Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Summary

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Abstract

Küçük moleküllerin moleküler hedef(ler)ini belirlemek, etki mekanizmalarını anlamak için zorlu ama gerekli bir adımdır. Çeşitli küçük moleküllerin bağlayıcı proteinlerini başarılı bir şekilde aydınlatmak için çeşitli hedef tanımlama yöntemleri geliştirilmiş ve kullanılmış olsa da, bu tekniklerin, belirli türdeki küçük molekül-hedef etkileşimlerini tespit etmek için onları uygun olmayan hale getiren dezavantajları vardır. Özellikle, hücre lizizi üzerine yapıları bozulabilen zar proteinlerininki gibi doğal hücresel koşullara bağlı olan kovalent olmayan etkileşimler, genellikle afiniteye dayalı hedef tanımlama yöntemlerine uygun değildir. Burada, canlı hücrenin ortamındaki küçük molekül bağlayıcı proteine kovalent olarak çapraz bağlanmak için bir fotolablab grup içeren bir probun kullanıldığı, hücre lizizinden sonra etkileşimin sürdürülmesine gerek kalmadan hedef proteinin tespit edilmesine ve izolasyonuna izin veren bir yöntemi gösteriyoruz. Bu teknik, hem temel biyoloji hem de ilaç keşfi bağlamında, bilinmeyen mekanizmalara sahip biyolojik olarak ilginç küçük molekülleri incelemek için değerli bir araçtır.

Introduction

Biyoaktif küçük moleküller temelde hücre içinde, ile etkileşim ve bir ya da daha fazla "hedef" moleküller, en çok protein fonksiyonunu değiştirerek çalışır. ilaç keşfi, ne, bir aktif bileşik fenotipik tarama yoluyla tespit edilir, bu bileşiğin moleküler hedef (ler) in tespiti, sadece hareket ve bileşik potansiyel yan etkilerinin mekanizmasının anlaşılması, değil, aynı zamanda potansiyel olarak keşfetmek olmayan, son derece önemlidir yeni biyoloji hastalık modelin altında yatan ve terapötik ¹ yeni mekanistik sınıfların gelişmesi için önünü açtı. hedef tanımlama terapötik kullanılacak bir ilaç için gerekli olmasa da, son yıllarda yeni ilaç adayları geçerli bir hedef bilinen ise, daha iyi yatırım getiri nedenle klinik çalışmalarda başarılı ve daha muhtemel olduğunu artan bir tanıma olmuştur ^2. Böylece, küçük belirlemek için yöntemler artan bir ilgi olmuşturmolekül hedef proteinler.

Klasik bir hedef belirleme deneyi tipik haliyle ilgi küçük molekül, bir reçine üzerine immobilize ve bağlanmamış protein yıkanarak ve geri kalan proteinler elüt edilmekte ve ³ tespit edilir, sonra bütün hücre lizatları ile kuluçkalanır afinite saflaştırma dayanır. Bu teknik, çok sayıda küçük moleküller ⁴ hedeflerini tanımlamak için kullanılmış olsa da, bazı nedenlerle, evrensel bir hedef kimliği yöntem için uygun değildir. İlk olarak, hedef proteinin küçük moleküllü bağlanma yeteneğini muhafaza etmek için, hücre lizizi sonrasında doğal yapısını muhafaza etmelidir. Bu genellikle, doğal ortamından ayrılmış sonra yapı değişimlerine uğrama, ya da sadece agrega ve solüsyonun dışında çökelmesi membran proteinleri için, özellikle sorun yaratabilir. korurken İkinci olarak, küçük molekül kimyasal olarak reçine üzerine immobilize edilebilir bir şekilde değiştirilmesi gerekirHedef protein bağlanma yeteneğidir. Bu reçineye giderildikten sonra derin bağlanma cepleri nedenle küçük moleküle erişilemez olabilir. Üçüncü olarak, bağlanma afinitesi etkileşimi zor düşük afinite etkileşimler kimlik verme, yıkama adımları sırasında korunur şekilde yeterince yüksek olması gerekmektedir. pH, iyon konsantrasyonu veya diğer endojen moleküllerin varlığı gibi Dördüncü, çevre koşulları hücre içinde mekansal değişir ve bazen ilaç hedef etkileşimleri için de önkoşul olabilir. Böylece, izin ve deneme yanılma önemli miktarda gerektirebilir hücrenin dışında bağlayıcı korumak için doğru koşulların bulunması.

