Yöntem makalesi

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

DOI:

10.3791/54517

⸱

10 Eylül 2016

 ,  , 
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II, RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu memelide, vomeronazal organ (VNO) hem hetero hem de spesifik sosyal ipuçlarını tespit eden kemosensoriyel bir yapıdır. Vomeronazal duyusal nöronlar (VSN'ler), kemosensör ipuçlarının hassas ve spesifik tespitine izin veren en az üç farklı kemoreseptör gen ailesinden spesifik bir G proteinine bağlı reseptör (GPCR) tipini eksprese eder. Bu aileler, V1r ve V2r gen ailelerinin yanı sıra varsayılan kemoreseptör genlerinin formil peptit reseptörü (FPR) ile ilişkili dizi (Fpr-rs) ailesini içerir. Vomeronazal reseptör-ligand etkileşimlerinin ve aşağı akış sinyalizasyonunun fizyolojisini anlamak için, her bir spesifik VSN sınıfına özgü biyofiziksel özellikleri tanımlamak önemlidir.

Burada açıklanan fizyolojik yaklaşım, transgenik bir fare hattı (Fpr-rs3-i-Venüs) kullanarak tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin verir. Bununla birlikte, bu protokolün kullanımı, bu spesifik hatla sınırlı değildir ve bu nedenle, diğer genetik olarak değiştirilmiş hatlara veya vahşi tip hayvanlara kolayca genişletilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir.

VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ​​ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin.

Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 . Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi.

Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 hafta) kullanıldı. Hiçbir belirgin cinsiyet bağımlı farklılıklar gözlenmiştir.

1. Solüsyon Hazırlama

  1. Hücre-dışı solüsyon S 1 hazırlanması: 4- (2-Hidroksi-etil) -piperazin-1-etansülfonik asit 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, (mM olarak) ihtiva eden hücre-dışı çözelti tamponlu (HEPES); pH = 7.3 (NaOH ile ayarlanır); (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm.
  2. ekstraselüler hazırlayınlar Çözelti 2: karbojen oksijenli (% 95 O2,% 5 CO2) CaCl2, 1 MgSO 4 125 NaCl, 25 (mM olarak) NaHCO 3, 5 KCl, 1 ihtiva eden hücre-dışı çözelti 5 BES; pH = 7.3; (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm.
  3. Doku yerleştirilmesi için% 4 düşük jelleşme sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisi (S3) hazırlayın:% 4 düşük jelleşme sıcaklığı agaroz. 2 g bir manyetik karıştırıcı ile birlikte 100 ml'lik bir cam şişe içinde laboratuar S 1 50 ml agaroz düşük jelleştirme eritin. agaroz eriyik için, yaklaşık 20 dakika boyunca ya da çözelti karıştırılırken saydam hale gelinceye kadar 70 ° C'de (kapağın sıkı bir şekilde kapatılmamış olan) bir su banyosu içinde bir şişe yerleştirin. soğutun ve sonraki kullanıma kadar 42 ° C 'de, ikinci bir su banyosu içinde eritilmiş agaroz tutun.
  4. Hücre-içi solüsyon s, 4 hazırlayın: Pipet çözelti 2 (serbest Ca2 + = 110 nM) 1 EGTA 143 KCI, 2 KOH, 0.3 CaCl, 10 HEPES, 2 MgATP (mM olarak), 1 NaGTP;pH = 7.1 (KOH ile ayarlanmıştır); osmolarite = 290 mOsm.
  5. / Değiştir S 1 kompozisyonunun ayarlanması, bireysel deneysel tasarım (örneğin, farmakolojik blokerler gerilim aktive akımları belirli türleri izole etmek) göre S 2 ve S 4.

2. Çalışma Alanı Hazırlığı

  1. Sıcaklık ve pH ayarlaması ve sürekli oxygenate çözüm için buz üzerinde S 2, en az 30 dakika önce diseksiyon, yer dilim depolama odasını oksijenlendirdikten doldurun.
  2. S 2 ile kayıt ayarları da dilim süperfüzyomu için doldurun ve sürekli oksijen.
  3. Diseksiyon önce S 2 ile vibratome bölmeyi doldurun ve odanın etrafında ezilmiş buz düzenlemek. Alternatif olarak, vibratome odasına odasını oksijene yedek buz oksijenli çözümü transferi ve sürekli oksijenlendirdikten tutun.
  4. cerrahi aletleri ve sarf düzenleyin.
  5. diseksiyon altında buz jel paketi yerleştirinmikroskop, çanak alt donmaya karşı VNO doku önlemek için bir kağıt havlu ile kaplayın.
  6. Kısaca,% 70 etanol ve distile su ile durulama ve vibratome monte temizleyin traş makinesi bıçak. Her dilimleme oturumu için değiştirin.

