleri takip eder. sıçan kan deneyler, hayvan bakımı ve kullanımı ile ilgili Alman kurallarına göre, sorumlu yerel etik kurulu (Landesdirektion Sachsen, Referat 24) tarafından onaylanmıştır.

1. Deney Düzeneği

NOT: kan örneklerinden eritrositlerin tükenmesi için hipotonik parçalama prosedürü zaman kritik bir işlem olduğundan, önceden protokolün bu kısmı için gerekli tüm donanım (örneğin, tamponlar) hazırlar.

  1. hipotonik liziz için bir 15 ml santrifüj tüpüne ve kan numune başına takip eden aminofenil floresein (APF) boyama için bir 1.5 ml örnek tüp etiketleyin.
    1. Lökosit zenginleştirme, steril koşullar altında yapılacak ise, akışı altında Bu etiketlenmesikutu.
  2. örnek başına 12 ml fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM) hazırlanır. lökositler, steril koşullar altında izole ya da edilip edilmeyeceğine bağlı olarak, ilgili steril hazır çözelti ile ya da damıtılmış su içinde PBS çözünen tabletler yoluyla PBS hazırlar. pH değeri kontrol ve gerekirse, 0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanılarak pH 7.4'e ayarlanır.
    1. yaklaşık 16 numune için yeterli steril olmayan bir tampon çözeltisi elde etmek üzere distile su, 200 ml (Malzeme Tablo) PBS tablet içinde çözülür. Eğer arzu edilirse, steril süzme ile bu çözüm sterilize edin.
  3. Ca ile desteklenmiş 1 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 2+ numune başına hazırlayın.
    1. 100 ml HBSS tuzu (nihai hacim), iki kez damıtılmış su ile 970 mg eritin. Nihai hacme kadar doldurmadan önce, pH değerini kontrol ve pH 7.4 ayarlayın. Düşük tampon kapasitesi nedeniyle, bir her gün taze olarak bu tampon hazırlamak0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanarak özel itina ile pH ayarlamasını yapmak d.
      Not: steril bir çözelti deneye bağlı olarak, kullanılabilir. Çözelti, steril filtrasyon ile sterilize edilir.
  4. İki tampon, etiket dışında ve bir tüp hazırlanması (örneğin, 50 mi santrifüj borusu) ya da bir şişe (örneğin, ölçüm kabı 250 mi) önceden hipotonik lizis prosedürü için iki kez damıtılmış su ile yıkanır. örnek başına 10 ml su hazırlayın.
  5. Buz üzerinde gerçekleştirilir APF boyama (bölüm 3) için, ezilmiş buz ile bir kap hazırlanır.
  6. boyama esnasında kullanılan çalışma çözümleri hızlı hazırlanmasını sağlamak için önceden APF hacimde hazırlayın (3.2 adım) ve donma ve APF çözümünün çözülme defalarca önlemek için.
    Not: AFP genellikle 5 mg / ml metil asetat (11.81 mM) stok çözeltisi olarak elde edilir.
    1. 0.5 ml tüpler içinde 10-100 ul alikotları dondurun. APF nihai boyama için10 uM boya konsantrasyonu (adım 3.8) kullanılmıştır.

Eritrositler 2. Hipotonik Lizis

NOT: kirlenmesini önlemek için bir laminer akış tezgah altında (santrifüj adımları hariç) hipotonik lizis adımları uygulayın. Oda sıcaklığında tüm prosedürü uygulayın. hipotonik lizis zaman kritik bir süreç olduğu için, önceden su (2 mi) ve PBS (5 mi) eklenmesi için pipetler ayarlayın ve işleme başlamadan önce su ve PBS şişeler açın. Kullanımdan önce, oda sıcaklığında PBS çözeltisi ve saf su saklayın.