Fotoafinite işaretleme küçük bir molekülün bir hücrenin doğal kapsamında hedefinin kovalent izin vererek bu sorunları circumvents. Aksine büyük bir hantal reçine küçük molekül immobilize daha molekül yerine kimyasal iki küçük fonksiyonel g yüklemek için modifiye edilirroups: belirli bir ışık dalga boyuna sahip ışınlanmış olduğunda hedef proteine ​​kovalent çapraz bağlanmasını sağlayan bir foto-aktifleştirilebilen kısım, ve hedef proteinin algılanabilir ve daha sonra izole sağlayan bir raportör grubu yer alır. Canlı hücreler, prob bağlanmakta ve kovalent hedef proteine ​​çapraz bağlayan ve prob-protein kompleksi daha sonra izole bozulmamış, fotoafinite probu ile tedavi edilir. hedefe bağlanabilen prob özgünlüğü ana bileşiğin fazla bir hedef proteine ​​probun bağlanması uzaklıkta rekabet için kullanılan paralel bir rekabet deneyi gerçekleştirmek gösterilmiştir.

fotoafinite prob tasarımı ve sentezi küçük bir molekülün diğerine büyük ölçüde değişir ve bu protokolde kapsamında değildir; Ancak, konuyla ilgili çeşitli mükemmel tartışmalar ^5-9 yayınlandı. ana dikkate presumab nedenle prob ana bileşiğin biyolojik etkinliğini muhafaza etmesidirly Aynı hedef (ler) e bağlandığı görülmüştür. Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları molekülün parçaları biyo kaybı olmadan değiştirilebilir belirlemek için gerçekleştirilmelidir. Farklı kimyasal grupların çeşitli avantajları ve dezavantajları ¹⁰ sahip diazirine, benzofenon ve aril azit içeren ışıkla çapraz bağlayıcı, olarak kullanıldı. Benzer şekilde, prob bağlayıcı proteinler izole etmek için kullanılmıştır birçok muhabir etiketleri bulunmaktadır. Raportör grupları gibi yaygın olarak kullanılan biyotin veya flüoresan etiketler olarak, kendi işlevsel olabilir, ya da daha küçük ve biyolojik aktivite ¹¹ tehlikeye böylece daha az muhtemel olması avantajına sahiptir foto-çapraz adım sonraki daha işlevselleştirilmesini gerektiren ön olabilir.

Bu protokol, bir foto-çapraz diazirine grubu içeren bir fotoafinite sonda ve bir Cu (I) ile bir raportör grubunun eklenmesi için bir terminal alkin -catalyz kullandıked Azid-Alkin Kansız-Hüsgen Siklokatılma (veya tıklayın) reaksiyon ^12-15. SAR çalışmaları, tasarım ve sentez soruşturma ve bu çalışmaların sonuçları yerde ^16-18 yayınlandı.

Protocol

NOT: Bu protokol, canlı hücrelerde kullanım için Mackinnon'dan ve Taunton ¹⁰ uyarlanmıştır.

Kültür Hücrelerinin hazırlanması 1.

