Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde Bir Tekrarlanan Concussive Kafa Travması Modeli

11.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54530

⸱

12 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program for Neurotrauma, Neuroproteomics & Biomarkers Research, University of Florida, 2Department of Psychiatry, University of Florida, 3Department of Neuroscience, University of Florida

Bu makalede

Özet

Beyin sarsıntısı, travmatik beyin hasarının en yaygın tipini sunar. Bu nedenle, hastalarda bir yaralanmanın önemli özelliklerini çoğaltan tekrarlayan bir sarsıntılı hayvan modeli, sarsıntıyı titiz, kontrollü ve verimli bir şekilde incelemek için bir araç sağlayabilir.

Özet

Beyin sarsıntısı/hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) travmatik beyin hasarının en sık görülen oluşumu olmasına rağmen, yaralanma ve etkileri hakkında hala bilgi eksikliği vardır. Beyin sarsıntısının daha iyi anlaşılmasını sağlamak için hayvanlar genellikle kontrollü, titiz ve verimli bir model sağladıkları için kullanılır. Çalışmalar, yaralanma parametrelerini değiştirerek hafif yaralanma şiddetini uyarmak için mTBI gerçekleştirmek için geleneksel hayvan modellerini uyarlamıştır. Bu modeller, klinik duruma morfolojik olarak benzer beyin yaralanmaları üretebildikleri ve bir dizi yaralanma şiddeti sağlayabildikleri için kullanılmıştır. Bununla birlikte, hastalarda yaralanmaların aynı özelliklerini sunma yetenekleri sınırlıdır. Geleneksel bir darbe sistemi kullanarak, tekrarlayan bir sarsıntı yaralanması (rCHI) modeli, hafif ila orta derecede insan benzeri sarsıntıya neden olabilir. Yaralanma derecesi, solunumun geçici olarak sonlandırıldığına dair bir işaret ile bilinç kaybı süresinin (LOC) ölçülmesiyle belirlenebilir. rCHI modelinin, mTBI etkilerini ve potansiyel tedavileri belirlemedeki doğruluğu ve basitliği nedeniyle kullanılması faydalıdır.

Giriş

Sarsıntı da adlandırılan hafif travmatik beyin hasarı (HTBH), travmatik beyin hasarı (TBI) en sık görülen bir durumdur ve ABD'de milyonlarca insanı etkilemektedir. Beyin sarsıntısı teşhis etmek zor olabilir ve sarsıntı için özel bir tedavisi yoktur. Büyüyen bir tanıma ve spor yaralanmaları, askeri mücadele ve diğer fiziksel ilgi çekici takipçiliği kaynaklanan hafif mekanik travma kümülatif ve kronik nörolojik sonuçları 1,2 olabileceği bazı kanıtlar vardır. Ancak, yine de sarsıntı ve onların etkilerine ilişkin bir bilgi eksikliği vardır. Sadece nörolojik değerlendirme ve görüntüleme değerlendirilmesi klinik tanı için kullanılabilir çünkü Güncel metodoloji insanlarda patoloji ve tedavi çalışmalarını kısıtlar. Hayvan modelleri, teşhis ve daha HTBH tedavisinde umut etkili, sıkı, ve kontrollü bir şekilde beyin sarsıntısı incelemek için bir araç sağlar.

Çalışmalar geleneksel TBI adapte olmasıBöyle kontrollü kortikal etkisi (CCİ) olarak modeller, sıvı-perküsyon etkisi (FPI), ağırlık düşüşü yaralanma ve patlama hasarı HTBH gerçekleştirmek ve yaralanma parametreleri değiştirerek düşük yaralanma şiddet derecelerine uyarmak için. Bu modeller nedeniyle klinik durumuna morfolojik olarak benzer beyin travması çoğaltmak kabiliyetlerine için kullanmak yararlıdır; Ancak, aynı zamanda kendi sınırlamaları vardır. Bir ivme yaralanma (ağırlık damla) ile uyarılan yaralanma şiddeti genellikle oldukça değişkendir. Hafif CCI iki sonuçları - subaraknoid kanama ve fokal kontüzyon - tipik insan sarsıntı ile karşılaştırılabilir değildir. Blast yaralanma maruz 3-6 esnasında farklı pozlama pozisyon ve pik basınç ölçümleri açısından daha tartışmalı bir model yanı sıra değişken ikincil yaralanma ise CCİ ve FPI, klinik açıdan anlamlı olmayan bir kranyotomi gerektirir. Güncellenmiş sarsıcı hayvan modeli klinik Setti içine pre-klinik araştırma çevirebilirng araştırma gereklidir.

