Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Şeffaf olmayan iskelelerinin üzerinde Görüntüleme Hücre Canlılık - Roman Örme Titanyum İmplant Örnek Kullanımı

10.1K görüntülenme

DOI:

10.3791/54537

7 Eylül 2016

Bu makalede

Özet

Burada bir şeffaf olmayan titanyum iskele üzerinde hücre canlılığını tespit etmek yanı sıra iskele yabancı maddelerin Glimpses tespit etmek için bir fluorofor tabanlı görüntüleme tekniği sunuyoruz. Bu protokol, saydam olmayan iskeleler üzerine hücre-hücre ya da hücre-metal etkileşimleri görüntüleme dezavantajına giderir.

Özet

İntervertebral disk dejenerasyonu ve disk hernisi bel ağrısının en önemli nedenlerinden biridir. Nucleus pulposus (NP) ekstrüzyonu ile sonuçlanan hücre dışı matriksin tükenmesi, intervertebral disk yıkımına yol açar. Şu anda mevcut cerrahi tedaviler ağrıyı azaltır ancak omurganın mekanik işlevselliğini geri kazandırmaz. Omurganın mekanik özelliklerini korumak için, total disk veya çekirdek replasmanı böylece geniş bir ilgi alanı haline geldi. Bununla birlikte, bu artroplasti dönemi, mevcut ürünlerin hiçbiri klinik olarak değerlendirilmediği için hala olgunlaşmamış bir durumdadır.

Bu çalışma, örme titanyum tellerden yapılmış yeni bir çekirdek implantın biyouyumluluğunu test etmeyi amaçlamaktadır. Tüm mekanik avantajlara rağmen, elde edilen implant şeffaf olmadığı için malzemenin geleneksel optik analiz için sınırları vardır. Burada, iskele üzerindeki osteokondro-progenitör hücrelerin in vitro görselleştirme, izleme ve canlılık testini tanımlayan bir strateji sunuyoruz. Bu protokol, temizleme protokolünün verimliliğini görselleştirmenin yanı sıra bu ve diğer şeffaf olmayan iskelelerin biyouyumluluğunu araştırmak için de kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, hücrelerin yapışma paternisinin yanı sıra iskele üzerinde/içinde hücre canlılığı ve proliferasyon oranlarını göstermek için de kullanılabilir. Bu in vitro biyouyumluluk testi testi, şeffaf olmayan ve opak iskelelerde hücre-materyal etkileşimini analiz etmek için uygun bir araç sağlar.

Giriş

Kronik sırt ağrısı çok faktörlü bir hastalıktır. dejeneratif disk hastalığı için minimal invaziv bir tedavi seçeneği olarak ilgi 1950'lerden beri büyüdü. Bugün, omurganın çoklu segmental füzyon en yaygın kullanılan tedavi kadar. Bu yana, bu yöntem genellikle etkilenen segmentin 1,2 hareketliliği sınırlamalar yol açar, artroplasti dönemin keşif geniş bir ilgi oldu. Toplam disk değiştirme ve çekirdek yerine önemli gelişmeler kronik bel ağrısı 1 tedavi etmek için iyi bir alternatif haline gelmiştir. Büyük gelişmelere rağmen, yöntemlerin hiçbiri klinik değerlendirilmiştir. Daha az sert çekirdek implantlar, toplam disk değiştirme için umut verici....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Not: ölümsüzleştirilmiş insan mezenkimal stromal ön-madde hücreleri (SCP-1 hücreleri) deneyleri için kullanılmıştır. SCP-1 hücreleri, Dr. Matthias Schieker 12 tarafından temin edilmiştir.