1. (Aşağıya bakınız) istenen numune sayısı steril 6 cm hücre kültür kaplarına hazırlayın.
   Not: hücrelerin bir çanak işleme durumuna göre kullanılır, ancak daha fazla protein, 2 veya 3 yemekler durum başına hazırlanmış ve UV ışınımı sonrasında birleştirilebilir gerekli ise.
   1. hücrelerin en az 3 yemekleri hazırlamak; DMSO yalnızca (D) Prob tedavisi (P) ve prob + rakip (C) Negatif kontrol.
   2. İsteğe bağlı olarak, bir UV kontrol olarak ^4. çanak, sonda ile tedavi, ancak UV ışığına maruz kalmaması için hazırlar.
      Not: birden çok rakip molekülleri, ilgi küçük molekülün farklı analogları, test edilecek ise, gerektiğinde ilave bir rakip plakaları hazırlamak.
2. 4 mL kültür ortamı içinde kültür tabaklarına HEK293T hücreleri ekleyin. 3,5 milyon c kullanınplaka başına arşın.
   Not: hücre deneyin başlangıcında hemen hemen% 100 konfluent böylece hücrelerin sayısı en protein verimi elde etmek için, her hücre türü için belirlenmelidir. HUVEC için plaka başına 0,3 milyon hücre kullanın. İyi bir yaklaşım konfluent 15 cm çanak hücrelerin 1/10 olduğunu. HEK293T hücreleri kültüre gereken Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir.
3. Kültür inkübatör hücreleri Dönüş (37 ° C,% 5 _CO2) gece boyunca karıştırılmıştır.

Hücreler ve foto-çapraz 2. Tedavi

1. Bir sonraki gün, ön kısım, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine aşağıdaki ilaçlar:
   1. İlk tedavi olarak, 2 tüpleri ve 1 borunun 10 mM yarışmacının (örneğin, tadil edilmemiş ana bileşik) 4 ul DMSO 4 ul ekle.
   2. İkinci tedavi için, 1 tüp DMSO 16 ul ve 50 arasında 16 ul# 181; 2 tüplere M fotoafinite probu.
      NOT: En iyi konsantrasyon farklı prob (tartışma) için farklı olabilir, ancak 200-500 arasında nM iyi bir başlangıç ​​noktası (burada 200 nM kullanın) 'dir. yarışmacının konsantrasyonu probu en az 20 kat (burada 10 mcM kullanıyorum) bu aşması gerekir. DMSO'nun nihai konsantrasyonu, her levha olarak eşit olması gerekmektedir ve% 0.5 (20 ul hacim) fazla olmamalıdır.
2. hücre kültürü kaputu içine hücre plakaları getirin ve aşağıdaki gibi adım 2.1.1 öncesi aliquoted ilaçlar ekleyin: kültür ortamı aspire 1 ml, medyada ön aliquoted ilaç resuspending ve yavaşça plaka damla geri ekleyerek bilge. DMSO (D) plaka ve sonda (P) plakaya DMSO ekleyin ve rekabet (C) plakaya rakip ekleyin. 30 dakika boyunca kültür inkübatör plakaları dönün.
3. silik kültürü kaputu ışıkları ile, prob adım 2.1.2 öncesi aliquoted probu ekleyin (P) ve yarışma (C) plakaları ve eklemeYukarıdaki DMSO (D) plakaya DMSO. 1 saat boyunca kültür inkübatör plakaları dönün.
4. İnkübasyon sırasında, aşağıdaki öğeleri hazırlamak; plakaların tüm sığabilecek bir buz tepsisi; buz soğukluğunda lisis tampon maddesi (PBS [pH 8.5] + 1 x proteaz inhibitör kokteyli [komple EDTA-içermeyen su içinde yapılan 50x stok çözeltisinden seyreltilmiş]; 200 ul / plaka); mikrosantrifüj tüpleri, buz üzerinde, farklı tedavi koşulların her biri için D, P, veya C etiketli.
5. 1 saat inkübasyon sonunda 15 dk önce, soğuk bir odada UV lambası (365 nm) kurmak ve ampul ısınmak için yeniden açın.
6. prob ile 1 saat süreyle inkübe edildikten sonra buz üzerinde yemekler yerleştirin. aşırı prob çıkarmak için yavaşça 5 ml buz gibi soğuk PBS (pH 7.4) ile hücrelerin yıkayın. 4 ml buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yeniden kapsamaktadır.
7. Lambanın Isıtma aza indirmek için bir buz paketi üzerinde UV lamba altında 3 cm merkezli hücrelerin çanak yerleştirin. 3 dakika boyunca ışın tedavisi. buz tepsiye çanak çıkarın ve tüm numuneler için tekrarlayın.
8. birfter ışınlama, hücreler PBS aspire ve her plakaya proteaz inhibitörleri ile buz soğukluğunda PBS (pH 8.5) 200 ul ilave edin. buz üzerinde önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine kauçuk kazıyıcı ve transfer kullanarak hücreleri plakadan ayırın.
9. (Örnek 250 ul bir% 10 SDS ve 10 ul)% 0.4 bir son konsantrasyona SDS ekleyin.
   DİKKAT: SDS toz tehlikelidir. burnunun ve ağzının üzerinde bir maske takarak SDS tozu solumaktan kaçının.
10. Lyse 10 darbe (çıkışı 1, görev döngüsü% 30) süspansiyonu sonicating 10 pals ikinci tur önce 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe, hücrelerin.
11. Gerekirse, süspansiyon 2 ul kaldırmak ve tam hücre parçalama sağlamak için ışık mikroskobu altında kontrol edin.
12. Hücre lizizi tamamlamak ve tüm proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C olarak ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde örnekleri kaynatılır.
13. Bu inci gibi, bir spektrofotometrik deterjan uyumlu protein deneyi kullanılarak her bir numune içindeki protein konsantrasyonu ölçümü750 nm'de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre ile, üretici talimatlarına göre e DC Protein Deney ^19,.
14. Gerektiğinde PBS pH 8.5 +% 0.4 SDS ilave edilerek 2.5 mg / ml protein konsantrasyonu normalize (ya da konsantrasyonlar ise daha düşük 2.5 mg / ml, en düşük protein konsantrasyonu ile örnek normalize) (örneğin, numuneler, 5 ise 250 ul mg / ml) 2.5 mg / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere, PBS, pH 8.5 +% 0.4 SDS, 250 ul ekle.