Hafif TBI modelleme önemli bir konu en yakın bir klinik ortamda yaralanma çoğaltır deneysel yaralanma şiddetini, tanımlamaktır. Son zamanlarda, farklı araştırma grupları kapalı kafa travması veya Kafa travması (CHI) modeli 7-10 geliştirdi. CHI bir kraniotomi olmadan CCİ'nin bir değişiklik, ama yine de bir kafa etkisini oluşturmak için geleneksel elektronik manyetik darbe sistemi kullanır. Bir CHI darbe parametrelerini ayarlayarak hafif ve orta şiddette değişen bir sarsıntı neden olabilir. bilinç (LOC) kaybı solunum hızı ya da solunum geçici fesih bir azalma tespit ederek bir darbeden sonra hemen görülebilir. LOC süresi yaralanmanın şiddetini belirlemek için kullanılır. Bu kağıt ayrıntılı adım-adım protokolü ve temsilcisi sonuçları ile birlikte farelerde tekrarlayan CHI (rCHI) modelin biraz geliştirilmiş ve güncelleştirilmiş bir sürümünü içerir. rCHI modeli araştırma stratejileri,sarsıntı kaynaklı patolojik değişikliklerin tümünü taklit edebilen hiçbir bireysel bir hayvan modeli var, özellikle de HTBH etkileri ve potansiyel tedaviler belirlenmesinde yararlı yeniden.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm işlemler Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre onaylanan protokoller # 201207692 altında gerçekleştirildi.

1. Hayvan Bakımı

  1. 3-4 aylık erkek C57BL / 6J fareler kullanın. Yatak, yuvalama malzeme, yiyecek ve su ad libitum sağlamak. Sabit 12 saat ışık / 12 saat karanlık döngüsü ile 22 ° C - 20 kontrol edilen ortam sıcaklıklarında fareler tutun.

2. Ön impaksiyon Hazırlık

  1. Elektromanyetik stereotaksik darbe cihazına ısmarlama silikon kauçuk kaplı metal ucu takın. Ucunun düz tabanlı prob ucu (Şekil 1A) yüzeyine paralel olduğundan emin olun.
  2. % 2.5 izofluran bakım anestezi ardından% 4 izofluran ile fare anestezisi. debimetre aracılığıyla anestezi kontrol edin. monitor hayvan kadar anestezi seviyesi pedalı geri çekme refleksi kaybı göstererek anestezi cerrahi düzeyine ulaşır.
  3. bir ısıtma yastığı üzerinde yüzükoyun pozisyonda fare koyun. Anestezi altında fare tutmak için bir huni şeklinde bir burun konisi kullanın. Tamamen bir düzeltici kullanarak tıraş. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için farenin gözleri vazelin oftalmik merhem kullanın.

3. Etki Parametreleri Ayar

NOT: Etki sistemi darbe parametrelerini ayarlamak için bir kontrol kutusu, impaction gerçekleştirmek için bir aktüatör ve 3-hareket eksenleri ile bir dijital stereotaktik çerçeve içerir.

  1. 4 m / sn darbe cihazın hızını önceden ayarlanmış ve kontrol kutusu üzerinde 240 msn bekleme süresi.

4. Konumlandırma Darbe Merkezi

  1. 39 ° C'ye yakın vücut ısısını korumak için hayvanın vücudunun altında yumuşak bir ısıtma yastığı koyun. Bir pron bir stereotaktik çerçeve içinde fare montekünt uç kulak çubukları ile e konumu.
  2. Z-sürücü hareket ettirerek farenin kafasına yakın darbe ucu indirin. Hedef sagital sütür üzerinde koordinatları ortada X- ve Y-sürücüleri hareket ettirerek düz darbe ucu (9 mm çapında) ayarlayın.
  3. Dikey iki kulak (Şekil 1C) arasında çizilen hayali bir yatay çizgi paralel olan darbe ucunun emin bir kenarı olun. etkinin merkezi (0 mm, yanal 4.5 mm kulaklararası için interaural 9 mm) interfrontal ve lambdoidea'nın sütürler arasındaki merkezi sagital sütür yarıda karşılık gelir.

5. Darbe Derinlik Ayarı

  1. doğru etki derinliğini ayarlamak için, yalıtımlı silikon kauçuk kaplı darbe ucu yerine ek prob ucunu kullanın.
  2. ipuçları geçmeden önce sıfıra dijital stereotaksik kontrol panelindeki X ve Y kanalı ayarlamak anahtarlama ipuçları sonra darbe merkezinin herhangi bir kayma var olduğundan emin olmak için.
  3. prob taşıEl X ve Y-sürücüleri hareket ettirerek darbe alanının merkezine e ucu.
  4. farenin kuyruk klibi temas sensörü.
  5. prob ucu darbe sitenin yüzeyine temas edene kadar aşağı impaktörü (Z sürücü) taşıyın.
  6. sıfıra stereotaksik kontrol panelindeki Z kanalını ayarlayın.
  7. elle X ve Y sürücüleri kadar X- ve Y-sürücüleri (NOT dijital stereotaksik kontrol panelinde sıfır düğmeleri) ayarlayarak geri etki alanının darbe ucu taşı (darbe ucu daha önce yerleştirildi) sıfırdır.
  8. kontrol kutusu üzerindeki geri çekme anahtarı hareket ettirerek çalıştırıcıyı geri çekin. El ile 4 mm aşağı impaktörü (Z sürücüsü) hareket ettirin.