3. VNO Diseksiyon ve katıştırma

  1. CO 2 ve keskin cerrahi makas kullanarak başını kesmek için kısa maruz bırakılarak hayvan kurban. Not: kritik buz üzerinde VNO kapsülü koyarak hayvan ödün zaman olduğu gibi, en az 2 dk süreyi en aza indirmek. doku canlılığını muhafaza etmek için, en az 30 dakika içinde agaroz de tamamen Dissected VNOs yerleştirin.
  2. Büyük cerrahi makas ile alt çene çıkarın. Ağız boşluğu ile girmek ve ayrı ayrı her tarafında mandibula kemik ve kas kesti.
  3. başaşağı büyük Petri kabındaki başın kalan kısmını yerleştirin.
  4. üst çene ve daha rahat erişmek için orta forseps ile burun ucu çevresindeki deri çekmeyekesici dişler.
  5. Rostral yönde (Şekil 1A) bir ~ 45 ° 'lik açıyla kesici dişlerin en büyük kısmını kesip kemik makas kullanın. Bu burun boşluğundan VNO kapsülün çıkarılması kolaylaştıracaktır.
    Not: VNO kapsülün ucu zarar görmesini önlemek için dişin köküne kesmeyin.
  6. Orta forseps ile rostral kısmında sert üst damak tut ve dikkatli bir düz açı (Şekil 1B) geri tek parça halinde soyun.
    Not: Tekrar tekrar buz gibi soğuk S 2 ile durulayın.
  7. vomer kemik ve çene ucu arasındaki kemik füzyon kesmek için mikro yaylı makas kullanın. VNO kapsüle sol ve sağ taraf yanal hem de küçük adımlar halinde kemiğin kesilmesi dışarıya doğru VNO gelen ve dikkatli bir şekilde işaret ucunun eğri kısmı ile makas ipuçları yerleştirin.
  8. VNO kapsülü çıkarmak için, kaudal kısmında vomer kemiği kesmek için mikro yaylı makas kullanın ve dikkatli n dışarı vomer kemiğini kaldırınorta forseps kullanarak asal boşluğu. Hemen diseksiyon kalan adımlar gerçekleştirilir bir buz jel paketini bir stereo mikroskop altında küçük bir petri tabağına VNO aktarın.
  9. Kurumasını önlemek için doku buz soğukluğunda S 2. Alanın küçük bir miktarda VNO durulayın.
  10. orta forseps ile vomer kemiğin arka kapma VNO yumuşak dokuları ihtiva kıkırdak kapsül ayırın. Her iki VNOs arasındaki bölünmüş (Şekil 1D i) görünür hale gelmesi için dorsal görünümü için kapsül yerleştirin.
  11. Arka kısmında aşağı tuş vomer kemik tutarken merkez kemikten hem kıkırdak VNO kapsülleri ayırmak için ince forseps ucu kullanın.
    Not: Sadece kıkırdak kapsülün RIM forseps kullanın ve narin duyusal epitel kolayca zarar olarak kıkırdak delip için çok dikkatli olun.
  12. İki VNOs ayrılır sonra, köknar encapsulating kıkırdağı kaldırarak başlamakt VNO.
  13. bir ince forseps ile kapsülün üst çemberinin tut ve daha önce vomer kemik (medial tarafı) bağlı olduğu kıkırdak duvar uzak ayrıldı.
  14. kıkırdak çanak alt kavisli yan tarafı ile VNO çevirmek ve güvenli forseps kullanarak bir tarafta kıkırdak aşağı pin kalan kaldırmak için. Dikkatle doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için kıkırdak ve VNO arasında bir çok düz açıyla arka tarafında ikinci ince forseps taşıyın.
  15. Yavaş yavaş duyusal epitel zarar vermemek için, kendi kaudal ucunda tutarak uzak kıkırdaktan VNO soyma.
  16. VNO kapsülden levered sonra, dilimleme işlemi sırasında agaroz çevredeki doku ayırmak olacaktır kıkırdak kalan parçaları olarak kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını kaldırmak için emin olun.
  17. Doku hasarını önlemek için ilk Dissected VNO buz-soğuk 2 küçük bir damla koyun. lateral yan Wil ilgili büyük bir kan damarıl organı hala bozulmamış ve fena halde diseksiyon (Şekil 2A ii) sırasında zarar olmadığını belirten görünür hale gelir. kan damarı hasar var bu durumda, hala sürece genel morfolojisi açıkça düşüklüğüne uğramamış gibi VNO dilimleme ile devam etmek faydalı olacaktır.
  18. Hemen ikinci VNO teşrih.
  19. VNOs yerleştirmek için, erimiş S 3 ağız hem de kültür kaplarına dolgu (42 ° C'de su banyosu içinde depolanmış, 1.3).
  20. duyusal epitel zarar vermemek için ince forseps ile geniş kaudal ucunda VNO tutun.
  21. agaroz VNO daldırın ve ekstrasellüler çözüm filmi yanı sıra yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için ileri geri yatay birkaç kez hareket ettirin.
  22. çanak alt bakan kaudal ucu ile dikey VNO yerleştirin. Bunun yerine, doğrudan forseps ile VNO kısma ait, yakın Proximi forseps ucu hareket ettirerek yönünü ayarlamakVNO için ty.
    Not: Deney sırasında duyusal nöronlar dilim uçağı ve erişilebilirlik belirler olarak gömme sırasında Oryantasyon önemlidir.
  23. jel buz paketi üzerinde yemekleri yerleştirin ve Agaroz katılaşmış kadar bekleyin.
    Not: Agaroz bu çevredeki agaroz doku ayırmak gibi katılaşan başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin.

