Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

Polimorfonükleer lökositler (PMN olarak da adlandırılır granülositler) ve monositler kan ^1,2 olarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücresel bileşenleri temsil eder. Patojenlere karşı ve kazanılmış bağışıklık sistemi aktivasyonu ve sistemik enflamatuar tepki ^2-4 başlatılmasından birincil savunma katkıda bulunur. Oysa özellikle nötrofiller, granülosit en bol türü ve monositler de önemli ölçüde akut inflamatuar olayların ⁵ düzenlenmesi ve fesih katkıda bulunur. Bu nedenle, bu hücreler aynı zamanda römatoid ^{artrit, 6,7} gibi kronik iltihaplı hastalıklarda önemli bir rol oynayabilir. Aslında, astım, kronik enflamasyonlu hava geçiş yolu hastalığı olarak, eozinofil bozulmuş apoptoz, kan ^8'de ikinci granülosit Çeşidi ile karakterize edilir. Oysa granülosit apoptoz ve makrofajlar tarafından onların hızlı çıkarma hücresel sonlandırma sırasında iki temel adımlardırinflamasyon ^9-11.

Adı bağışıklık hücreleri, iki yakın ilişkili enzimler, yani miyeloperoksidaz (MPO, nötrofiller ve monositler) ve eozinofil peroksidaz (EPO, eozinofiller) 'de ^12,13 bulunabilir. Bu hem peroksidazlar klasik iki-elektronik ilgili hipo (sözde) ila (sözde) halidler bakterisid özellikleri ^14-16 için bilinen halojen asitleri okside olarak humoral bağışıklık tepkisi ile ilişkilidir. Fizyolojik koşullar altında MPO esas olarak form hipokloröz asit (HOCI) ve hypothiocyanite ^(- OSCN) ikinci ve hipobromus asit (HOBr'nin) EPO ^17-19 oluşturduğu getirilmektedir. Yeni sonuçlar, bu (sözde) halojenasyon enzim aktivitesi aynı zamanda inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde ve bağışıklık reaksiyonları ^20,21 feshi katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Aslında, MPO ve elde edilen ürünlerin tarafından HOCl üretimi T hücre tabanlı adaptif immün yanıtları ^22-2 bastırmak gösterilmiştir4.

Bu fizyolojik fonksiyonu MPO ve EPO katkısı kronik inflamatuar hastalıklarda doğuştan gelen bağışıklık sisteminden lökositlerin immünolojik rolüne daha fazla anlayışlar kazanmak için ve belirlemek için hızla bir sonraki özgü küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi bu hücrelerde halojenleştirici peroksidaz etkinliğinin belirlenmesi. eritrosit tükenmesi için biz düşük malzeme maliyetleri hızlı bir lökosit zenginleşmeye yol açar damıtılmış su ile iki müteakip hipotonik lizis adımları içeren bir standart yöntem seçtiniz. Sonraki halojenleme MPO belirlenmesi ve EPO faaliyeti için HOCl- ve HOBr'nin özel boya aminofenil floresein (APF) ^25-27 kullanılmıştır. Spesifik olmayan peroksidaz boyama yöntemleri ^28,29 uygulanması aksine olarak, bu yaklaşım, genellikle ciddi iltihaplanmaya karşı en bozulur halojenleme peroksidaz aktivitesi seçici algılama sağlar,amasyon ^30,31.

Bütün insan kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve uygulanan lökosit zenginleştirme protokolü Leipzig Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik komisyonu yönergeleri takip eder. sıçan kan deneyler, hayvan bakımı ve kullanımı ile ilgili Alman kurallarına göre, sorumlu yerel etik kurulu (Landesdirektion Sachsen, Referat 24) tarafından onaylanmıştır.

1. Deney Düzeneği

NOT: kan örneklerinden eritrositlerin tükenmesi için hipotonik parçalama prosedürü zaman kritik bir işlem olduğundan, önceden protokolün bu kısmı için gerekli tüm donanım (örneğin, tamponlar) hazırlar.