6. Darbe

  1. kontrol kutusu üzerindeki etkisi anahtarını tıklayarak etkiyi tetikleyebilir ve 4 mm deformasyon derinliği elde.

7. Sonrası impaksiyon

  1. farenin ilk nefes bir zamanlayıcı kullanarak kadar etkisinden zamanı ölçmek.
  2. Enstrüman hayvan çıkarın ve vücut ısısını korumak için sıcak bir ped üzerine koyun. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın.
  3. Temiz bir kafes içine geri hayvan dönmeden önce kurtarma için izin verin. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete bir hayvan iade etmeyin.
  4. Gözlemleyin ve günlük fareler tartmak. Fareler ağrı belirtileri varsa, intraperitoneal 1 de Meloksikamın ile enjekte - 24 saat - 2 mg / her 12 kg.

8. Tekrarlanan Gömülü

  1. gün 4, 7 farelere ek yaralanmaları verin ve ilk yaralanma (etkileri arasındaki 72 saat aralığı) sonra 10.

9. İmmunohistokimya (İHK)

  1. transcardial perfüzyon
    1. 200 m / kg pentobarbital intraperitonal enjeksiyon yoluyla fareler anestezi.
    2. Değerlendirmek ve bir ayak tutam cerrahi düzlem anestezi sağlamak. saniyeure hafifçe kimyasal davlumbaz içine plastik bir çalışma yüzeyine forepaws ve arka pençeleri bantlama ile yatar pozisyonda fare.
    3. Sadece klavikulaya kılıç şeklinde bir süreç altından göğüs orta hat boyunca deri yoluyla bir kesi yapmak. kılıç şeklinde bir süreç iki ek cilt kesiler yapmak ve yanal ventral göğüs kafesi tabanı boyunca devam edin.
    4. göğüs boşluğu açın ve göğüs kaslarının ve göğüs kafesi üzerinden keserek kalp maruz.
    5. künt forseps ile kalpte sabitleyin ve 1 yapmak - sol ventrikül 2 mm kesi.
    6. Hemen sağ atrium içine kelebek iğne takın. yavaş yavaş şırınga iterek 20ml tuzlu su infüzyon başlayın.
    7. tuzlu dan% 4 paraformaldehid geçin. paraformaldehit 20ml ile perfüzyon devam edin.
    8. fare başını kesmek ve makasla cilt kaldırmak. Bir kemik kesici kullanarak kafatası beyin izole edin.
  2. Ckesit ryostat
    1. -80 ° C'de optimum kesme sıcaklığı (OKT) formülasyonu ve donma embed beyin dokuları. sagital yönde kriyostat beyin yerleştirin. Kes beyin kesitleri 5 mikron kalınlığında.
  3. boyanma
    1. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında dondurulmuş bölümler kurutun.
    2. Oda sıcaklığında 1 saat için fosfat tamponlu tuzlu suda 100% 2 keçi serumu ul ve% 0.1 Triton X-100 (PBS) ile slaytlar inkübe edin.
    3. PBS 300 ul slaytlar 3 kere yıkayın. 4 ° C'de gece boyunca ayrı (200 1) ya da anti-ferritin antikor sonra anti-GFAP (200 1) ile slaytlar kuluçkalayın.
    4. PBS 300 ul slaytlar 3 kere yıkayın. Daha sonra biyotin-konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 2 st için slaytlar inkübe edin.
    5. PBS 300 ul slaytlar 3 kere yıkayın. Daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında avidin-biyotin kompleksi (ABC) solüsyonu (1:50) ile slaytlar kuluçkalayın.
    6. PBS 300 ul slaytlar 3 kere yıkayın. 8 dakika - sonra 3,3'-diaminobenzidin 5 için (DAB) alt-tabaka çözeltisi (50 ml PBS, 10 ul H2O 2, 10 mg, DAB hap, kullanımdan önce filtre) 'de inkübe edilir. pozitif hücreler ortaya çıkıncaya kadar mikroskop altında slaytlar uyun.
    7. 5 dakika boyunca yavaş çalışan musluk suyunda slaytlar durulayın. laboratuar silin bir ile temiz slaytlar. Sonra montaj orta ve lamel ile bölümleri monte edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu modelde (Şekil 1 AC) ise, nefes nefese ve sığ respirations kısa dönemler vardı. (Bilinçsiz) bilinç kaybı solunum hızı veya normal solunumu devam etmeden önce nefes geçici fesih bir azalma olarak tanımlanır. Başın ortasına bir darbe kısa süreli bilinç kaybı nedeniyle (7.5 ± 4.7, ± 5.5 7.8, ± 8.8 10.2, ayrı ayrı etkisine 9.5 ± 8.0 sn, Şekil 1D). Fare beyinleri etkisi (Şekil 2A) bir sonucu olarak ortaya belirgin yapısal lezyonlar veya do...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

