Yöntem makalesi

Oluşturma ve diyabetik yara iyileşmesi manken bir yağ elde edilen kök hücre (ASC) Sheet nakli

DOI:

10.3791/54539

⸱

4 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetic Center, Tokyo Women's Medical University School of Medicine, 2The Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University, 3The Department of Anatomy and Developmental Biology, Tokyo Women's Medical University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs) kolayca izole ve normal sıçanlar FAT'tan hasat. ASC yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanılarak oluşturulabilir ve tam-kalınlık sergilenmesi diyabetik yağlı sıçanlar kusurları maruz kemik ile deri ve suni deri bilayer ile kaplı Zucker içine nakledilmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapay cilt klinik pratikte önemli tedavi edici sonuçlar elde etti. Ancak, Yapay cilt tedavileri engellemiştir kan akımı veya büyük yaralar ile diyabetik hastalarda yaralar için uzun süreli. Hücre tabanlı terapiler diyabetik ülser tedavisi için yeni bir teknik olarak yer aldı ve hücre sayfalık mühendislik hücre transplantasyonu etkinliğini geliştirdi. Raporlar bir dizi yağ kaynaklı kök hücreler (ASCs), bir tür Mezenkimal stromal hücre (MSC), yağ dokusu ve onların erişilebilirlik için MSCs diğer dokulardan karşılaştırıldığında koleksiyonu için göreli onların bereket nedeniyle tedavi potansiyel sergi tavsiye ettiler. Bu nedenle, ASCs kök hücre terapötik kullanım için iyi bir kaynak gibi görünüyor. Bu çalışmada, ASC sayfaları normal Lewis sıçan epididimal yağ yağ sıcaklık duyarlı kültür yemekleri ve normal kültür askorbik asit içeren orta kullanarak başarıyla oluşturuldu. ASC sayfaları Zucker diyabetik yağ (ZDF) fareler nakledilen, yaranın normal tip 2 diyabet ve obezite, azalmış sorun oluşturan bir fare modeli. Bir yara arka kafatası yüzeyinde oluşturuldu, ASC sayfaları yara içine nakledilen ve bilayer Yapay deri çarşafları kapsayacak şekilde kullanıldı. ASC sayfaları alınan ZDF fareler daha iyi ZDF fareler ASC sayfaları nakli olmadan daha yaranın. ASC sayfası nemli yara çevre bakım gerektiren kuru şartlarda için duyarlı olduğundan bu yaklaşım sınırlıydı. Bu nedenle, Yapay cilt kurutma önlemek için ASC sayfası kapsayacak şekilde kullanıldı. ASC sayfaları Yapay deri ile birlikte allojenik nakli de diğer zorlu ülser veya burns, bu kollajen hastalığı, periferik arter hastalığı ile gözlenen gibi geçerli olabilir ve Beslenme yetersizliği veya steroid kullanan hastalar için yönetilen. Böylece, bu tedavi diyabetik yara iyileşmesi için tedavi olanakları geliştirmeye yönelik ilk adım olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik hastalar nüfusu dünya çapında artan ve 20151400 milyon ulaştı; Diyabetli hastaların yaklaşık 15-%25 etkilenir alt ekstremite diyabetik ülser2ilerleme. Alt ekstremite diyabetik ülser zorlu ve uzun süreli tedavi nokta ile rehabilitasyon eğitim tam kurtarma sonra gereksinim duyabilir. Uzun tedavi süresi genellikle hastanın yaşam kalitesini önemli bir azalma olur. Böylece, yeni tedaviler tırmandığı önlemek veya azaltmak diyabetik yaralar tedavisi için geliştirilmelidir. Diyabetik yara iyileşmesi değerlendirmek için biz pratik klinik koşulları taklit eder, bir diyabetik ülser yara iyileşmesi modeli içinde rats, en iyi duruma getirilmiş ve değerlendirilmiş olup yağ kaynaklı kök hücre (ASC) yaprak hücre sayfalık mühendislik kullanarak dikim hızlandırılmış yaranın normal iyileşmesi.