  1. Her kan örneği transferi uygun 15 ml santrifüj tüpüne 100 ul.
    Not: Deneylerde kan örnekleri, genellikle pıhtılaşmayı önlemek için, heparinin 10 U / ml ihtiva etmektedir. Ancak, numune malzemenin farklı kaynaklardan anti-koagülan doğası ve konsantrasyonu farklı olabilir. APF boyaması üzerindeki etkisi karş tarafından test edilmelidirdiğer türleri veya anti-koagülan konsantrasyonları ile takviye edilmiş, kan numuneleri elde edilen sonuçlara sonuçları ing.
  2. 2 mL distile su ekleyin ve bir orta düzeyde ayarlanmış bir vorteks mikser kullanarak örnekleri karıştırın. daha sonra numune başına 5 ml PBS ilave ve vorteks karıştırıcı ile karıştırın, 60 saniye boyunca inkübe edin.
    Not: yaklaşık 5 numuneye kadar paralel hazırlanabilir. numune sipariş karşılaştırılabilir inkübasyon süreleri elde etmek için su ve PBS eklenmesi için aynı tutmak.
  3. PBS ilave (aşama 2.2), oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile tüm örneklerde kalan sağlam hücreler pelet izotonik koşulların yenilenme sonra.
  4. Bir tablo çöp kutusuna dökerek süpernatantı. santrifüj tersini tüp ve bir kağıt havlu üzerine açılış dokunarak kadar sıvı mümkün olduğunca kaldırın. Hücre topağı mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun.
  5. (Adım 2.2) daha önce açıklandığı gibi hipotonik lizis işlemi tekrarlayın.
    NOT: Prensip olarak, bu hipotonik lizis prosedürü elde edilecek karışık bir lökosit fraksiyonunun saflığı bağlı olarak, birden fazla kez tekrar edilebilir (2.5 2.3 adım). İki parçalama elde karışık hücre fraksiyonu içinde eritrosit kalan payı adımlar sonra yaklaşık% 25'tir.
  6. Oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile geri kalan sağlam hücreler pelet. süpernatant (adım 2.4) sökün. pelet 500 ul HBSS ekleyin ve homojen bir çözelti elde edilene kadar yavaşça çözülür. buna göre etiketlenmiş 1.5 ml numune tüpüne her örnek aktarın.
  7. Deneye bağlı olarak, doğrudan, (akış sitometrisi ile, örneğin,) elde edilen numunelerin, 25, 32 (tek hücre tiplerinin tanımlanması için) floresans etiketli antikorlar ile leke analizi (hücre aktivasyon deneyleri için) hücre uyaranlara 33 inkübe ya da buz ve Kullanım depolanan sonra. Çalışmanın amacı bağlı olarak, hemen üzerinde sonraki deneylerigranülosit yana karışık bir lökosit fraksiyonu yaklaşık 20 saat arasında oldukça kısa bir yarı ömre sahiptir.
    Not: Bu, aynı zamanda, aşağıda tarif edilen peroksidaz aktivitesi boyama için de geçerlidir.

3. Halojenleyici Peroksidaz Aktivitesi Boyama

Not: kandan alınan hema peroksidazlar MPO ve EPO tarafından HOCl- ve HOBr'nin üretim adlandırılan arasında hipohalus asitlerinin ile floresan oksidize edilir APF kullanılarak ölçülür. floresan işaretli antikorlar ile hücre etiketleme APF boyama ile bir arada gerçekleştirilen bu yüzden eğer floresan emisyon sinyali engelleyebilir florofor kaçının.