SCP-1 hücrelerinin 1. Genişleme

  1. Önceki SCP-1 hücreleri ile çalışan, düzgün% 70 etanol (v / v), eldiven ile çalışma alanını (belirlenen biyogüvenlik kabini I) temizleyin.
  2. Temizlenmiş biyo-güvenlik kabini, Tablo 1 'de gösterildiği gibi gerekli bileşenlerin karıştırılması ile hücre kültür ortamında uygun bir hacmi hazırlar. Bazal ortamın sterilliğinin muhafaza etmek için, 0.22 um bir gözenek boyutuna sahi....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ön sonuçlar anlatılan yeni çekirdeği implant, sadece iyi bir sönümleme özelliklerine sahip, ancak, aynı zamanda SCP-1 hücreleri ile biyolojik olarak uyumlu olduğunu göstermiştir. İmplantın üretim işlemi sırasında, güçlü bir aşındırıcı ve zehirli maddeler (yağlama maddesi, mordan, elektro-cilalama çözelti) ile temas eder. Dolaylı floresan boyama teknikleri yardımıyla biz kalan kirleri görselleştirmek ve dolayısıyla iskele üzerinde madde yükü önemli bir azalma gösteren bir temizlik protoko.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Iskele yüzeyi bu şekilde implantlar, fonksiyonel dayanıklılığı belirlemek in vivo çevreleyen doku ile etkileşimlerinde önemli bir rol oynar. Böylece, yapı iskeletinin biyo-uyumluluk iskeleler üzerine kaplanır hücreler kullanılarak in vitro deneylerde (SCP1 hücre hattı) ile incelenmiştir.

ince ve optik olarak transparan iskeleleri ile iyi işlev mikroskopi teknikleri kötü biyouyumluluk incelemek için şeffaf olmayan iskeleleri için uygundur. Bu saydam olmayan iskeleleri önemli.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olduğunu beyan ederim. işin hiçbir bölümü olmuş ya da yayınlanmak üzere göz altında şu anda veya başka bir yerde yayımlandı gelmiştir.

Teşekkürler

Proje kısmen Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4 tarafından finanse edilmektedir. yayın ücreti BG travma hastane Tübingen, Almanya tarafından kapatılmıştır.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6/24/48 kuyulu plakalar, T25/ T75 kültür şişesiGreiner Bio-One GmbH*
* 24 kuyulu plakalarGreiner Bio-One GmbHCELLSTAR 662 160
* 48 kuyulu plakalarCorning Incorporated USA3548
* 6 kuyulu plakalarFalcon353046
* T25Greiner Bio-One GmbH690 175
* T75Greiner Bio-One GmbH658 175
Asetik asit, purum & ge; %99,0Carl Roth3738.4
AsetonCarl Roth5025.1
Axioplan-2 Carl Zeiss, Almanya
Biyolojik güvenlik kabinleriThermo Scientificsafe 2020
Calcein asetoksimetil ester (kalsein)Sigma17783
Hücre Kültürü İnkübtatörBağlayıcı, Tuttlingen, Almanya9040-0078
Filtre ünitesi (0.22 ve mikro; m)Millipore, IRLSLGP033RS
Santrifüjleri 5810 R ve 5417 RThermo Fisher Scientific, NYMegafuge 40R
Dimetilsülfoksit (DMSO)Carl Roth4720.2
Dulbecco' Ca & olmadan s PBS MgSigmaH15-002
Etanol %99  SAV sıvı ürün. GmBH475956
Etidyum homodimerSigma46043
EVOS Floresan görüntüleme sistemiYaşam teknolojileriAMF4300
Fetal Sığır Serumu (FCS)Gibco10270-106
HemositometreHausser Scientific, PA, ABD
Hoechst 33342Sigma14533-100MG
Örme titanyum çekirdek implantıBuck co & KG, Almanya
SigmaE15-832ile Glutamin ile MEM Alfa Modifikasyonu
, AlmanyaFLUOstar Omega Penisilin
/ StreptomisinSigmaP11-010
Resazurin sodyum tuzuSigma199303-1G
Sülforhodamin B sodyum tuzuSigmaS1402-1G
Test tüpü döndürücüLabinco BV, HollandaModeli LD-76
TRIS (hidroksimetil) aminometanCarl RothAE15.1
TritonCarl Roth3051.2
Tripan Mavisi %0.5Carl RothCN76.1
Tripsin / EDTASigmaL11-004
Nükleosit Omega mikroplaka Okuyucu BMG Labtech

Kaynaklar

  1. Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What's new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
  2. Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
  3. S....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Şeffaf Olmayan İskele GörüntülemeHücre Canlılığı TestiFloresan Görüntüleme TeknikleriOsteokondro-progenitör HücrelerCanlı-Ölü BoyamaRezazurin Dönüşüm Analiziİskele Temizleme ProtokolüHücre Adezyon AnaliziFloresan Mikroskopi