Method Article

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

DOI:

10.3791/54529

⸱

September 20th, 2016

 , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük moleküllerin moleküler hedef(ler)ini belirlemek, etki mekanizmalarını anlamak için zorlu ama gerekli bir adımdır. Çeşitli küçük moleküllerin bağlayıcı proteinlerini başarılı bir şekilde aydınlatmak için çeşitli hedef tanımlama yöntemleri geliştirilmiş ve kullanılmış olsa da, bu tekniklerin, belirli türdeki küçük molekül-hedef etkileşimlerini tespit etmek için onları uygun olmayan hale getiren dezavantajları vardır. Özellikle, hücre lizizi üzerine yapıları bozulabilen zar proteinlerininki gibi doğal hücresel koşullara bağlı olan kovalent olmayan etkileşimler, genellikle afiniteye dayalı hedef tanımlama yöntemlerine uygun değildir. Burada, canlı hücrenin ortamındaki küçük molekül bağlayıcı proteine kovalent olarak çapraz bağlanmak için bir fotolablab grup içeren bir probun kullanıldığı, hücre lizizinden sonra etkileşimin sürdürülmesine gerek kalmadan hedef proteinin tespit edilmesine ve izolasyonuna izin veren bir yöntemi gösteriyoruz. Bu teknik, hem temel biyoloji hem de ilaç keşfi bağlamında, bilinmeyen mekanizmalara sahip biyolojik olarak ilginç küçük molekülleri incelemek için değerli bir araçtır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoaktif küçük moleküller temelde hücre içinde, ile etkileşim ve bir ya da daha fazla "hedef" moleküller, en çok protein fonksiyonunu değiştirerek çalışır. ilaç keşfi, ne, bir aktif bileşik fenotipik tarama yoluyla tespit edilir, bu bileşiğin moleküler hedef (ler) in tespiti, sadece hareket ve bileşik potansiyel yan etkilerinin mekanizmasının anlaşılması, değil, aynı zamanda potansiyel olarak keşfetmek olmayan, son derece önemlidir yeni biyoloji hastalık modelin altında yatan ve terapötik 1 yeni mekanistik sınıfların gelişmesi için önünü açtı. hedef tanımlama terapötik kullanılacak bir ilaç için gerekli olmasa da, son yıllarda yeni ilaç adayları geçerli b....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol, canlı hücrelerde kullanım için Mackinnon'dan ve Taunton 10 uyarlanmıştır.

Kültür Hücrelerinin hazırlanması 1.

  1. (Aşağıya bakınız) istenen numune sayısı steril 6 cm hücre kültür kaplarına hazırlayın.
    Not: hücrelerin bir çanak işleme durumuna göre kullanılır, ancak daha fazla protein, 2 veya 3 yemekler durum başına hazırlanmış ve UV ışınımı sonrasında birleştirilebilir gerekli ise.
    1. hücrelerin en az 3 yemekleri hazırlamak; DMSO yalnızca (D) Prob tedavisi (P) ve prob + rakip (C) Negatif kontrol.
    2. İsteğe bağlı olarak, bir UV kontrol olarak 4. çanak, sonda ile tedavi,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gösterilen sonuçlar, daha önce 16 yayımlanmıştır kullanımı olan antifungal ilaç itrakonazol, fotoğraf afinite probu ile elde edilmiştir. Bu özellik sayesinde 35 kDa zar proteini Voltaj bağımlı Anyon Kanal 1 (VDAC1) gibi önemli bir itrakonazol bağlayıcı proteini tespit etmek canlı hücre fotoafinite işaretleme tekniği kullanımını göstermektedir.

Yukarıdaki protokol rakip molekül olarak photolabeling ve modifiye.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlacın hücresel fenotip onların bilinen fonksiyonları dayalı potansiyel hedefleri daraltmak için kullanılan yukarıdan aşağıya, ya da aşağıdan yukarıya, hedef: küçük moleküllerin hedefleri belirlenmesi için farklı yaklaşımlar genel olarak iki kategoride toplanabilir kimyasal veya genetik yollarla 3 doğrudan tanımlanır. Yukarıdan-aşağıya veya fenotipik çalışmalar ilacın etkilenen bazı hücresel süreçleri tanımlamak (örneğin, transkripsiyon / çeviri / DNA sentezi, hücre döngüsü bloğu, yolun aktivasyonu /.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoafinite etiketleme protokolünün tasarımı konusunda tavsiyeleri için Dr. Ben Nacev'e, itrakonazol fotoafinite probunu sentezlediği için Dr. Wei Shi'ye, afinite aşağı çekme deneyleri hakkında tavsiyeleri için Dr. Yongjun Dang'a ve yardımcı yorumlar ve destek için JOL laboratuvarının diğer üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Farmakoloji / Toksikoloji alanında bir PhRMA Vakfı Bursu (SAH'ye); Ulusal Kanser Enstitüsü Hibe R01CA184103; Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü; Prostat Kanseri Vakfı (JOL); ve kısmen Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nden (NCATS) Grant UL1 TR 001079 tarafından finanse edilen Johns Hopkins Klinik ve Translasyonel Ar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP)Yaşam Teknolojileri20490Taze kullanım günü yapın. 4 eq NaOH ile suda 100 mM stok hazırlayın.
Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)AnaSpec63360-50 T-bütanolün DMSO'ya 4: 1 oranında 1.7 mM stok hazırlayın, -20 'de saklayın; °C.
Bakır Sülfat (CuSO4• 5H2O)LabChem, Inc.LC13440-150 mM su stoğu hazırlayın, oda sıcaklığında saklayın.
Biotin-azideClick Kimya AraçlarıAZ104-100DMSO'da 10 mM stok hazırlayın, -20 'de saklayın; °C.
Alexa Fluor 647-azid Yaşam TeknolojileriA10277DMSO'da 1 mM stok hazırlayın, -20 'de saklayın; °C.
Çalışırken 365 nm UV lambalıSpectrolineFC100UV engelleyici gözlükler takılmalıdır.
Proteaz inhibitör tabletleri, EDTA içermeyenRoche Life Science11873580001Suda 50x çözelti hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; °C.
SonicatorBransonSonifier 250Çıkış 1'e ayarlayın, görev %30. 
Floresan jel tarayıcıGE Healthcare Life SciencesFLA 9500Alexa-fluor 647'yi algılamak için kırmızı lazer kullanın.
Deterjan uyumlu Dc protein test kitiBio-Rad5000112
Yüksek Kapasiteli Streptavidin Agaroz boncukları Yaşam Teknolojileri20359
Dulbecco'nun Modifiye Eagles Orta, düşük glikozluThermoFisher Scientific11885092
Fetal Sığır Serumu, nitelikliThermoFisher Scientific26140079
SDS Numune Tamponu (2x)ThermoFisher ScientificLC2676
Penisilin/Streptomisin çözeltisi ThermoFisher Scientific 15140122 Serisi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
  2. Cook, D., Brown, D., et al. Lessons learne....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live cell Photoaffinity LabelingSmall Molecule Target IdentificationPhotoaffinity Probe BindingNative Cellular EnvironmentCovalent CrosslinkingHEK 293 T CellsFluorescent Gel ScanningStreptavidin Agarose BeadsSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

Related Articles