Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi Vibrio parahaemolyticus Ve Diğer Vibrio Türler

Summary

Klinik olarak anlamlı Vibrio türlerinin tespiti ve izolasyonu, seçici ve diferansiyel kültür ortamı gerektirir. Bu çalışma, yeni bir kromojenik ortamın V. parahaemolyticus ve diğer ilgili türleri tespit etme ve tanımlama yeteneğini değerlendirdi. Yeni ortamın geleneksel ortamdan daha iyi duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olduğu bulundu.

Abstract

Vibrio türlerinin neden olduğu ABD'de Gıda kaynaklı enfeksiyonlar artış eğilimine göstermiştir. Cins Vibrio, V. parahaemolyticus Vibrio -associated enfeksiyonların çoğunluğu sorumludur. Böylece, Vibrio türleri arasında doğru farklılaşma. ve V. algılama parahaemolyticus gıda arzının güvenliğini sağlamak için büyük önem taşımaktadır. moleküler teknikler giderek daha yaygın olmakla birlikte, kültür-bağlı yöntemleri hala rutin yapılır ve bunlar bazı durumlarda standart yöntemler olarak kabul edilir. Bu nedenle, yeni bir kromojenik agar ortamı izolasyon ve klinik olarak anlamlı Vibrio spp farklılaşması için daha iyi bir yöntem sağlamak amacı ile test edilmiştir. Protokol V. tespiti için duyarlılık, özgüllük ve algılama limitini karşılaştırıldı Yeni kromojenik orta ve geleneksel bir ortam arasında parahaemolyticus. Çeşitli V. parahaemolyticus suşları (n = 22), yenidenfarklı serotipleri ve kökenlerden kaynağını sunan kullanılmıştır. Daha önce Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından tanımlanan ve ayrıca tlh -PCR tarafından laboratuvarda doğrulanmıştır. En az dört ayrı deneylerde, bu suşlara 24 için 35-37 ° C 'de inkübasyon takip kromojenik agar tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz, bu tür kültürlenmesi için tavsiye edilen orta (TCBS) ağar, üzerine aşılanmıştır -96 saat. Üç V. Büyüme varsa parahaemolyticus suşları (% 13.6) yine, TCBS üzerinde optimum büyümek yeşil koloniler sergiledi vermedi. İki suş (% 9.1) kromojenik agar üzerinde beklenen camgöbeği kolonileri vermemiştir. Olmayan V. parahaemolyticus suşları (n = 32), aynı zamanda kromojenik agar özgünlüğünü belirlemek için test edildi. Bu suşların arasında, 31 büyüyecek ya da diğer koloni morfolojileri sergilenmektedir vermedi. V. ortalama geri chromoge üzerinde parahaemolyticusnic Agar ~% 2 NaCl ile desteklenmiş triptik soya agar% 96.4 akrabasıydı. Sonuç olarak, yeni kromojenik ağar V. algılamak için etkili bir orta parahaemolyticus ve vibrios ayırmak için.

Introduction

Vibrio cinsi, V. bir üyesi olarak parahaemolyticus Gram negatif, spor oluşturan eğik, çubuk şeklinde bir bakteridir. Sıvı ve yarı-katı ortamları yüksek hareketliliğini göstermektedir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insanlara patojenik olmayan, henüz patojen alt tipi bir çok ülkede ^1,2 dolayısıyla bu türün önemli gıda kaynaklı patojen olarak kabul edilir salgınlara, yol açmıştır. ABD'de Vibrio enfeksiyon insidansı 2000 ³ itibaren artış eğilimi göstermiştir. Vibrio spp arasında., V. parahaemolyticus ABD ^4,5 yılında hastalıklara neden olan en sık bildirilen türdür. Diğer klinik olarak anlamlı türler V. dahil alginolyticus'un, V. vulnificus, V. cholerae vb hastalıkların küçük bir yüzdesi, aynı anda birden fazla türün neden olur.