Mezenkimal stromal hücre (MSCs) kendi kendini yenileme kapasitesi, immunomodulatory etkileri ve yeteneklerini çeşitli hücre soy3içine ayırmak için nedeniyle yara iyileşmesi hızlandırılması için mükemmel bir potansiyel sergi. ASCs MSC Yağ dokusundan elde edilen bir türüdür ve onların anjiogenik potansiyel ve parakrin etkinlik4,5de dahil olmak üzere diğer dokulardan türetilmiş MSCs çeşitli avantajlar sergilemek. Yağ dokusu insan vücudunda nispeten bol ve minimal invaziv yordamları kullanarak koleksiyonu için erişilebilirlik sağlar. Bu nedenle, ASCs deneysel olarak yara iyileşmesi uygulamaları6,7için kullanılmaktadır.

Önceki raporları tek hücreli MSC süspansiyonlar direkt enjeksiyon yara çevresinde alanlara8,9şifa yara hızlandırabilir göstermiştir. Ancak, tek hücreli süspansiyonlar enjeksiyon takip diyabetik ülser modellerinde yara iyileşmesi ivme raporları rağmen yara yerinde transplante hücre sağkalım süresi net değildir.

Bu çalışmada, biz sıcaklık duyarlı kültür yemekleri kullanarak hücre sayfalık mühendislik uygulanır. Bu yemekleri onların yüzey10kovalent bağlı sıcaklık duyarlı polimer N- isopropylacrylamide var. Aşılı polimer tabaka ısı kontrollü hücre adezyon veya kültür çanak yüzeyinden dekolmanı için izin verir. Çanak yüzeyi 32 ° c altındaki sıcaklıklarda Hidrofil hale geldiğinde hücreleri kendiliğinden yüzeyinden ayırmak ise uygun ve çoğalırlar, hücrelere izin 37 ° C'de hidrofobik hale gelir Kültürlü hücreler bitişik hücre sabıkası olduğu gibi hücre hücre kavşaklar ve ekstraselüler matrisler (ECMs) olarak sadece sıcaklık azaltarak hasat edilebilir; Böylece, ECM, tripsin gibi zarar proteolitik enzimler gerekli11değildir. Bu nedenle, hücre sayfalık mühendislik hücre hücre bağlantıları korumak ve hücre transplantasyonu etkinliğini artırmak.

Ayrıca, hücre-saç ekimi ne zaman hücre enjeksiyon12' ye göre hücre sağkalım oranları artar. Bu protokol için Zucker diyabetik yağlı (ZDF) fareler gecikmiş yara iyileşmesi ile tip 2 diyabet ve obezite model olarak seçildi. ZDF fareler kendiliğinden yaklaşık 4 hafta obezite geliştirmek. Daha sonra 8 ile 12 hafta-in yaş, bu noktada onlar insülin direnci, dislipidemi ve hipertriglisemik13ile ilişkili hiperglisemi sergi arasında obezite ile tip 2 diyabet geliştirmek. Gecikmiş yara periferik kan damarları ve diyabetik nefropati azaltılmış kan akımını şifa, ayrıca14,15,16görülmektedir. Ayrıca, ZDF fareler zorlu Kutanöz ülser, diyabetik ülser gibi şifa eğitim için uygun bir model olabilir.

Yara iyileşmesi mekanizmaları kemirgenler ve insanlar arasındaki farklılıkları deride anatomik farklılıklar ile ilişkilidir. İse insanlarda yara iyileşmesi yeniden epithelialization ve granülasyon dokusu oluşumu üzerinde de, normal fareler şifa yara yara kasılması, temel alır. Genellikle, kemirgen modellerinde kullanılan yara splint yara daralma en aza indirmek için yardımcı olur ve yaralar diyabetik Sıçanlarda neredeyse tamamen daralma tarafından kapatılır, ancak granülasyon dokusu17, kademeli oluşumu için sağlar. Ancak, daralma diyabetik yara ZDF içinde fareler Engelli ve öncelikle şifa yara oluşur yeniden epithelialization ve granülasyon dokusu oluşumu; Bu nedenle, bu işlem daha14şifa insan yara benzerdir.

Debridman sık karşılaşılan sonra klinik olarak maruz kalan kemik ile diyabetik yaralar. Önceki çalışmalarda 12 mm çap tam kalınlıkta deri yaraları korele çıplak fareler18,19 sırtında ve 10 mm çap tam kalınlıkta deri yaraları normal farelere20sırtında inceledik. Şiddetli diyabetik yaralar için klinik bir model geliştirmek için daha büyük (15 x 10 mm2) tam kalınlıkta deri kusurları ile kemik maruz ve kapaklarini olarak yukarıda açıklanan21, tip 2 diyabet ve obezite ile Sıçanlarda oluşturulan.