1. hipotonik liziz için bir 15 ml santrifüj tüpüne ve kan numune başına takip eden aminofenil floresein (APF) boyama için bir 1.5 ml örnek tüp etiketleyin.
   1. Lökosit zenginleştirme, steril koşullar altında yapılacak ise, akışı altında Bu etiketlenmesikutu.
2. örnek başına 12 ml fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM) hazırlanır. lökositler, steril koşullar altında izole ya da edilip edilmeyeceğine bağlı olarak, ilgili steril hazır çözelti ile ya da damıtılmış su içinde PBS çözünen tabletler yoluyla PBS hazırlar. pH değeri kontrol ve gerekirse, 0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanılarak pH 7.4'e ayarlanır.
   1. yaklaşık 16 numune için yeterli steril olmayan bir tampon çözeltisi elde etmek üzere distile su, 200 ml (Malzeme Tablo) PBS tablet içinde çözülür. Eğer arzu edilirse, steril süzme ile bu çözüm sterilize edin.
3. Ca ile desteklenmiş 1 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ²⁺ numune başına hazırlayın.
   1. 100 ml HBSS tuzu (nihai hacim), iki kez damıtılmış su ile 970 mg eritin. Nihai hacme kadar doldurmadan önce, pH değerini kontrol ve pH 7.4 ayarlayın. Düşük tampon kapasitesi nedeniyle, bir her gün taze olarak bu tampon hazırlamak0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanarak özel itina ile pH ayarlamasını yapmak d.
      Not: steril bir çözelti deneye bağlı olarak, kullanılabilir. Çözelti, steril filtrasyon ile sterilize edilir.
4. İki tampon, etiket dışında ve bir tüp hazırlanması (örneğin, 50 mi santrifüj borusu) ya da bir şişe (örneğin, ölçüm kabı 250 mi) önceden hipotonik lizis prosedürü için iki kez damıtılmış su ile yıkanır. örnek başına 10 ml su hazırlayın.
5. Buz üzerinde gerçekleştirilir APF boyama (bölüm 3) için, ezilmiş buz ile bir kap hazırlanır.
6. boyama esnasında kullanılan çalışma çözümleri hızlı hazırlanmasını sağlamak için önceden APF hacimde hazırlayın (3.2 adım) ve donma ve APF çözümünün çözülme defalarca önlemek için.
   Not: AFP genellikle 5 mg / ml metil asetat (11.81 mM) stok çözeltisi olarak elde edilir.
   1. 0.5 ml tüpler içinde 10-100 ul alikotları dondurun. APF nihai boyama için10 uM boya konsantrasyonu (adım 3.8) kullanılmıştır.

Eritrositler 2. Hipotonik Lizis

NOT: kirlenmesini önlemek için bir laminer akış tezgah altında (santrifüj adımları hariç) hipotonik lizis adımları uygulayın. Oda sıcaklığında tüm prosedürü uygulayın. hipotonik lizis zaman kritik bir süreç olduğu için, önceden su (2 mi) ve PBS (5 mi) eklenmesi için pipetler ayarlayın ve işleme başlamadan önce su ve PBS şişeler açın. Kullanımdan önce, oda sıcaklığında PBS çözeltisi ve saf su saklayın.