V. parahaemolyticus doğal iDeniz suyu nhabitant ve bu nedenle yaygın olarak haliç dahil olmak üzere dünya çapında deniz sularında dağıttı. türler Japonya'da gıda zehirlenmesi salgını aşağıdaki 1950 yılında keşfedildi. ABD'de, türler ilk Puget Sound bölgesinde ^6,7 deniz suyu, sediment, ve kabuklu deniz ürünleri izole edildi. Böyle çift kabuklu kabuklu deniz ürünleri gibi deniz habitatlarının, Filtre besleyiciler, V. liman olabilir doğal floranın ⁸ parçası olarak parahaemolyticus. Bu, V. olarak İnsanda parahaemolyticus enfeksiyonları genellikle kontamine deniz ürünleri, özellikle çiğ veya az pişmiş kabuklu deniz ürünleri tüketimi ile bağlantılıdır. açık yara cilt enfeksiyona yol açan, deniz suyuna maruz kaldığında giriş Daha az yaygın yol meydana gelir. Çoğu V. parahaemolyticus suşları insan hastalığına neden olmaz, henüz böyle termostabil doğrudan hemolizin (TDH) olarak virülans faktörleri barındıran bazı alt tipler patojenik bulunmaktadır. Gıda kaynaklı V. en yaygın belirtileri parahaemolyticus enfeksiyonubulantı, kusma ve ateş takip ishal ve karın ağrısı. Baş ağrısı ve titreme de bildirilmiştir. Medyan kuluçka süresi 15 saat, ama patojenik ⁹ yeterli miktarda tüketiminden sonra 96 saat olabilir. hastalık iki üç gün sürer. V. neden gastroenterit belirtileri parahaemolyticus büyük ölçüde kendi kendini sınırlayıcı değildir ve bu yüzden, özel bir tedavi gerekli değildir. gastroenterit Hafif vakalarda etkin bir ağızdan rehidrasyon ile tedavi edilebilir. Daha ağır hastalıklar tetrasiklin veya siprofloksasin ¹⁰ antibiyotikler ile tedavi edilebilir. Ölüm oranı gastroenterit vakaların yaklaşık% 2, ancak kan dolaşımı enfeksiyonu veya septisemi geliştirmek isteyenler için% 29 gibi yüksek olabilir. Deniz suyuna maruz kalan açık yara deniz tüketir veya sahip herhangi bir kişi V. riski altındadır parahaemolyticus enfeksiyon. hastalıklar, yaşamı tehdit eden septisemi daha şiddetli formu, altta yatan tıbbi işbirliği ile bir alt grubunda daha sık görülüralkolizm, karaciğer hastalığı, diyabet, böbrek hastalığı, malignansi ve zayıflamış bağışıklık tepkisi veren diğer sağlık durumları arasında olan şulları ^11. Özellikle, bireylerin bu grup V. neden ağır hastalıklara yakalanma için daha yüksek risk altındadır da V. benzer doğal habitatların bulunabilir vulnificus, parahaemolyticus.

V. parahaemolyticus rutin seçici ve ayırıcı araç olarak tiyosülfat-sitrat safra tuzları sakaroz (TCBS) agarı kullanılarak izole edilir. Alkali pepton suda zenginleştirilmesi TCBS agarda izolasyon önce ortaya çıkabilir. TCBS ilgili olası koloniler daha sonra türe özgü genlerin varlığı hedefleme biyokimyasal testler ve / veya moleküler yöntemler bir dizi test edilir. PCR bazlı yöntemler genellikle V kimliklerini teyit etmek için kullanılan ¹² tlh, termal olarak hemolisin geni yükselterek parahaemolyticus.

