Aşağıdaki rapor, uygun boya, kontakt lens ve lazer parametreleri kullanılarak nonarteritik anterior iskemik optik nöropatinin (rNAION) kemirgen modelinin nasıl çoğaltılacağını açıklamaktadır. Ayrıca rNAION lezyonunu in vivo olarak değerlendirmek için uygun adımları da ortaya koyuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Nonarteritik Anterior İskemik Optik Nöropati Kemirgen Modeli (rNAION)
Bu makalede
Özet
Özet
Nonarteritik anterior iskemik optik nöropati (NAİON), optik sinirin 1/700 bireyi yaşamları boyunca etkileyen fokal iskemik bir lezyondur. NAION, optik sinir ödemi, retinal ganglion hücre nöronlarının (RGC'ler) seçici kaybı ve optik sinirin atrofisi ile sonuçlanır. Hem sıçanlar hem de fareler için geçerli olan, çoğu NAION özelliğini ve sekelini ifade eden bir NAION kemirgen modeli geliştirilmiştir. Bu model, hedeflenen ön optik sinirde (laminer bölge) kılcal hasara ve sızıntıya neden olmak için fotoaktif bir boya olan Rose Bengal'i (RB) aydınlatmak için 532 nm dalga boyunda bir odak lazer uygulaması kullanır. rNAION indüksiyonundan sonra erken optik sinir iskemisi, optik sinir ödemi ve intranöral inflamasyon, ardından seçici RGC ve aksonal kayıp olur. Optik sinir bir CNS beyaz cevher yolu olduğundan, rNAION modeli, seçici beyaz cevher iskemisi ile ilgili mekanik çalışmalara, ayrıca nöroprotektif analizlere ve iskemiye glial ve nöronal yanıtın kısa ve uzun vadeli mekanizmalarına uygulanabilir.
Giriş
Nonarteritik anterior iskemik optik nöropati (NAİON) optik sinir (ON) 1 ön kısmının fokal iskemik lezyonlardır. NAİON mekanizması intranöral ödem sonuçlanan bir kompartman sendromu olduğuna inanılmaktadır. 50 2 yaşın üzerindeki kişilerde ani optik sinir bağlı görme kaybının en sık nedenidir ve optik sinir içinde aksonlar temin kılcal damarların sıkışmasına neden olmaktadır 3..
AÇIK aslında bir merkezi sinir sistemi (MSS) yolu olduğundan, kemirgen NAİON (rNAION) modeli izole MSS beyaz cevher vuruş mekanizmaları ve yanıtları incelemek için kullanılabilir. rNAION modeli bu nedenle beyaz cevher inme ile ilgili hasar ile ilişkili pek çok sorun diseksiyon yararlı olabilir. Beyaz madde darbesi esnasmda farklı nöro-koruyucu strateji ve maddeleri değerlendirmek için de kullanılabilir.
Modelin en çekici özelliklerinden biri olmasıdırağrısız, non-invaziv prosedür. lazer gücü iskemik hasar çeşitli seviyesi sağlamak için ayarlanabilir. Bir başka özelliği de ilerici bir kılcal disfonksiyonu üreten kılcal endotel hasar lazer kaynaklı süperoksit radikalleri dayanıyor olmasıdır. Bu NAION neden mekanizmasına oldukça benzer olduğuna inanılan bu disfonksiyon ve ilerici ödem olduğunu. Araştırma doğrudan kılcal pıhtılaşma neden olmadığını göstermiştir, ancak en az iki mekanizma ile çalışır etti: süperoksit bağlı ölüm ve kılcal bazı sıyırma endotelial hücreler 4, ve aktive edilmiş B hücreleri NFkB (Nükleer Faktör kappa hafif zincir-güçlendirici interstisyuma 5 içine hücre zarları arasında sıvı geçişini arttı ile), endotel kalan kadar inflamatuar düzenleme ilişkili. optik sinir başı iskemi interstisyel sıvı birikimi sonucu yol açtığı optik sinir kılcal damarların ve sıkıştırma kapatılması. Şematik resim gösterilirŞekil 2. RNAION model hem sıçan ve fare türleri 6,7 kullanılabilen ve optik sinirin tam ama ağrısız yıkım ve retina, örneğin hafif bir lezyondan, şiddeti seviyesinde değişebilir santral retinal arter tıkanıklığı (SRAT) olarak.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
(; Baltimore, MD, ABD IACUC) Bu protokol Maryland Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylandı
1. Deney Seti-up
- 3 mm kalınlığında çapı Pleksiglas net bir optik dereceli dairesel 7 mm den özel olarak tasarlanmış kontakt lens olun. Bir matkap basın ile yuvarlak lensler kesti. İç eğri yapmak için standart bir matkap ucu kullanın ve nihayet ultra-ince kum (1000/3000) bir kontakt lens parlatıcı kullanarak dış ve iç eğrileri lehçe.