klinik durum morfolojik olarak benzer beyin yaralanmaları taklit etmek, post-sarsıntı belirtileri bekleniyor. Post-sarsıntı semptomlar genellikle baş ağrısı, baş dönmesi, baş dönmesi, yorgunluk, hafıza ve uyku problemleri, sorun konsantre yanı sıra anksiyete ve depresif ruh hali sayılabilir. somatik semptomlar henüz hayvan modellerinde ölçülebilir olabilir, bu motor ve bilişsel işlev ve duygusal davranış değişiklikleri mantıklı bir hayvan modellerinde beyin sarsıntısı değerlendirmek için bir kriter olarak kullanılır. Ön...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Florida Sağlık hibesinden (Beyin ve omurilik yaralanması araştırma fonu) (KKW) sağlanan finansmanla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anestezi makinesiEagle Eye Anesthesia, IncModel 150 Anestezi
Elektromanyetik Çarpma TertibatıLeicaBiosystemsImpact One Stereotaksik ÇarpmaTertibatı gerçekleştirme
Dijital Stereotaksik aletLeicaBiosystems39462501montaj faresi ve konumlandırma uçları
Sicilone kauçuk kaplı metal uçHassas Alet ve Mühendislik, Gainesvill FLısmarlama darbeliuç
Lityum İyon Hepsi Bir Arada DüzelticiWAHL Ev Ürünleri9854-600tıraş faresi saç
ataçlarıısmarlamaprob ucu
Pamuk uçlu aplikatörlerMEDLINEMDS202055ovma başlığı
Doku Tek OCTASKURA FINETEK USA INC4583doku gömme
anti-GFAPDakoCA93013IHC
anti Ferritin antikoruSigmaF6136antikoru IHC
VECTASTAIN Elite için ABC  kitiVektör laboratuvarlarıPK-6100IHC algılama sistemi
Permount Montaj OrtamıFisher ScientificSP15-100
Aperio XT ScanScope tarayıcıLeica Microsystems Inc,slaytları tarama
Leica AutoStainer XLLeica patoloji ŞirketiST2010H & E boyama
DAB sigmaD3939IHC algılama sistemi
tuzlu su ile için

Kaynaklar

  1. Baugh, C. M., et al. Chronic traumatic encephalopathy: neurodegeneration following repetitive concussive and subconcussive brain trauma. Brain Imaging Behav. 6 (2), 244-254 (2012).
  2. McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J. Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
  3. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75 Suppl (4), S34-S49 (2014).
  4. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimers Res Ther. 6 (5), 64(2014).
  5. Gold, E. M., et al. Functional assessment of long-term deficits in rodent models of traumatic brain injury. RegenMed. 8 (4), 483-516 (2013).
  6. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  7. Luo, J., et al. Long-term cognitive impairments and pathological alterations in a mouse model of repetitive mild traumatic brain injury. Front Neurol. , 5-12 (2014).
  8. Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Sci Rep. 10 (5), 11178(2015).
  9. Zhang, J., et al. Inhibition of monoacylglycerol lipase prevents chronic traumatic encephalopathy-like neuropathology in a mouse model of repetitive mild closed head injury. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 443-453 (2015).
  10. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
  11. Lumpkins, K. M., Bochicchio, G. V., Keledjian, K., Simard, J. M., McCunn, M., Scalea, T. Glial fibrillary acidic protein is highly correlated with brain injury. J Trauma. 65 (4), 778-782 (2008).
  12. Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
  13. Liu, H., et al. Increased expression of ferritin in cerebral cortex after human traumatic brain injury. Neurol Sci. 34 (7), 1173-1180 (2013).
  14. Jordan, B. D., et al. The clinical spectrum of sport-related traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 9 (4), 222-230 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare ModeliElektromanyetik Darbe SistemiTravmatik Beyin Hasar ModellemesiBilin Kayb l mAstrosit Aktivasyon AnaliziFerritin mm nopozitif H crelerStereotaksik er eve Konumland rmaDarbe Derinli i KalibrasyonuTekrarlay c Hasar Protokol
Farelerde Bir Tekrarlanan Concussive Kafa Travması Modeli
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.