Ne olursa olsun chOnay yöntemlerinin Ses Bildirim, o V. izole etmek ve ayırt etmek için etkili bir ortam olması önemlidir ilk etapta diğer deniz vibrios gelen parahaemolyticus. TCBS rutin sakaroz ¹² mayalanmaya kendi yeteneklerine göre Vibrio cinsi içinde türlerin ayırt etmek için kullanılır olmuştur. Pozitif fermantasyon reaksiyon pH indikatör bromtimol mavi bir renk değişikliği ile eşlik ediyor. V. parahaemolyticus koloniler yeşil renk mavi sergileyen TCBS üzerinde oldukça belirgindir. Ancak, bu orta kolaylıkla V. ayırt edemez alginolyticus'un ve V. cholerae. Sakkaroz fermente Proteus türleri V. benzeyen sarı koloniler oluşturabilir cholerae veya V'dir alginolyticus'un ^13. TCBS, V. başlangıç izolasyon üzerine parahaemolyticus da Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, ve Pseudomonas spp ¹⁴ olarak misidentified olabilir. gecikmiş sakaroz halden ile suşlarıentation V. dahil Vibrio ¹³ fermente diğer sakaroz ile karışabilir parahaemolyticus. TCBS diğerleri arasında Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens'in karşı değil, duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Birkaç diğer türler potansiyel V ile karıştırılmamalıdır gri koloniler yeşil verim parahaemolyticus ya da V. vulnificus ^15. Bunun bir sonucu olarak, tespit ve V izole karşı daha iyi hassasiyet ve özgüllük ile alternatif bir kültür ortamı geliştirilmesi arzu edilmektedir parahaemolyticus ve diğerlerinin yanında yakın ilişkili tür.

Çeşitli medya alternatifleri son zamanlarda geliştirilmiştir. Seçici maddelerin dahil edilmesi ek olarak, en ayırıcı enzimsel faaliyetlerin göre türlerin ayırt etmek için kromojenik substratlar içermektedir. Örneğin, indoksil-β-glukozit ve indoksil-β-galaktozid V ayırt etmek için kromojenik substratlar olarak kullanılmaktadır paragrafV. olanlardan (mavimsi-yeşil görünür) haemolyticus kolonileri nedeniyle diferansiyel yetenekleri (mor) cholerae β-glukozidaz ve β-galaktosidaz ¹⁶ üretmek. Çeşitli gruplar tarafından geliştirilen kromojenik agar Farklı formülasyonları değerlendirilmiştir ve nispeten veya TCBS ^17,18,19 daha iyi performans bildirilmiştir. kromojenik ortam kullanmanın bir avantajı, çevreleyen ortamın renk ve böylece belirli bir koloni izolasyonu kolaylaştırmak az olmasıdır. Bu çalışmada, V tespit etmek ve izole etmek için yeni formüle kromojenik ortamın yeteneği değerlendirildi cholerae, V. parahaemolyticus ve V. vulnificus; V. ayırt etme yeteneği üzerine özel bir odaklanma ile Diğer türlerden parahaemolyticus.

Protocol

1. Medya ve Mikrobiyal Suşlarının Kültürleme

NOT: Tüm deneylerde kullan aseptik teknikler. Steril malzemeler kullanıyoruz. Kullanmadan önce tüm kaplar, alet ve reaktifi sterilize edin. biyolojik tehlikeye kabul edilir çünkü atmadan önce tüm atık maddeleri otoklavlayın. aşağıdaki prosedürleri için otoklav sıcaklık ve zaman kombinasyonu ≥121 ° C x ≥15 dk.