Etiketli Proteinlerin Görselleştirme için tıklayın Kimya tarafından Floresan Tag 3. Eklenti

1. Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne hücre lizatının transfer 40 ul çıkarın. biyotin-azid (aşama 4) ile reaksiyona sokulması için kalan lizatları tutun.
2. sırasıyla aşağıdaki reaktifler ekleyin: 0.2 ul flor-azid (DMSO içinde 1 mM stok çözelti), 0.58 ul TCEP (100 mM'lik bir stok su içinde NaOH 4 eşdeğer, taze olarak hazırlanmıştır) ve 3.38 ul TBTA (1.4 7 mM stok: DMSO t-butanol 1 oran). Vortex karıştırın.
3. Reaksiyonu başlatmak üzere 1.14 ul -5H ₂ O (su içinde 50 mM) CuSO ₄ ekleyin. Vortex kısa ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. reaksiyonun sönmesi için 2x SDS örnek tampon maddesi 50 ul ekle. Bu noktada, gerektiğinde gece boyunca -20 ° C 'de en iyi sonuçları veya deposu için bir SDS-PAGE jeli ²⁰ doğrudan örneklerini yürüt.
5. örnekleri dondurma ise, jel üzerine yüklenmeden önce 95 ° C'de 5 dakika boyunca ısıtın.
   Not: hedef proteinin moleküler ağırlığı, tipik olarak, bu aşamada bilinmediği için, farklı akrilamid konsantrasyonları ile 2 jeller çalıştırmak için tavsiye edilir (yani,% 8 ve% 15) ya da geniş bir moleküler ağırlık aralığı, gradyan jeli (örneğin, 4-15%), tam molekül ağırlığı kapsama sağlamak.
6. Boyanın önü jelin sonuna ulaştığı zaman, fazla unreacte tüm sağlamak için ilave bir 5 dakika daha jel çalışmaya devamd flor-azid tamamen jel çıkıldı.
7. GKD ₂ O olan bir kaba jel çıkartın ve tüm fazla flor-azit yıkamak için, yumuşak çalkalama ile 10 dakika süreyle inkübe edilir.
8. bir cam plaka üzerine jel yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir Typhoon flüoresan jel tarayıcı kullanılarak jel tarama.