1. Her kan örneği transferi uygun 15 ml santrifüj tüpüne 100 ul.
   Not: Deneylerde kan örnekleri, genellikle pıhtılaşmayı önlemek için, heparinin 10 U / ml ihtiva etmektedir. Ancak, numune malzemenin farklı kaynaklardan anti-koagülan doğası ve konsantrasyonu farklı olabilir. APF boyaması üzerindeki etkisi karş tarafından test edilmelidirdiğer türleri veya anti-koagülan konsantrasyonları ile takviye edilmiş, kan numuneleri elde edilen sonuçlara sonuçları ing.
2. 2 mL distile su ekleyin ve bir orta düzeyde ayarlanmış bir vorteks mikser kullanarak örnekleri karıştırın. daha sonra numune başına 5 ml PBS ilave ve vorteks karıştırıcı ile karıştırın, 60 saniye boyunca inkübe edin.
   Not: yaklaşık 5 numuneye kadar paralel hazırlanabilir. numune sipariş karşılaştırılabilir inkübasyon süreleri elde etmek için su ve PBS eklenmesi için aynı tutmak.
3. PBS ilave (aşama 2.2), oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile tüm örneklerde kalan sağlam hücreler pelet izotonik koşulların yenilenme sonra.
4. Bir tablo çöp kutusuna dökerek süpernatantı. santrifüj tersini tüp ve bir kağıt havlu üzerine açılış dokunarak kadar sıvı mümkün olduğunca kaldırın. Hücre topağı mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun.
5. (Adım 2.2) daha önce açıklandığı gibi hipotonik lizis işlemi tekrarlayın.
   NOT: Prensip olarak, bu hipotonik lizis prosedürü elde edilecek karışık bir lökosit fraksiyonunun saflığı bağlı olarak, birden fazla kez tekrar edilebilir (2.5 2.3 adım). İki parçalama elde karışık hücre fraksiyonu içinde eritrosit kalan payı adımlar sonra yaklaşık% 25'tir.
6. Oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile geri kalan sağlam hücreler pelet. süpernatant (adım 2.4) sökün. pelet 500 ul HBSS ekleyin ve homojen bir çözelti elde edilene kadar yavaşça çözülür. buna göre etiketlenmiş 1.5 ml numune tüpüne her örnek aktarın.
7. Deneye bağlı olarak, doğrudan, (akış sitometrisi ile, örneğin,) elde edilen ^{numunelerin, 25, 32} (tek hücre tiplerinin tanımlanması için) floresans etiketli antikorlar ile leke analizi (hücre aktivasyon deneyleri için) hücre uyaranlara ³³ inkübe ya da buz ve Kullanım depolanan sonra. Çalışmanın amacı bağlı olarak, hemen üzerinde sonraki deneylerigranülosit yana karışık bir lökosit fraksiyonu yaklaşık 20 saat arasında oldukça kısa bir yarı ömre sahiptir.
   Not: Bu, aynı zamanda, aşağıda tarif edilen peroksidaz aktivitesi boyama için de geçerlidir.

3. Halojenleyici Peroksidaz Aktivitesi Boyama

Not: kandan alınan hema peroksidazlar MPO ve EPO tarafından HOCl- ve HOBr'nin üretim adlandırılan arasında hipohalus asitlerinin ile floresan oksidize edilir APF kullanılarak ölçülür. floresan işaretli antikorlar ile hücre etiketleme APF boyama ile bir arada gerçekleştirilen bu yüzden eğer floresan emisyon sinyali engelleyebilir florofor kaçının.