1. ~ 1-L triptik soya agar (TSA) yapmak için, önce bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde deiyonize su 1 L ilave edin. nihai hacim daha az iki kat daha büyük olan bir şişeyi kullanarak. triptik soya suyu tozu 30 g ve şişeye granüller agar 20 g ekleyin.
   NOT:% 2 ağar yerine% 1.5 bazı Vibrio spp swarming sınırlamak için.
   1. karıştırıcı açarak iyice karıştırın. Karıştırılırken, karışımın kaynamasına ısı açın. Karışım kaynamaya başlar kısa sürede ısıtıcı şişeyi çıkarın. Gevşek inci kapakBir kalay folyo ile e şişesi. otoklav önce balona sabitlemek için folyoyu bantlayın.
   2. triptik soya suyu (TSB) yapmak için, adım 1.1 tarifi agar atlayabilirsiniz.
      NOT: yerine Erlenmeyer şişesinde şişe kullanabilir miyim.
   3. % 2 sodyum klorür ya da NaCI (TSA'lar) ile desteklenmiş triptik soya agar yapmak için, önce, karıştırma ve ısıtma karışımın NaCl 20 g ekleyin. % 2 NaCI (TSBs) ile desteklenmiş triptik soya suyu yapmak için, agar ihmal önceden karıştırma ve ısıtma karışımın NaCl 20 g ekleyin.
2. , Beyin kalp infüzyon (BHI) agarı hale BHI tozu 37 g saf su, 1 L 15 gr agar granüller askıya almak için. sık ajitasyon ile ısı tozu çözmek için. Otoklav. BHI suyu yapmak için agar atlayın.
3. , TCBS agar hale saf su, 1 L TCBS tozu 89 g askıya almak için. 1 dakika boyunca sık sık ajitasyon ve kaynatın ile ısı tamamen tozu çözmek için. otoklavlamayın.
4. Tüm ağar ortamlar için, 45-5 sıcak agar serinBir su banyosu içinde 0 ° C ile. beş-altı plakalar yığınlarının boş Petri plakaları düzenleyin. yığının altından başlayarak, yaklaşık yarım dolu ulaşmak için her Petri plakasına erimiş agar dökün. döküldükten sonra Petri plaka kapağını kapatın. agar plakaları oda sıcaklığında oturup izin vererek katılaşmaya izin verin.
   1. Agar plakaları ertesi gün ya da 12 saat sonra kullanın. iki haftaya kadar buzdolabında kullanılmayan tabak saklayın. Kullanımdan önce, buzdolabı plakaları kaldırmak ve en az 15 dakika boyunca oda ısısında dengeye.
      NOT: Bir litre agar ~ 45 agar plakaları yapar. Agar plakaları hazırlama gününde, yeterli miktarda kurumasına ve etkili bir şekilde koloni yayılmasını azaltmak için, soğuk depolamadan sonra, oda sıcaklığına kadar bunları dengelenmeye gelmeye bırakın.
5. Çikolata ve kromojenik agar elde edilir ve her bir deney öncesi oda ısısında dengeye.
6. Tablo 1'de her birkaç da gösterilen 54 mikrobiyal suşları altkültürüys.
   1. donmuş bir hisse senedi veya böyle BHI, TSB / TSA veya çikolata agar olarak seçici olmayan medya bir önceki partiden kültürleri aktarmak için steril bir aşılama döngü kullanın. Halofilik Vibrio spp büyütün. TSBs / TSA'larm üzerinde.
   2. kültür saflığını kontrol etmek için, çizgi izole kolonilerin gözlem için izin verecek bir desen tüm suşlar. Örneğin, en sonunda izole koloniler veren, daha az miktarda bakteri büyük miktarda seyreltik üç fazlı bir çizilme kalıbı kullanın.
7. kadar 48 saat süreyle 35-37 ° C'de plakalar baş aşağı inkübe edin. Campylobacter spp., Tüpler veya plakalar inkübe Bir gaz keseyi içeren bir kapalı kapak kavanoza bir mikroaerofilik bir ortam oluşturmak için. kuluçkadan sonra koloni morfolojisi gözlemleyin. Saf kültürler benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler boyun eğmek zorundadır.
   NOT: col üzerine düşen kapağın alt kısmında oluşan yoğunlaşmış su damlacıkları önlemek için tüm plakaları baş aşağı inkübeonies.

PCR ile 2. Türler Belirlenmesi

1. V. kimliğini doğrulamak için tlh -PCR Davranış parahaemolyticus suşları. Kullanım primerleri -F (5 'AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') ve tlh-R (5 'GTT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') termal olarak hemolisin geni ²⁰ bir 450-bp fragmanı amplifiye etmek için tlh .
   1. Her V. birkaç izole koloniler aktarmak için steril bir aşılama döngü kullanın TSA'lar ile ilgili TSBs 5 ml parahaemolyticus soyu. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
   2. Santrifüj kültürleri 1 dakika için 14,000 x g'de. Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez pelet yıkayın. Hücre lizatı elde etmek için 3 dakika boyunca bir süspansiyon kaynatılır.
      NOT: V. parahaemolyticus lize edilmesi kolaydır. Bu nedenle, liziz reaktifi gerekli değildir. Şablon olarak doğrudan koloni biraz kullanmak da mümkündür.
   3. 25-ul reaksiyon v PCR gerçekleştirinolume. 1x PCR tampon maddesi bir son konsantrasyon, 1.5 mM _MgCl2, her dNTP, 100 uM, her bir primerden 1 uM, 1 U Taq polimeraz ve hücre lizatı 1 ul ihtiva eden bir reaksiyon karışımı hazırlandı. 30 saniye, 30 saniye için 58 ° C, 60 saniye ²¹ ° C 72 94 ° C'de 35 amplifikasyon döngüleri çalıştırmak 5 dakika boyunca 94 ° C'de ön-kuluçka sonrası.
   4. % 1.5 agaroz jelleri içinde 5-il amplikon yük alikotları. elektroforez başlatmak için güç kaynağı açın. etidyum bromid boyama işlemi sonrası UV ışıması altında amplikonların varlığını ya da yokluğunu görselleştirme.