- Önceden pH 7.4 fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2.5 mM Rose Bengal (RB) hazırlanması, filtre 6 aya kadar bir ışık geçirmez bir kap içinde bir 0.45 u'luk şırınga filtre ve mağaza -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler ile sterilize edin.
NOT: Sprague Dawley olarak albino outbred erkek hayvanların kullanımı suşu bağımlı yanıt farklılıkları en aza indiren indüksiyon artan kolaylığı sağlayan ve östrus halkalandırma yapılmasından oluşabilir değişkenliği azaltırng kadın. - kurmak frekans Neodimyum-Alümoitri granat bir 532 nm lazer ışığı üretir (Fd-YAG) oftalmik medikal lazer, iki katına çıktı. Standart bir göz lazer adaptörü kullanarak bir Haag-Streit oftalmik yarık lamba lazer monte edin. Bu piyasada mevcut cihaz hayvanın göz ve lazer nokta uygulamasının eşzamanlı görselleştirme sağlar. tıbbi lazer de uygun lazer indüksiyon aynı nokta boyutunu kullanarak odaklama ve sentrasyonu için bir hedef ışın vardır. aşağıdaki gibi lazer güç parametreleri şunlardır:
- Sıçan rNAION indüksiyon için: 500 mikron spot büyüklüğü / 50 mW lazer güç / 1000 milisaniye süre / 1000 milisaniye aralığı kullanınız.
- Fare rNAION indüksiyon için: küçük optik disk 300 mikron spot boyutunu değiştirmek ve sıçan ayarı gibi diğer parametreleri aynı bırakın.
- Rutin lazer güç çıkışını sağlamak için bir lazer güç metre kullanın.
2. Deneysel Prosedür
- lazer gücü açınve uygun lazer parametresini ayarlayın. Kullanmadan önce en az beş dakika süreyle lazer ısıtın.
- ketamin / iksilazin ve RB boya için uygun dozu belirleyecektir hayvan tartılır. 80 mg / ml ketamin ve 4 mg / ml ksilazin 1 ml / kg karışımın peritoneal içi enjekte hayvansal anestezisi.
- Tamamen anestezi kadar ısıtılmış kafeste hayvan bırakın. caydırıcı uyaranlara (kuyruk veya ayak tutam) için herhangi bir yanıt olup olmadığını kontrol edin. anestezi derinliği her 10 dk için hayvanları kontrol edin.
- % 1 tropikamid ile hayvanın öğrencileri dilate ve% 0.5 proparakain ile gözün yüzeyini uyutmak. Böyle Uzun Evans gibi pigmentli hayvanlar, kullanılıyorsa,% 2.5 neosynephrine göz damlaları öğrenci dilatasyon artacaktır.
- tarafında namlu yakın bıyıkları görünümü engelleyen uyarılan edilecek kesmek için makas kullanın.
- % 1 metilselüloz veya ısmarlama kontakt lens içine diğer oftalmik bağlantı damla bir damla koymak ve daha sonra t üzerine lensi uygulamakSıçan gözü o.
- biyomikroskopta yüksekliği ayarlanabilir bir platformda hayvan yerleştirin. Göz yarık lamba ve lazer ışınına dik olacak şekilde 45 ° 'lik açıyla hayvanın kafasını ayarlayın.
- oftalmik yarık lamba ile göz gözünüzde canlandırın. odaklı ve görüntülenmiştir optik sinire doğrudan merkezli olarak emin amaçlayan kiriş sağ boyutu da olduğundan emin olun. Bir özel yapılmış adaptör ile yarık lamba göz parçalardan biri üzerine monte sürat - yüksek ASA (2.000 1.200) ile bir dijital kamerayı kullanarak retina fundus fotoğraf.
NOT: koroid damarları görme yeteneği retinanın şeffaflığını ortaya koymaktadır. Bu ortaya çıkarsa yorumunu karıştırabilir ki, daha sonra retina iskemi tespit edebilmek için önemli bir işaretidir. rNAION retina hasarı retinal iskemi sonuçlar iç retina tabakaların tüm hücreler etki ederken, izole edilmiş RGC kaybına neden optik sinir iskemi vardır. - İsteğe bağlı olarak, daha fazla görüntü retinaun kaynaklı göz değerlendirmek için bir spektral domain-OCT (SD-OCT 8) kullanılarak optik sinir. Retina (Şekil 3C) vasıtasıyla yüze (Şekil 3B) ve 7 kesit taramalar en tarar. SD-OCT görüntüleme lazer indüksiyonu için kullanılan aynı kontakt lens kullanır.