Sıçan ASC (rASC) normal Lewis sıçan ASCs sayfalarından ASC sayfaları allojenik nakli oluşturulmuştur. Diyabetik hastalarda ülser kez kontrolsüz yüksek kan şekeri ve yüksek vücut kitle endeksi ve yağ dokusu bu hastalardan elde etme zorluğu artırmak bu komplikasyonlar neden yara iyileşmesi bozukluklar gibi ağır diyabetik komplikasyonlar sergilemek çünkü klinik uygulamada, Otolog transplantasyon olanaksız. Ayrıca, ASCs diyabet sergi ile hayvanlardan özellikleri değişmiş ve işlev22Engelli. Bu nedenle, normal sıçanlar rASC sayfalarından allojenik nakli ve Yapay cilt uygulamaya diyabetik sıçan burada sunulan protokolünü açıklar.

Bu protokol için kullanılan bilayer Yapay deri yaraları spontan daralma engeller, yeni bir bağ dokusu matris sentezini teşvik ve gerçek DermIS23benzer. Bu protokol için yapay deri bir rASC sayfaya yerleştirilen ve yara daralma veya gevşek sıçan derisinden kaynaklanan genişleme önlemek için naylon konu ile sabit. Buna ek olarak, suni deri için ASC yaprak üç boyutlu bir çerçeve sağlar, transplante ASC sayfaları ve yaralar için nemli bir ortamın yaratıldığı ve yaralar enfeksiyon ve dış güçler korur. Son olarak, yapışkan olmayan soyunma dış etki korumak, nemli yara ortamı korumak ve çıktı absorbe yara yerleştirilir.

Bir rASC sac ince, esnek ve deforme ve dayak kalp24gibi alıcı siteler hareket için yapıştırılır. Hücre sayfalık mühendislik çeşitli dokuların yeniden inşası için kullanılan ve iyileştirici etkileri25,26. -ebilmek oluşturmak Klinik tedavi potansiyel sergi ASC sayfaları yaralar birçok türleri konusunda bilgi sahibi şifa hızlandırmak. Ayrıca, allojeneik nakli ASC yaprak, suni deri, kullanımı ile kombine tedaviye dirençli ülser veya burns, bu periferik arter hastalığı veya kollajen hastalığı, gözlenen gibi geçerli olabilir veya Beslenme yetersizliği veya steroid kullanan hastalar için yönetilen. Bu yaklaşım ASCs nakli verimliliğini artırır. Yara iyileşmesi ZDF fare modeli işlem şifa insan yara benzer ve küçük ölçekli deneysel hayvan klinik koşullarda taklit eden bir ağır yara koşul üretir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda sunulan tüm deney protokolleri, Tokyo Kadın Tıp Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmış ve Hayvan Deneylerinin Uygun Şekilde Yürütülmesine İlişkin Kılavuzun tüm gerekliliklerine uyulmuştur.

1. Hayvanların, Aletlerin, Kültür Ortamlarının ve Yemeklerin Hazırlanması

  1. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren minimum esansiyel orta alfa kullanarak tam kültür ortamı hazırlayın. Kullanana kadar bunu 4 ° C'de birkaç ay saklayın.
  2. Tip 2 diyabetik obezite modeli olarak yetişkin erkek ZDF sıçanlarını kullanın. Hücre tabakalarını hazırlamak için yağ dokusunu izole etmek için erkek Lewis sıçanlarının yağ pedini kullanın.