4. Koronal VNO Doku Dilimleme

  1. Büyük bir Petri kabı kapağının içine küçük çanak agaroz blok kaldırmak için küçük bir spatula kullanın, baş aşağı yukarı bakacak VNO kaudal ipucu bırakarak agaroz çevirin.
  2. cerrahi neşter (ucunda 3-4 mm, altta 8-10 mm) kullanılarak bir piramit şekline blok kesin. Gömülü doku zarar vermemeye özen gösterin.
  3. vibratome numune plakasının merkezine piramit şeklindeki blok düzeltmek ve yapıştırıcı tamamen kurumasını için ~ 1 dakika beklemek zorunda süper yapıştırıcı kullanın.
  4. dilimleme c numune plaka aktarınhamber ve buna bağlı olarak ikinci bir VNO hazırlar. kullanılana kadar 4 ° C, ikinci örnekle plaka tutun.
  5. kalınlığı: Aşağıdaki ayarlara sahip bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın 150-200 mikron; Hız: 3.5 au = 0,15 mm / sn; Frekans: = 75 Hz 7,5 au. kısaca Diseksiyon mikroskobu altında dilim morfolojisi inceledikten sonra kullanıma kadar oxygenating odasına dilim aktarın. Dilimler birkaç saat boyunca muhafaza edilebilir.