  1. buz üzerinde 4 ° C de APF boyama gerçekleştirin.
  2. APF bir çalışma çözeltisi hazırlamak için boya uygun bir kısım Çözülme (örneğin, 10 ul, 11.81 mM) ve tam 1 ​​mM (örneğin, 10 ul 108.1 ul tampon ekleyin) için HBSS ile seyreltin.
    1. Her numune (500 ul hücre çözeltisi) için 5 u hazırlamaktarif APF hazır çözeltinin l. Bu duruma göre, 118.1 ul AFP çalışma çözeltisi (1 mM) 20 numune hazırlamak için verir APF (11,81 mm), bir adet 10 ul tablet kullanımı. Nedeniyle pipetleme sırasında kaybı hesaplanmış yaklaşık% 10 daha fazla APF çalışma çözeltisi hazırlayın.
  3. , APF boyama peroksidaz özgüllük kontrol hema peroksidaz inhibitörü, 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH) 35 ile kontrol örneklerini hazırlamak için.
    1. Çözücü, 500 ul, 75.6 mg 4-ABAH seyreltilerek, dimetil sülfoksit içinde 4-ABAH (151.17 g / mol), (DMSO) içindeki bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Dahası HBSS 4-Abah 1/10 sulandırmak.
  4. Sırasıyla, "70 mM H2O 2" ve "7 mM H2O 2", bir H2O 2 çalışma çözeltisi etiketi iki 1.5 mi santrifüj tüpleri hazırlanması için.
    1. "70 mM H 2 O 2" etiketli tüp içinde, taze 10 ul sulandırmakyaklaşık 88 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için distile su 990 ul kullanılarak H2O 2,% 30'luk bir stok çözeltisi (8.8 mM). Buz üzerinde saklayın ve 4 saat içinde kullanın.
      NOT: H 2 O 2, tipik tedarikçiler tarafından% 30 stok çözelti olarak teslim edilir. 4 ° C'de depolandığında, yaklaşık 3 yıl stabildir. Bozunmadan kaçınmak için damıtılmış su içinde H2O 2 dilüsyonları gerçekleştirin. H2O 2 seyreltmeler, 0.1 M NaOH çözeltisi içinde hazırlanabilir.
    2. Tam H belirlenmesi için 2 O 2 konsantrasyonunun etiketlenmiş 1.5 ml'lik bir tüp içinde damıtılmış su 900 ul bu solüsyondan 100 ul eklenmesiyle ilk H 2 O 2 stok solüsyonu (yaklaşık 88 mm), daha da 1-10 seyreltme hazırlanması "7 mM H 2 O 2".
    3. (UV-Vis fotospektrometre kullanarak yakın UV aralığında (örneğin, 200-300 nm) spektrumunu kaydetme ve 240 nm'de absorbansı kullanın49; 240 = 34 M -1 cm -1) ikinci H 2 O 2 stok solüsyonu 34 gerçek H 2 O 2 konsantrasyonunu belirlemek için. Referans küvet sadece distile su içerdiğinden emin olun. Ölçüm kullanım kuvars küvetler UV aralığında bir spektrum kaydedilir olarak.
    4. Bu sonuçtan, hem H 2 O 2 stok çözümleri tam konsantrasyonları hesaplayın. Damıtılmış su, uygun bir miktarının ilave edilmesi ile "70 mM H2O 2" örnek tüp tam olarak 70 mM ilk ihtiyat çözeltisinin yoğunluğu ayarlayın. buz üzerinde elde edilen çalışma çözüm saklayın ve bir saat içinde kullanın.
  5. 1 mM'lik bir son konsantrasyon için, uygun örnekler 4-ABAH çalışma çözeltisi (100 mM) 5 ul ekle. APF ilave edilmeden önce bir inkübatör içerisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Her bir 5 ul APF çalışma çözeltisi (1 mM) ilave500 ul numune 10 uM bir nihai boya konsantrasyonu elde edildi. (Orta ayara vorteks karıştırıcı kullanılarak, örneğin) yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  7. 700 uM'lik bir son konsantrasyon için her 500 ul numune 5 ul H2O 2 çalışma çözeltisi (70 mM) eklenir. Yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe. paralel olarak uygun kontrol ölçümleri gerçekleştirmek.
    NOT: Kontrol ölçümleri 700 uM H 2 O 2 hücreleri için toksik olmadığını gösterdi. Ayrıca önemli bir hücresel tepkiler gözlenmiştir.
    NOT: APF boyama, H2O 2 ilavesi olmaksızın, bilimsel soruya bağlı olarak ile gerçekleştirilebilir. H2O 2 eklenmesi hücreleri tarafından maksimum HOCl ve HOBr'nin üretim saptanmasına izin verir ise, hidrojen peroksit yokluğunda sadece bazal klorlama MPO ve EPO aktivitesi belirlenir. TO ikinci bir anlamlı olarak daha yüksek floresan sinyal anlamına gelir.
  8. hücreler pelet için, oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı ve 400 x g'de için örnekler santrifüj. İyice pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve hücreleri tekrar süspansiyon 250 ul HBSS ekleyin.
    NOT: Numuneler şimdi 25 flow sitometri aracılığı ile analiz için hazır.