Seçici ve Diferansiyel Medya 3. Büyüme

1. Iki ila dört gün önce deney, çizgi koloni izolasyonu için seçici olmayan ortam (TSA'lar BHI veya çikolata agar) Tablo 1 'de gösterilen tüm mikrobiyal soylar. 48 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin. kuluçkadan sonra koloni morfolojisi gözlemleyerek kültürleri saflığını kontrol. Saf kültürler benzer koloni morfolojisi sergileyen koloniler boyun eğmek zorundadır.
2. suyu 5 ml Aşama 3.1 birkaç izole koloniler aktarın. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: en az dört gün geçmiş kullanın genç koloniler, tüm deneylerde gecede kültürleri hazırlamak.
3. Streak koloni izolasyonu için seçici ve diferansiyel medya (TCBS ve kromojenik agar) gecede kültürlerin bir öze. 96 adete kadar saat 35-37 ° C'de inkübe edin.
4. plaka üzerinde kültür yoğunluğu ve izole kolonilerin boyutunu hem de inceleyerek tüm suşlar genel büyüme kaydetmesi. çevre sıcaklığı ve / veya UV ışığı altında Kolonilerin rengi kaydedin. Böyle yükseklik, kenar boşluğu ve form olarak izole koloninin diğer özelliklerini unutmayın.

4. Kurtarma Testi

1. V. temsili bir alt kümesini seçin parahaemolyticus suşları farklı serotipler ve izolasyon kaynağını kapsamaktadır (n = 14)
2. aşağıda tarif edildiği gibi bir gecede kültürlerin bir standart Plaka Sayısı yöntemini yürütün.
   1. Vortex iyice gecede kültürleri karıştırın. 900 ul PBS içeren bir tüp içine gecelik kültüründen 100 ul aktarılarak 10 kat veya 10 ^-1 seyreltme sağlayın. Vortex iyice karıştırın.
   2. 900 ul PBS içeren başka tüpe 10 ^-1 seyreltme tüpünden 100 ul aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın. Vortex iyice karıştırın. Bu 10 ^-2 seyreltme oluşturmaktadır. 10 ^-7 seyreltme elde etmek için işlem sırayla tekrarlayın.
   3. 10 ^{-4 -7} 10 seyreltme tüpleri kullanarak, kromojenik, TCBS ve TSA'larm agar plakaları üzerinde 100 ul her plaka.
      NOT: plaka üzerinde seyreltme faktörü (df) 10 ^-5 sırasıyla ^-8 ila 10 olur.
   4. t eşit hacimde yaymakO yüzeye ağar.
      NOT: Bu en seyreltilmiş kısım ilk yayılır sürece, aynı ortamda suş başına aynı serpme kullanmak gayet (yani, 10 ^{-8 -5} 10 ila). Farklı ortamlar için aynı dağıtıcısı kullanmayın.
   5. 96 adete kadar saat 35-37 ° C'de inkübe edin. plakalar üzerinde koloniler sayın. çok saymak çok sayıda (TNTC) ya da / ml aşağıdakilere göre 25. hesaplayın CFU az olan koloniler taşıyan plakaları görmezden:
      
      Nerede
      N, seyreltilmemiş bir tüp içinde hücre sayısı = / g CFU / ml veya CFU olarak bahsedildi
      C 25-300 koloni taşıyan plakalar üzerinde sayılan koloni sayısını =
      n, ₁ sayılan koloniler düşük df olan plaka (lar) sayısı =
      n, ₂ sayılan koloniler daha sonra 10-kat seyreltme vardır plaka (lar) sayısı =
      df alt seyreltme faktörü = (yani, daha konsantre seyreltme)
3. Farklı medya arasında CFU / ml karşılaştırın. % 100 olarak TSA'larda CFU / ml kullanın V.% kurtarma hesaplamak parahaemolyticus Kromojenik ve TCBS-Agar kültür.