5. Tek hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar

  1. kayıtlar için, suya daldırma amaçları, Dodt ya da kızıl ötesi ayırıcı müdahale kontrast (IR DIC) ve epi-floresan gibi soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir dikine duran aşamalı mikroskop kullanımı. veri toplama için bir yama-kelepçe amplifikatör, kafa sahne, AD / DA arayüz kartı ve (kayıt yazılımı dahil) bir PC kullanın.
  2. 10-20 yama pipetler (4-7 MQ) bir stok hazırlayın. borosilikat cam kılcal damarlardan çekme pipetler (1.50 mm OD / 0.86 mm ID) istimalBir Microforge ile ga mikropipet çektirmesi ve yangın lehçe.
    Not: oldukça küçük VSNs yama yaparken Yangın pipet uçları parlatma önemlidir. Bu durum, yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için negatif basınç uygulanırken, hücre zarını önlemek için yararlı olacaktır. Pipet açılışı parlatma sonra yaklaşık 1 mikron olmalıdır.
  3. kullanana kadar hasar ve toz birikmesini önlemek için bir pipet depolama kavanoz pipetler tutun.
  4. çözüm rezervuarları doldurma ve deneysel tasarım göre tüp ile perfüzyon sistemi hazırlayın.
    Not: güçlü elektrofizyolojik kayıtlar engel olacak şekilde tamamen tüp içindeki hava kabarcıklarını çıkarın.
  5. ~ 3 ml / dakika akış elde etmek için basınç ayarlayın.
    Not: Yüksek basınç elektrofizyolojik kayıtlar doku dilim hareketini yanı sıra fesih neden olacaktır.
  6. görüntüleme odasına VNO dilim aktarın ve 0.1 mm kalınlığında synt ile kablolu paslanmaz çelik çapa kullanarak dilim pozisyonunu düzeltmekinfographie lifler (Şekil 2B - C).
    Not: sentetik elyaf ipliklerin biri değil dilim çevreleyen agaroz ile doku dilim örtmeyin.
  7. Banyo uygulaması aracılığıyla oda sıcaklığında oksijenli S 2 ile kurulum ve sürekli Superfuse dilim kayıt Transfer görüntüleme odası.
  8. Banyo çözeltisinin sürekli bir değişim için yavaş bir emme oluşturmak için çözeltinin yüzeyine emme kılcal ayarlayın. 8-in-1 çoklu varil "perfüzyon kalem" yukarıda ve kan damarı (Şekil 2C, 3A) 50 içeren VNO dilim olmayan duyusal kısmına yakın ayarlayın. Zıt yönlerde gelen dilim dönük olması perfüzyon kalem ve kayıt pipet düzenlemek için yararlı olacaktır.
  9. Referans elektrodu ve (150 mM KCI ile dolu), L-şeklinde bir agar köprü kullanılarak banyo çözeltisi bağlayın.
  10. Pipet çözüm S 4 ile yama pipet doldurun.
  11. kaplama kapalı kazıma olmadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı yama elektrot üzerinde pipet montaj ve sıkıca takın.
  12. hafif pozitif basınç uygulayın (yaklaşık 10 ml plastik şırınga 1 ml) banyo girmeden önce yama pipet.
  13. (Şekil 2B) onu vurmadan hedefi batığın edebilmek için yeterince mikro manipülatörler kullanarak banyoya pipet indirin.
  14. Baş aşamasına bağlı elektrofizyoloji yazılımı kullanarak (4-7 MQ arasında R pip) pipet direnci izleyin.
    Not: R pip ise <4 MQ cam ucu kırıldı. R pip> 10 M? Ise, uç büyük ihtimalle tıkalı ve pipet değiştirilmesi gerekir.
  15. Kızılötesi optimize edilmiş diferansiyel girişim kontrast (DIC) kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilim görselleştirmek ve floresan aydınlatma kullanılarak FPR-RS3-i Venüs (benzer etiketli nöronların veya) hücreleri ifade eden tanımlamakve uygun bir filtre küpü.
  16. Odak ve hedef floresan veya floresan olmayan hücrelerin deneysel tasarım bağlı.
  17. hücre gövdesi yaklaşmak için, maksimum duyarlılık el tekerlekleri kullanın. Pipet yakın olduğunu bir kez pozitif basınç nedeniyle, hücre soma zarında küçük bir göçük görünür hale gelir.
  18. pozitif basınç bırakın ve yüksek direnç mühür (1-20 GΩ) elde etmek için, hücre zarındaki emmek için hafif negatif basınç uygulayın. hücre zarı bozar ve tam hücreli yapılandırmasını kurmak için kısa ve nazik vakum uygulayın.
  19. deney sırasında sürekli erişim direnci izleyin.
    Not: Sadece küçük ve istikrarlı bir erişim direnci sergileyen nöronlar (R girişinin ≤3%; değişimi