  9. ağartma önlemek için analize kadar karanlıkta örnekleri saklayın. 480-490 nm'de eksitasyonla sonra yaklaşık 525 nm 37 ° floresan emisyonu tespit eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce belirtildiği gibi, yukarıda tarif edilen yöntem, insan ve insan-olmayan madde 32 her ikisi de uygulanabilir olduğu ortaya çıktı. astım semptomları olan fareler için gösterilen üstelik olarak APF boyama sistemik pro-enflamatuar durum farklılıkları tespit etmek için uygun bir araç olabilir. Bu nedenle bu protokol kullanılır Takip eden bir çalışmada, art arda, pristan-kaynaklı artrit (PIA) dişi Koyu Agouti sıçanlarda MPO (EPO) ve halojenasyon etkinliğini değerl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofiller, insan kanından en bol lökositlerdir olarak peroksidaz-pozitif hücrelerinin elde edilmesi çoğu zaman sadece bu hücreler üzerinde odaklanır ve yoğunluk dereceli santrifüj 38 diğer lökositlerin nötrofillerin bir şekilde ayrılmasını da içerir. Nötrofiller daha az bol sıçangil kan örneklerinde henüz olarak ikinci daha karmaşık yöntemleri için 39 40 kullanılmalıdır. Ayrıca her iki yöntemde de bağlı daha büyük kan hacim ihtiyacı için, numunelerden peroksidaz pozitif monositler kald...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın (BMBF, 1315883) yanı sıra Sächsische Aufbaubank (SAB) projesi tarafından finanse edilen 100116526 Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'nun (ERDF) bir fonundan sağlanan finansmanla mümkün olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzemeler/Ekipman
15 ml santrifüj tüpleriVWR/Corning734-0451-1,5
ml numune tüpleriVWR/Eppendorf211-2130DE-5
ml'ye kadar hacimler için pipetlerEppendorförn., 31200000701-10 ve mikro aralığında ayarlanabilir hacimlere sahip Eppendorf Resarch plus pipetleri kullanıyoruz; L, 10-100 ve mikro; l, 100-1.000 & mikro; l bir 500-5.000 & mikro; l
laminer akış tezgahıTermo Elektron KorelasyonuHeraSafe-Vorteks
karıştırıcıBender & Hobein AGVortex Genie2-Masaüstü
santrifüjKendro Laboratuvar ÜrünleriLaborfuge 400RSantrifüj 450 x g'da kullanılabilmelidir
Küçük santrifüjEppendorf5415DSantrifüj 400 x g'da kullanılabilmelidir
İnkübatörHeraeuscytoperm 2Ayarlar: 37 &°; C, %95 nem, %5 CO2 içeriği
UV-Vis spektrofotometresiVarianCary 50 bio200 ile 300 nm arasındaki bir spektrumun kaydedilmesi gerekir. Bu nedenle kuvars küvetlerin uygulanması gerekir
Akış sitometresiBecton, DickinsonBD Facs CaliburFloresein (örn. < / em>, 488 nm argon lazer) uyarılması için uygun bir lazerle donatılmış herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir
Adı< ><güçlü>Şirket< >Katalog Numarası< / strong> Yorumlar< / strong>
Kimyasallar
Fosfat tamponlu salin (PBS)amrescoK812steril solüsyon, kullanıma hazır
Fosfat tamponlu salin (PBS)200 ml miligözenekli suda çözündürmek içinSigma-AldrichP4417
Hanks Ca2+Sigma-AldrichH1387ile dengeli tuz çözeltisi (HBSS)970 mg / 100 ml, dikkatlice kontrol edin ve pH değerini 7.4
Hidroklorik asitMerck Millipore1.09057.10001 M çözelti
Sodyum hidroksitRiedel-deHaë n30620Katı peletler. 1 M'lik bir çözelti için 4 g / 100 ml Millipor su
Aminofenil floreseinCayman101575 mg / ml çözelti (11.81 mM) metil asetat, alikotlar ( örn.< / em> 100 & mikro; l) -20 ° C'de hazırlanmalı ve saklanmalıdır; C
Hidrojen peroksitSigma-AldrichH1009Bu %30'luk stok çözeltisi yaklaşık 8,8 M'lik bir konsantrasyona karşılık gelir. Diğer seyreltmeler, kullanımdan hemen önce damıtılmış suda taze olarak hazırlanmalı ve absorbans ölçümleri ile ölçülmelidir
: 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH)Sigma-AldrichA419091 M'lik bir ilk stok çözeltisi DMSO'da, ikincisi 100 mM'lik bir HFSS DMSO vwr kimyasallarında 1:10 seyreltme ile hazırlanmalıdır
23500.26-
tabletleri: ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

L kosit Zenginle tirmeHipotonik LizisEritrosit Uzakla t rmaPeroksidaz Aktivite AnaliziAPF BoyamaAk Sitometrisi AnaliziMiyeloperoksidaz TespitiEozinofil Peroksidaz TespitiHidrojen Peroksit SubstratHem Peroksidaz nhibisyonu

İlgili makaleler