1. buz üzerinde 4 ° C de APF boyama gerçekleştirin.
2. APF bir çalışma çözeltisi hazırlamak için boya uygun bir kısım Çözülme (örneğin, 10 ul, 11.81 mM) ve tam 1 ​​mM (örneğin, 10 ul 108.1 ul tampon ekleyin) için HBSS ile seyreltin.
   1. Her numune (500 ul hücre çözeltisi) için 5 u hazırlamaktarif APF hazır çözeltinin l. Bu duruma göre, 118.1 ul AFP çalışma çözeltisi (1 mM) 20 numune hazırlamak için verir APF (11,81 mm), bir adet 10 ul tablet kullanımı. Nedeniyle pipetleme sırasında kaybı hesaplanmış yaklaşık% 10 daha fazla APF çalışma çözeltisi hazırlayın.
3. , APF boyama peroksidaz özgüllük kontrol hema peroksidaz inhibitörü, 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH) ³⁵ ile kontrol örneklerini hazırlamak için.
   1. Çözücü, 500 ul, 75.6 mg 4-ABAH seyreltilerek, dimetil sülfoksit içinde 4-ABAH (151.17 g / mol), (DMSO) içindeki bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Dahası HBSS 4-Abah 1/10 sulandırmak.
4. Sırasıyla, "70 mM _{H2O 2"} ve "7 mM _{H2O 2",} bir _{H2O 2} çalışma çözeltisi etiketi iki 1.5 mi santrifüj tüpleri hazırlanması için.
   1. "70 mM H ₂ O _2" etiketli tüp içinde, taze 10 ul sulandırmakyaklaşık 88 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için distile su 990 ul kullanılarak _{H2O 2,%} 30'luk bir stok çözeltisi (8.8 mM). Buz üzerinde saklayın ve 4 saat içinde kullanın.
      NOT: H ₂ O _2, tipik tedarikçiler tarafından% 30 stok çözelti olarak teslim edilir. 4 ° C'de depolandığında, yaklaşık 3 yıl stabildir. Bozunmadan kaçınmak için damıtılmış su içinde _{H2O 2} dilüsyonları gerçekleştirin. _{H2O 2} seyreltmeler, 0.1 M NaOH çözeltisi içinde hazırlanabilir.
   2. Tam H belirlenmesi için ₂ O ₂ konsantrasyonunun etiketlenmiş 1.5 ml'lik bir tüp içinde damıtılmış su 900 ul bu solüsyondan 100 ul eklenmesiyle ilk H ₂ O ₂ stok solüsyonu (yaklaşık 88 mm), daha da 1-10 seyreltme hazırlanması "7 mM H ₂ O _2".
   3. (UV-Vis fotospektrometre kullanarak yakın UV aralığında (örneğin, 200-300 nm) spektrumunu kaydetme ve 240 nm'de absorbansı kullanın49; ₂₄₀ = 34 M ^-1 cm ^-1) ikinci H ₂ O ₂ stok solüsyonu ³⁴ gerçek H ₂ O ₂ konsantrasyonunu belirlemek için. Referans küvet sadece distile su içerdiğinden emin olun. Ölçüm kullanım kuvars küvetler UV aralığında bir spektrum kaydedilir olarak.
   4. Bu sonuçtan, hem H ₂ O ₂ stok çözümleri tam konsantrasyonları hesaplayın. Damıtılmış su, uygun bir miktarının ilave edilmesi ile "70 mM _{H2O ^2"} örnek tüp tam olarak 70 mM ilk ihtiyat çözeltisinin yoğunluğu ayarlayın. buz üzerinde elde edilen çalışma çözüm saklayın ve bir saat içinde kullanın.
5. 1 mM'lik bir son konsantrasyon için, uygun örnekler 4-ABAH çalışma çözeltisi (100 mM) 5 ul ekle. APF ilave edilmeden önce bir inkübatör içerisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
6. Her bir 5 ul APF çalışma çözeltisi (1 mM) ilave500 ul numune 10 uM bir nihai boya konsantrasyonu elde edildi. (Orta ayara vorteks karıştırıcı kullanılarak, örneğin) yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
7. 700 uM'lik bir son konsantrasyon için her 500 ul numune 5 ul _{H2O 2} çalışma çözeltisi (70 mM) eklenir. Yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe. paralel olarak uygun kontrol ölçümleri gerçekleştirmek.
   NOT: Kontrol ölçümleri 700 uM H ₂ O ₂ hücreleri için toksik olmadığını gösterdi. Ayrıca önemli bir hücresel tepkiler gözlenmiştir.
   NOT: APF boyama, _{H2O 2} ilavesi olmaksızın, bilimsel soruya bağlı olarak ile gerçekleştirilebilir. _{H2O 2} eklenmesi hücreleri tarafından maksimum HOCl ve HOBr'nin üretim saptanmasına izin verir ise, hidrojen peroksit yokluğunda sadece bazal klorlama MPO ve EPO aktivitesi belirlenir. TO ikinci bir anlamlı olarak daha yüksek floresan sinyal anlamına gelir.
8. hücreler pelet için, oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı ve 400 x g'de için örnekler santrifüj. İyice pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve hücreleri tekrar süspansiyon 250 ul HBSS ekleyin.
   NOT: Numuneler şimdi ²⁵ flow sitometri aracılığı ile analiz için hazır.
9. ağartma önlemek için analize kadar karanlıkta örnekleri saklayın. 480-490 nm'de eksitasyonla sonra yaklaşık 525 nm ³⁷ ° floresan emisyonu tespit eder.