5. Rekabet Tahlili

1. kromojenik ve TCBS agarda farklı koloni morfolojileri sergileyen soyların bir alt kümesini seçin.
   NOT: şekilde, koloniler V. kökenli saymak mümkün olacaktır aşı maddesi için başka türlerin mevcudiyetine rağmen, sadece parahaemolyticus.
   1. Bir V Seç sırasıyla, TCBS ve kromojenik agarda beklenen turkuaz ve mavi koloniler verir parahaemolyticus süzün.
   2. Olmayan bir V seçin parahaemolyticus bu ortamın da büyür veya farklı koloni rengi sergilemeyen olmayan bir Vibrio türü.
      Not: Örneğin, V. metschnikovii o çok zayıf büyürn TCBS ve. kromojenik agarda büyümek değildi Shigella sonnei TCBS üzerinde büyüyecek ama kromojenik agarda kırmızı kolonileri verir vermez.
2. Yukarıdaki suşların seçildikten sonra, seçici olmayan ortamda gelişen izole koloniler kullanarak bir gecede suyu kültürleri hazırlamak.
   1. V. gecelik kültürleri yapmak parahaemolyticus ve V. TSA'lar ile ilgili TSBs 5 ml birkaç izole koloniler aktararak metschnikovii. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
   2. BHI suyu 5 ml BHI agar birkaç izole koloniler aktarılarak Shigella sonnei gecelik kültürleri yapmak. 16-24 saat boyunca 35-37 ° C'de inkübe edin.
3. her bir suş için Adımlar 4.2.1 ve 4.2.2 benzer bir seyreltme serisi yerine getirir. TSA'larm veya BHI Plaka uygun dilüsyonları Adım 4.2.5 gösterilen denklem kullanılarak, gecede kültür CFU / ml belirlemek için.
   NOT: Genellikle, 10 ^-5 10 ^-7 seyreltme 100 ultüpler çoğu kültürler için çalışıyor. bir sonraki aşamada kullanılan hücreler tam miktarını hesaplamak geri CFU / ml değerleri kullanın. Aşağıdaki adımlar, Aşama 5.3 ile aynı tarihte gerçekleştirilir, ancak hesaplanan mi CFU / değerler, kuluçkadan sonra elde edilir.
4. Adım 5.2 ve 5.3 içinde gece boyunca kültürler ve seyreltme tüpleri kullanılarak, bir V farklı miktarlarda karıştırmak parahaemolyticus zorlanma ve olmayan bir V. parahaemolyticus türleri. Örneğin, V. 10 ^-5 seyreltme tüpünden 500 ul karışımı V. gece boyunca kültürler 500 ul parahaemolyticus metschnikovii.
   NOT: Bu karışım yüksek mikroflora arka plan taklit eder. Düşük mikroflora arka plan simüle iki türün 500 ul 10 ^-5 seyreltme tüpün her karıştırmak için.
5. kromojenik, TCBS ve TSA'larm agar plakaları üzerinde karışımın 100 ul her yayıldı.
6. 35-37 ° C'de inkübasyondan sonra 96 saat kadar V. kolonileri saymayın için parahaemolyticus ve olmayan V. kromojenik ve TCBS agarda büyüme ve koloni morfolojisi onların farkına dayalı parahaemolyticus türler.
   NOT: Örneğin, eğer olmayan V. parahaemolyticus türler tüm kolonileri V. olacak, kromojenik ve TCBS agarda büyümek değil parahaemolyticus. Olmayan V. ise parahaemolyticus türler hem medya yetişir, kromojenik agarda TCBS ve camgöbeği koloniler sadece turkuaz kolonileri V. olacak parahaemolyticus. Olmayan V. parahaemolyticus türler ya da V. benzer koloni morfolojisi sergilemek olmayabilir TSA'larm üzerinde parahaemolyticus.
   1. Olmayan V. ise parahaemolyticus türleri V'a Benzer büyür Bu seçici olmayan ortamda parahaemolyticus, V. numaralarını elde etmek için iki ile koloni sayısı bölmek Sadece parahaemolyticus. Adım 5.3 türetilen beklenen sayısı ile gerçek koloni sayısını karşılaştırın.