- 1 ml / kuyruk damarından üzerinden kg RB enjekte ve 30 saniye için, daha sonra lazer gücü aktif bekleyin. Bu gecikme süresi dolaşımı boyunca eşit dağıtmak için RB sağlar. Biz bir sn / darbe bir 50 mW lazer darbesi kullanın. Büyükşehir enerjiler (≥ 60 mW) retinaya zarar veya retinal vasküler iskemi neden olabilir.
Dikkat: emin olun herkes kaçak lazer ışığı araştırıcı göze giren önlemek için uygun engelleme dalga boyunda lazer güvenlik filtreleme gözlük bir çift vardır.
NOT: boya dolaşımdan hızla elimine edilir çünkü lazer idaresi IV RB enjeksiyonundan sonra hızla verilmelidir. uzun lazer indüksiyon, daha şiddetli optik sinir iskemi. Bir peş peşe 12 sn darbeleri - Genellikle, hayvanlar 7 verilmiştir. Dolaşan boya ile lazer ışığının temas optik sinir gemilerin biyomikroskopta (Şekil 4B) aracılığıyla görülebilir güzel bir altın bir parlaklık kazandırır. Bu boya sistemik enjekte ve kan dolaşımına dağıtıldı kanıtlıyor. Kızdırma tüm (Şekil 4A) de soluk veya hiçbiri değilse, boya damar içine enjekte değildi. hayvan reenjeksiyon önce en az iki gün boyunca kurtarmak gerekir çünkü bu durumda, hemen ikinci bir enjeksiyon vermeyin. - Hemen indüksiyon sonrası, kontakt lens çıkarın. deksametazon ile oftalmik üçlü antibiyotik (Neosporin / polimiksin / basitrasin) merhem her iki göz kapağı ve tam iyileşme kadar yakın gözlem altında tek bir yer kafes içinde 37 ° C ısınma pad üzerinde hayvan yerleştirin.
- w distile ile kontakt lens temizlemebırakmayın ileride kullanmak üzere aşındırıcı olmayan bir temizlik bezi ile kurulayın ve.
- Indüksiyon iki gün sonra fundus renkli fotoğraf ve SD-OCT analizi 8 hem optik sinir ödemi değerlendirmek.
NOT: Optik sinir ödemi derecesini karşılaştırılması optik sinir iskemi şiddetinin bir tahmin verir. iki gün, optik sinir diski marjı bulanık ve retina damarları biraz kontralateral (un-kaynaklı) göz ile karşılaştırıldığında, dilate edilir. Iki ve dört hafta elektroretinografi (ERG) ve uyarılmış potansiyel (VEP 11) görsel flaş gerçekleştirin elektrofizyoloji analizi için indüksiyon sonrası.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kontakt lens özellikli santral retina görselleştirme (Şekil 1). Fokal lazer nokta retinanın arkasında optik disk (Şekil 2) yanar. Normal un kaynaklı retina yarık lamba biyo-mikroskop (Şekil 3A) tarafından ve SD-OCT (Şekil 3B ve 3C) tarafından görüntülendi gösterilmiştir. Hiçbir boya maddesinin dolaşımda mevcut olduğu zaman lazer İndüksiyon sırasında, lazer ışığı kabı ve disk floresan (Şekil 4A) ile...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Optik sinir hasarı (optik sinir ezilme 12, optik sinirin 13 ve PION 14) modelleri bir dizi varken, rNAION modeli, sıçan ve fareler hem de uyarlanabilir insancıl olduğunu. Daha yakın NAION insan klinik durumunu andırmaktadır. Bu durum uzun bir süre boyunca progresif ön optik sinir ödemi, anterior optik sinir kompartman sendromu, fokal akson iskemi, izole retina ganglion hücre akson hasarı ve kaybı içerir. Mevcut rapor, rNAION indüksiyon için uygun adımları sağlar indüksiyon sırasında olas...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz bu model üzerinde çalışmış birçok öğrenci ve arkadaşlarının kendi etkinliğini artırmak için, ve mekanizmalarını anlamak için teşekkür ederiz. Özel teşekkür Dr adlı kaynaklanmaktadır. Mary Johnson (Maryland Baltimore Üniversitesi), Nitza Goldenberg-Cohen (Schneiderman Çocuk Hastanesi, Petah-Tikva, İsrail), Charles Zhang (Einstein Tıp Koleji, Bronx, NY) ve Valerie TOUITOU (Hopital Salpetrie, Paris, Fransa). Bu çalışma SLB için RO1 EY015304 kısmen finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 50 mW 532 nm lazer | Iridex | Standart Oftalmik Lazer | |
| 0 - 100 mW 532 nm lazer | Laserglow teknolojileri | iridex | |
| Lazer yarık lamba adaptörü | Iridex | SMA bağlantılı adaptör Termopil | |
| sensörlü tutarlı Fieldmate lazer metre | Tutarlı | diğerleri de uygun | |