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) 'de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağlar. Biz burada bir transgenik fare mod...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. reseptör-ligand ilişkileri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FPR-rs3-i-venus fare serisini oluşturdukları, yapıcı eleştirileri ve verimli tartışmaları için Ivan Rodriguez ve Benoit von der Weid'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Volkswagen Vakfı (I/83533), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) ve Alman federal ve eyalet hükümetlerinin Mükemmellik Girişimi tarafından finanse edilmiştir. MS, Volkswagen Vakfı'nın Lichtenberg Profesörüdür.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kimyasallar< / güçlü >
Agaroz (düşük jelleşme sıcaklığı)PeqLab35-2030
ATP (Mg-ATP)Sigma-AldrichA9187
Bis (2-hidroksietil) -2-aminoetansülfonik asit (BES)Sigma-AldrichB9879
Kalsiyum klorürSigma-AldrichC1016
Etilen glikol tetraasetik asit (EGTA)Sigma-AldrichE3889
GlikozSigma-AldrichG8270
GTP (Na-GTP)Sigma-Aldrich51120
(2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)Sigma-AldrichH3375
Magnezyum klorürSigma-AldrichM8266
Potasyum klorürSigma-AldrichP9333
Potasyum hidroksitSigma-Aldrich03564
Sodyum klorürSigma-AldrichS7653
Sodyum hidrojen karbonatSigma-AldrichS5761
Sodyum hidroksitSigma-AldrichS8045
NameCompanyKatalog NumarasıComments
Cerrahi aletler ve sarf malzemeleri
Büyük Petri kabı, 90 mmVWRdekapitasyonu, VNO kapsülünün diseksiyonu
Küçük Petri kabı,VWRkapağı, agaroz içine gömmek için çanak
Keskin büyük cerrahi makasGüzel Bilim Aletlerikesme, alt çenenin çıkarılması
Güçlü kemik makasıGüzel Bilim Aletlerikesici dişler
Orta forseps, Dumont cımbız #2ve damağı çıkaranGüzel Bilim Aletleri
Mikro yaylı makas, 8,5 cm, kavisli, 7 mm bıçaklar VNO'yu kesenGüzel Bilim Araçları
İki çift ince forseps, Dumont cımbız #5VNO'yu kıkırdaklı kapsülden çıkaranGüzel Bilim Araçları
Küçük paslanmaz çelik spatulaAgaroz bloğu ve doku dilimlerini işleyenBilim Araçları
Cerrahi neşteragaroz bloğunu piramidal şekle kesme
< güçlü > < / güçlü > <güçlü > < / güçlü >Katalog NumarasıComments
Equipment
AmplifierHEKA ElektronikEPC-10
Borosilikat cam kılcal damarlar (1.50 mm OD / 0.86 mm ID)Bilim Ürünleri
CCD kameraLeica MicrosystemsDFC360FX
Filtre küpü, uyarma: BP 450-490, bastırma: LP 515Leica MicrosystemsI3
Floresan lambaLeica MicrosystemsEL6000
Sıcak plaka manyetik karıştırıcıSnijders34532
Microforge NarishigeMF-830
Mikromanipülatör Cihazı Luigs & NeumannSM-5
Mikropipet çektirme, dikey iki kademeliNarishigePC-10 
MikroskopLeica MicrosystemsCSM DM 6000 SP5
Gürültü giderici 50/60 Hz (HumBug)Quest Scientific
Objective Leica MicrosystemsHCX APO L20x/1.00 W
OsiloskopTektronikTDS 1001B
Ozmometre GonotecOsmomat 030
Perfüzyon sistemi 8'i 1 aradaAutoMate Scientific pH
Metre beş kolayMettler Toledo
Pipet saklama kavanozuWorld Precision Instrumentse212
Kayıt odası Luigs & NeumannDilim mini haznesi
Tıraş bıçaklarıWilkinson Kılıç GmbHWilkinson Kılıç Klasik
Oksijenli dilim saklama odası; Alternatif ticari odalar şunlardır: örneğin , BSK1 Beyin Dilimi Tutucu (Digitimer) veya Ön Bölme (BSC-PC; Warner Instruments)ısmarlama
Stereo mikroskopLeica MicrosystemsS4E
Tetik arayüzü HEKA ElektronikTİB-14 S
Vibratom Leica MicrosystemsVT 1000 S
Su banyosu MemmertWNB 45
VNO diseksiyonu için 35 mm kafa Cildi  Güzel

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vomeronasal OrganAcute Tissue SlicesSingle Cell ElectrophysiologyVomeronasal Sensory NeuronsFpr rs3 i Venus MicePatch Clamp RecordingTissue DissectionVibratome SectioningFluorescence ImagingChemosensory Detection

İlgili makaleler