6. Effİstiridye homojenatlarma ECTS

1. et ve içki de dahil olmak üzere ≥12 mollusk kabuklu ≥50 g istiridye et tartılır.
   1. istiridye et ve içki PBS eşit miktarda ekleyin. 90 sn için yüksek hızda karışımı karıştırın. Bu 2 ^-1 seyreltilmiş istiridye Homojenat oluşturmaktadır.
   2. PBS 400 g 2 ^-1 seyreltildi istiridye homojenat 100 g ekleyin. kilo değil, hacim ölçmek için bir ölçek kullanın. 1 dakika için yüksek hızda karışımı karıştırın. istiridye Homojenat Otoklav.
      NOT: Bu spiking için kullanılan istiridye Homojenat olacaktır.
2. istiridye homojenat mevcudiyetinde kurtarma deneyi (Aşama 4) tekrar edin.
   1. 500 gr istiridye Homojenat soğuduktan sonra, V. 100 ul ekleyin buna TSBs yetiştirilen gecelik kültürler parahaemolyticus. V. gerçek miktarını belirlemek Adım 4.2 açıklanan Standart Plaka Sayısı prosedürleri yaparak inokulum olarak parahaemolyticus hücreleri.
3. temsilciistiridye homojenat varlığında rekabet analizi (Aşama 5) yer.
   1. 500 gr istiridye Homojenat soğuduktan sonra, V. gecede kültürlerin her ul 100 eklemek parahaemolyticus ve olmayan V. buna parahaemolyticus. Bakteriyel gerçek miktarını belirlemek Standart Plaka Sayısı prosedürleri yaparak inokulum hücreler Adım 4.2 tarif
4. iyi bir homojenleştirici kullanarak istiridye homojenat ile bakteri hücreleri karıştırın.
   NOT: karıştırıldıktan sonra, denir kasıtlı eklenen hücreleri içeren istiridye homojenat istiridye Homojenat çivili.
5. Çivili istiridye Homojenat seyreltileri Aşama 4.2.2'de açıklanan prosedürlere göre 10 ^{-1 -3} 10 seyreltme tüpleri elde edilmesini mümkün kılar. Kromojenik, TCBS ve TSA'lar agara her seyreltme oranından 100 ul yayıldı. 96 adete kadar saat 35-37 ° C'de inkübe edin.
6. eski ile kromojenik ve TCBS agarda gerçek koloni sayısını karşılaştırınbeklenmeyen koloni sayımı 6.2.1 ve 6.3.1 Adımlar çıkarılabilir.
   Not: Örneğin, V bir tüp parahaemolyticus Gece boyunca kültür 10 ⁸ CFU / mL, 100 ul'lik bir aşı 10 ⁷ hücreleri 5 x 10 ⁴ hücre / g, istiridye homojenat 500 g ilave edilir demektir içerir. Seyreltme ve sonra kaplama, plaka df sahip = 10 ^-2 500 koloniler vermelidir; Bu sahip df ise = 10 ^-3 50 koloniler boyun eğmek zorundadır. Bunlar beklenen koloni sayımı vardır.

Results

Bu çalışmada, 54 mikrobiyal soylar V olan 22 suşu olan monte edilmiştir parahaemolyticus türleri, diğer 19 Vibrio türü, 13 dışı Vibrio türü (Tablo 1). Çoğu V. parahaemolyticus suşları ya FDA, CDC ya da diğer devlet sağlık birimlerinden gelen bulundu. Onlar farklı serotipleri ve izolasyon kaynaklarını temsil etmektedir. Bu suşlar, daha önce düzenleyici kurumlar tarafından tespit edilmiştir. Biz ayrıca bu V. kimliklerin...