Etiketli proteinlerinin eğilim saflaştırılmasına Click kimyası ile de biotin etiketini 4. Ek

1. Aşama 3.1 kalan lizatları, sonra normalizasyon 2.5 mg / ml elde örnek hacmi 500, 550 ve 600 ul ise tüm örnekler (örneğin, aynı hacimde olan örneğin, protein normale döndükten sonra en fazla miktarda kullanmak, 500 kullanımı her ul).
2. PBS (pH 7.4) 50 ul yüksek kapasiteli streptavidin agaroz boncuklar, önceden yıkanmış 2x ekleyerek lizatları ön temizleyin. rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat inkübe edin.
3. 3 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile boncuk Pelet. t kaldırO buz üzerinde yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatan ve boncuk atın.
4. "Girdi" etiketli yeni bir tüp DMSO örnek% 1-2 çıkarın. -20 ° C'de 2 x SDS örnek tamponu ve mağaza eşdeğer hacim.
5. lizat 500 ul, aşağıdaki reaktifler ekleyin: 1.38 ul biyotin-azid (DMSO içinde 10 mM stok), 5.5 ul TCEP, 32,5 ul TBTA. Vortex karıştırın.
6. 11 ul kısaca lizat ve vorteks 500 ul başına -5H ₂ O CuSO ₄ ekleyin. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
7. -20 ° C'ye soğutulmuş asetonla 4 Örnek hacimleri ekleyin. örnekler ve -80 ° C'de bir gece inkübe Vortex tamamen proteinleri çöktürmek ve reaksiyona girmemiş biyotin-azit kaldırmak için.
8. Santrifüj, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de örnekler çökelmiş proteinleri pelet.
9. Tamamen süpernatanı havalandırın, ve 150 ul PBS (pH 7.4) +% 1 SDS içinde sonikasyon ile proteinler resolubilize.
10. % 0.2 SDS seyreltilmesi için, PBS (pH 7.4), 600 ul ekle.
11. 30 ul önceden yıkanmış yüksek kapasiteli streptavidin agaroz tanelerine örnekleri ekleyin ve rotasyon ile 4 ° C 'de 1 saat inkübe edilir.
12. 3 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile boncuk Pelet. ilişkisiz proteinler ve imha edilmesini içeren süpernatant aspire.
13. tanelerine yıkama tamponu (400 mM NaCI, 50 mM Tris,% 0.2 SDS, pH 7.4) 1 ml ilave edilir ve rotasyon ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
14. Tekrarlayın 4.12 ve 4.13 3 kez yineleyin.
15. boncuklar tamamen yıkama tamponu aspire, ve 2 x SDS numune tamponu 30 ul ekle.
16. boncuklardan proteinleri serbest bırakmak için 95 ° C sıcaklıkta bir blok üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
17. Oda sıcaklığında 13.000 xg'de 1 dakika için boncuk santrifüjleyin.
    NOT: Bu noktada, numuneler, SDS-PAGE çalıştırmak için hazır olana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. örnekleri dondurma durumunda, kullanımdan önce 95 ° C 'de 5 dakika ısıtın.
18. dikkatliceboncuk kapalı proteinleri içeren örnek tamponu pipet ve SDS-PAGE ²⁰ üzerine yük (aşağıdaki önemli açıklamalara bakın). boncuklar gerekirse daha sonra reboiling için kaydedilebilir.
    Not: gümüş boya ile protein tespiti için, iyi sonuçlar 1 mm kalınlığında jel kullanılarak elde edilir. bir grup kütle spektrometrisi (MS) analizi için, gümüş boyalı jel üzerinden kesilecek olursa, steril çözeltiler taze tüm reaktifleri hazırlayıp jeli üzerinde örnekler arasında iyi bir boş bırakın. Bu arka plan proteinleri çıkartılır böylece prob kulvar kesilmiş, her grup için, bir paralel kesit DMSO şerit alınmalıdır. Western blot ile protein kimliğinin doğrulanması için, SDS-PAGE jeli çalışan, aynı zamanda adım 4.4 giriş örnek yüklemek için çok önemlidir.
19. Hedef protein (ler) tespit etmek için gümüş boyama ²¹ veya Western blot ²² biri için standart bir protokol takip edin.