| Oftalmik İnceleme Yarık lamba biyomikroskobu | Çeşitli | Haag-Streit en iyisidir; ebay'de daha ucuz versiyonlar mevcuttur | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Fotoindükleyici ajan |
| Fundus Kontakt lens veya cam kapak kayması | özel/Cantor ve Nissel (İngiltere) | Göz muayenesi ve indüksiyon için özel tasarlanmış planokonveks plastik lens | |
| Tropikanamid % | |||
| 1Tamiya parlatma bileşiği | Tamiya, INC | 87068 | parlatma kontakt lensi |
| %2,5 Hipromelloz (Goniovisc)/%1 Methycellulose | HUB İlaç | kontakt lens birleştirme maddesi | |
| %2,5 Neosinefrin Oftalmik damla | Alcon labs | göz bebeği genişletici ajan | |
| Tropicamide %1 | Alcon labs | öğrenci genişletici ajan | |
| %0,5 Proparakain | Alcon labs | topikal Anestezik | |
| 30 G sigortalı iğne insülin şırıngası | Gül | bengal intravenöz enjeksiyonu için | Çeşitli |
| Deksametazon eklenmiş Oftamik Antibiyotik merhem (Üçlü antibiyotik merhem) | Çeşitli | Çeşitli | Kornea yara izini en aza indirmek için indüksiyondan sonra uygulayın |
| Heidelberg Corporation Spektral alan-Optik Tutarlılık Tomografi | Heidelberg Optik | tutarlılık ölçümleri için Corporation taban çizgisi ve indüksiyon sonrası; indüksiyon için gerekli değildir |
Kaynaklar
- Banik, R. Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy: An Update on Demographics, Clinical Presentation, Pathophysiology, Animal Models, Prognosis, and Treatment. J. Clin. Experimental Ophthalmol. 10, 1-5 (2013).
- IONDT study group. Characteristics of patients with nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy eligible for the Ischemic Optic Neuropathy Decompression Trial. Arch Ophthalmol. 114, 1366-1374 (1996).
- Tesser, R. A., Niendorf, E. R., Levin, L. A. The morphology of an infarct in nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Ophthalmology. 110, 2031-2035 (2003).
- Bernstein, S. L., Johnson, M. A., Miller, N. R. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) and its experimental models. Prog Retin Eye Res. 30, 167-187 (2011).
- Nicholson, J. D., et al. PGJ2 Provides Prolonged CNS Stroke Protection by Reducing White Matter Edema. PLoS One. 7 (12), (2012).
- Goldenberg-Cohen, N., et al. Oligodendrocyte Dysfunction Following Induction of Experimental Anterior Optic Nerve Ischemia. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 2716-2725 (2005).
- Bernstein, S. L., Guo, Y., Kelman, S. E., Flower, R. W., Johnson, M. A. Functional and cellular responses in a novel rodent model of anterior ischemic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 4153-4162 (2003).
- Berger, A., et al. Spectral-Domain Optical Coherence Tomography of the Rodent Eye: Highlighting Layers of the Outer Retina Using Signal Averaging and Comparison with Histology. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Huang, T. L., et al. Protective effects of systemic treatment with methylprednisolone in a rodent model of non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Exp Eye Res. 131, 69-76 (2015).
- Mantopoulos, D., et al. An Experimental Model of Optic Nerve Head Injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, 6222(2014).
- You, Y., et al. Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination. J. Vis. Exp. (101), e52934(2015).
- Templeton, J. P., Geisert, E. E. A practical approach to optic nerve crush in the mouse. Mol Vis. 18, 2147-2152 (2012).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System. J Vis Exp. (51), e2241(2011).
- Wang, Y., et al. A Novel Rodent Model of Posterior Ischemic Optic Neuropathy. JAMA Ophthalmol. 131 (2), 194-204 (2013).
- Huang, T. L., Chang, C. H., Chang, S. W., Lin, K. H., Tsai, R. K. Efficacy of Intravitreal Injections of Antivascular Endothelial Growth Factor Agents in a Rat Model of Anterior Ischemic Optic Neuropathy. IOVS. 56, 2290-2296 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