Daha önce belirtildiği gibi, yukarıda tarif edilen yöntem, insan ve insan-olmayan madde 32 her ikisi de uygulanabilir olduğu ortaya çıktı. astım semptomları olan fareler için gösterilen üstelik olarak APF boyama sistemik pro-enflamatuar durum farklılıkları tespit etmek için uygun bir araç olabilir. Bu nedenle bu protokol kullanılır Takip eden bir çalışmada, art arda, pristan-kaynaklı artrit (PIA) dişi Koyu Agouti sıçanlarda MPO (EPO) ve halojenasyon etkinliğini değerlendirmek için. Lökosit zenginleştirme ve deney sırasında gerçekleştirilen boyama temsili bir örneği Şekil 1 'de gösterilmiştir. 200 ul tam kan anestezi altında hayvanın retrobulber venöz pleksus elde edilir ve heparinize edilmiş. Eritrosit tükenmesi ve daha sonraki bir APF boyama 100 ul numune hacmi ile gerçekleştirildi. Daha sonra örnek bir akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.

(Şekil 1A) karşı hücre boyutu, örnek elde edilmiştir eritrosit güçlü bir tükenmesi çizilmesi ile gösterildiği gibi. Ayrıca, farklı lökosit tipleri floresan etiketli hücre yüzeyi işaretçileri uygulanarak tespit edilmiştir ki, pek belirgin edildi (gösterilmemiştir). Olayların yaklaşık% 48 CD16-pozitif nötrofil olarak tespit edildi ise kısaca eritrosit (CD235a-pozitif) / hücre enkaz bölgesi sadece olayların% 22 olarak gerçekleşmiştir. Ayrıca olayların% 3 her CCR3-pozitif eozinofiller ve CD14-pozitif monositler olarak tespit edildi ve olayların yaklaşık% 19'u sırasıyla CD5 / CD19-pozitif B ve T lenfositleri sorumluydu. Monositler ve eozinofiller ılımlı APF oksidasyona açtı ve nötrofiller ch altında güçlü bir peroksidaz-pozitif iken APF türetilmiş floresan yoğunluğu dağılımı (Şekil 1B) açık bir şekilde peroksidaz-negatif eritrositler ve lenfositlerin ayrımı izinosen deney koşulları. Monositler 20 enzim konsantrasyonu ile karşılaştırıldığında Bu sonuçlar, ikinci hücre MPO yüksek bolluk ile uyum içindedir. eozinofillerin, nispeten zayıf bir yanıt yok bromür hobr EPO türevi oluşmasını teşvik etmiş olabilir, ilave edildi gerçeğiyle açıklanabilir. İzole eozinofiller üzerinde ön çalışmalar şaşırtıcı bu hücreler tarafından APF oksidasyonu üzerindeki harici eklenen bromür büyük bir etkisi yoktu. Yine, Br, az miktarda katılmasıyla açıklanabilir gözlenmiştir eozinofillerin APF oksidasyonu - (PBS ve HBSS) kullanılan tampon çözeltiler ile. Alternatif olarak EPO da (fagolizozomları örneğin,), en azından, asidik koşullar altında HOCl az miktarda üretebilir.

Şekil 1: Lökosit zenginleştirme ve APF-derivedBir sıçandan kan mikro-numune içinde D floresan. 200 ul tam kan bir miktar bir dişi Koyu Agouti sıçan retrobulbar venöz pleksus elde edilmiştir. karma hücre fraksiyonu boyama 100 ul kan tarif edilen hemoliz prosedürünün uygulanması ve daha sonraki bir APF sonra akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. FSC / SSc Test alanı (A) ile gösterildiği gibi eritrositler, numune tükenmiş ve farklı lökosit tipleri kolaylıkla ayırt olabilir. APF türetilmiş floresan yoğunluğu (B) dağılımı açıkça gösterdi heme peroksidaz-negatif orta (eozinofiller ve monositler) ya da kuvvetli (nötrofiller) halojenasyon peroksidaz aktivitesi ile hücreleri (eritrositler ve lenfositler) yanı sıra lökositler. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.