Results

Burada gösterilen sonuçlar, daha önce ¹⁶ yayımlanmıştır kullanımı olan antifungal ilaç itrakonazol, fotoğraf afinite probu ile elde edilmiştir. Bu özellik sayesinde 35 kDa zar proteini Voltaj bağımlı Anyon Kanal 1 (VDAC1) gibi önemli bir itrakonazol bağlayıcı proteini tespit etmek canlı hücre fotoafinite işaretleme tekniği kullanımını göstermektedir.

Yukarıdaki protokol rakip molekül olarak photolabeling ve modifiye...

Discussion

İlacın hücresel fenotip onların bilinen fonksiyonları dayalı potansiyel hedefleri daraltmak için kullanılan yukarıdan aşağıya, ya da aşağıdan yukarıya, hedef: küçük moleküllerin hedefleri belirlenmesi için farklı yaklaşımlar genel olarak iki kategoride toplanabilir kimyasal veya genetik yollarla ³ doğrudan tanımlanır. Yukarıdan-aşağıya veya fenotipik çalışmalar ilacın etkilenen bazı hücresel süreçleri tanımlamak (örneğin, transkripsiyon / çeviri / DNA sentezi, hücre döngüsü bloğu, yolun aktivasyonu /...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP)	Yaşam Teknolojileri	20490	Taze kullanım günü yapın. 4 eq NaOH ile suda 100 mM stok hazırlayın.
Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)	AnaSpec	63360-50	T-bütanolün DMSO'ya 4: 1 oranında 1.7 mM stok hazırlayın, -20 'de saklayın; °C.
Bakır Sülfat (CuSO4• 5H2O)	LabChem, Inc.	LC13440-1	50 mM su stoğu hazırlayın, oda sıcaklığında saklayın.
Biotin-azide	Click Kimya Araçları	AZ104-100	DMSO'da 10 mM stok hazırlayın, -20 'de saklayın; °C.
Alexa Fluor 647-azid	Yaşam Teknolojileri	A10277	DMSO'da 1 mM stok hazırlayın, -20 'de saklayın; °C.
Çalışırken 365 nm UV lambalı	Spectroline	FC100	UV engelleyici gözlükler takılmalıdır.
Proteaz inhibitör tabletleri, EDTA içermeyen	Roche Life Science	11873580001	Suda 50x çözelti hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; °C.
Sonicator	Branson	Sonifier 250	Çıkış 1'e ayarlayın, görev %30.
Floresan jel tarayıcı	GE Healthcare Life Sciences	FLA 9500	Alexa-fluor 647'yi algılamak için kırmızı lazer kullanın.
Deterjan uyumlu Dc protein test kiti	Bio-Rad	5000112
Yüksek Kapasiteli Streptavidin Agaroz boncukları	Yaşam Teknolojileri	20359
Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta, düşük glikozlu	ThermoFisher Scientific	11885092
Fetal Sığır Serumu, nitelikli	ThermoFisher Scientific	26140079
SDS Numune Tamponu (2x)	ThermoFisher Scientific	LC2676