Discussion

Bu çalışma kültür ortamı geliştirilmesi ve değerlendirilmesi üzerinde duruluyor. Geleneksel olarak, TCBS olan seçici ve orta V izole ve tespit etmek için kullanılan diferansiyel parahaemolyticus, V. cholerae ve V. vulnificus ^12. Ancak, kısıtlamalar gibi V. ayrım yapamama olarak, bu ortam için rapor edilmiştir Diğer Vibrio cholerae türlerden. Sakaroz ve pH göstergesi TCBS farklılaşması maddelerdir. Böylece, sukroz fermentasyon cihazı tarafından asit üretimi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Ekipman< / güçlü >
Agar	Fisher Scientific	DF0140-15-4	diğer markaları kullanabilir
Otoklav	Herhangi bir
BHI tozu	Fisher Scientific	DF0418-17-7	,
istiridye etini karıştırmak için	Blender	Any
CampyGen gazı jeneratör	Hardy Diagnostics	CN035A	mikroaerofilik bir atmosfer sağlamak için; diğer markaları kullanabilir
Çikolatalı agar plakaları	Hardy Diagnostics	E14	diğer markaları kullanabilir
Yaygın PCR reaktifleri (dNTP'ler, MgCl2, Taq Polimeraz)	Herhangi biri		veya PCR boncukları kullanın (Fisher Sci 46-001-014)
Kültür tüpleri	Fisher Scientific	S50712	diğer markaları kullanabilir
Eppendorf tüpleri	Fisher Scientific	S348903	diğer markaları kullanabilir
Jel doc	Herhangi bir
HardyChrom Vibrio agar plakası	Hardy Diagnostics	G319	Bu çalışma bu ortamı değerlendirmektedir
İnkübatör	Herhangi bir
Aşılama döngüsü	Fisher Scientific	22-363-606	Bu çalışmada 10 mikrolitre boyutunda
NaCl	kullanılmıştır Fisher Scientific	BP358-212	diğer markaları kullanabilir
İstiridye	Herhangi bir
PBS	Fisher Scientific	R23701	diğer markaları kullanabilir
Petri kabı	Fisher Scientific	FB0875713	diğer markaları kullanabilir
Pipet ve uçlar	Herhangi bir		Sterilize edilmiş uç
tlh	IDT DNA
	Herhangi bir
Yayıcı	Fisher Scientific	08-100-11	Boncuklar yerine kullanılabilir
Mide blenderi	Mide	400	Numuneler 200 rpm'de 30 saniye boyunca homojenize edildi. Diğer homojenizatörler kullanılabilir.
Karıştırıcılar için steril filtre torbaları	Fisher Scientific	01-812-5
TCBS tozu	Hardy Diagnostics	265020	Bu çalışma bu ortamı değerlendirir
Thermocycler	Herhangi bir
TSB tozu	Fisher Scientific	DF0370-07-5	diğer markaları kullanabilir
UV görüntüleme kabini	Herhangi bir		Yayan uzun dalga UV ışığı
Su banyosu	Herhangi
Name	Sources	Katalog Numarası	Comments
>Bakteri türleri ve suşları
Aeromonas hydrophila	ATCC
em>Candida albicans	ATCC
Campylobacter jejuni	ATCC
em>Escherichia coli	ATCC
em>Proteus mirabilis	ATCC
em>Pseudomonas aeruginosa	ATCC
em>Staphylococcus aureus	ATCC
Salmonella Choleraesuis	ATCC
em>Shigella boydii	ATCC
em>Shigella flexneri	ATCC
Shigella sonnei	ATCC
em>Vibrio alginolyticus	ATCC
V. cholerae (serotipler arasında O139, O1, non O1, El Tor biovars)	FDA, ATCC
em>V. damsela	FDA
V. fisheri	Environment
V. fluvialis	CDC
V. furnissii	CDC
V. hollisae	FDA
V. metschnikovii	ATCC
em>V. mimicus	FDA
V. parahaemolyticus (serotipler arasında O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)	ATCC, FDA, CDC, Environment
V. proteolyticus	FDA
V. vulnificus	FDA