2. rASC'lerin İzolasyonu ve Kültürü

  1. İzofluran kullanarak genel anestezi altında Lewis sıçanlarından (8-33 haftalık, erkek) yağ dokusu elde edin.
    1. Bir kemirgen mekanik ventilatör ve% 4 izofluran hazırlayın. Birkaç steril pamuk ucu, temiz gazlı bez, bir neşter, bir iğne tutucu, ameliyat makası, bir çift forseps ve 5-0 naylon sütür hazırlayın. Cerrahi aletleri ve malzemeleri sterilize edin.
    2. Elde edilen yağ dokusunu geçici olarak korumak için 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 100 mm'lik bir Petri kabı hazırlayın. Toplanan yağ dokusunu ölçmek için ameliyata başlamadan önce Petri kabını bir terazi kullanarak PBS ile tartın. Cerrahi aletleri ve malzemeleri steril bir örtü üzerine yerleştirin.
      3. Bir
    3. kemirgen mekanik ventilatörü aracılığıyla% 3 - 4 oranında izofluran kullanarak sıçanları uyuşturun ve ameliyat sırasında sıçanları% 2 - 3 izofluranda tutun. Her sıçanın solunum derinliğini ve hızını gözlemleyerek anestezi derinliğini izleyin.
    4. Steril eldiven giyerken, fareyi steril bir örtü üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ameliyat bölgesini elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin ve farenin karın bölümünü% 70 etanole batırılmış steril gazlı bez kullanarak temizleyin.
    5. Sıçanın lateral alt karnında bir neşter ile yaklaşık 5 cm uzunluğunda bir cilt kesisi oluşturun. Dış eğik kası açığa çıkarın ve inceleyin. Ardından, epididimiyi çevreleyen epididimal yağ dokusunu açığa çıkarın. Epididimal yağ dokusunu nazikçe dışarı çekin.
      NOT: Yağ dokusu, sıçanın karnının her iki tarafından da elde edilebilir.
    6. Epididim, testis ve epididimal kan damarlarına zarar vermekten kaçınarak sadece epididimal yağ dokusunu eksize edin (Şekil S1). Kuruluğu önlemek ve dokuyu tartmak için eksize edilen yağ dokusunu PBS'deki Petri kabına batırın.
    7. Karın kasını 5-0 VICRYL ile ve cildi 5-0 naylon sütür ile kapatın. Ardından, ameliyat geçiren her fareyi ayrı bir kafese koyun (kafes başına bir fare).
      NOT: Fareleri tamamen iyileşene kadar izleyin.
  2. rASC'leri 2-3 g yağ dokusundan izole edin (bir Lewis sıçanından eksize edilir ve daha önce bildirilen bir yönteme göre işlenir)27. Kısaca, eksize edilen yağ dokusunu %0.1 tip A kollajenaz ile 37 ° C'de 1 saat süreyle stromal-vasküler fraksiyonu elde etmek için enzimatik olarak sindirin (SVF; Şekil S2).
    1. Biyolojik olarak temiz bir tezgahta birkaç 100 μm hücre süzgeci, birkaç 50 mL tüp, birkaç 15 mL tüp ve iki neşter hazırlayın. Bir santrifüjü açın ve bir su banyosunu 37 °C'ye ısıtın. Ek olarak,% 0.1 (nihai konsantrasyon) A tipi kollajenaz içeren 50 mL'lik bir tüpte yaklaşık 50 mL steril PBS hazırlayın.
    2. Yağ dokusunu iki neşter kullanarak küçük parçalar halinde kıyın.
    3. Tüm kıyılmış yağ dokusunu 50 mL'lik bir tüpe taşıyın ve toplam hacmi 15 mL'ye getirmek için PBS ekleyin.
    4. 50 mL'lik tüpü 5 dakika dik olarak dinlendirin. Üst katmanı atın ve kalıntılar dışında alt katmanı toplayın.
    5. Yağ dokusunu enzimatik olarak sindirmek için üst tabakayı içeren PBS ile 50 mL'lik tüpe A tipi kollajenaz çözeltisinin% 0.1'ini ekleyin.
      NOT: 37 ° C'lik bir su banyosunda 2 - 3 g yağ dokusu başına yaklaşık 20 mL PBS'yi ısıtın.
    6. 50 mL'lik tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca 120 - 130 rpm'de hafifçe eğin ve sallayın.
    7. 50 mL'lik tüpü çalkaladıktan sonra 5 dakika dik olarak dinlendirin.
    8. Çözeltiyi 100 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak süzün ve çözeltiyi 50 mL'lik yeni bir tüpe dökün. Filtrelenmiş çözeltiyi iki adet 15 mL'lik tüpe dağıtın.
    9. Çözeltiyi 15 mL'lik tüplerde 700 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantın üst tabakasını dikkatlice çıkarın ve çözeltinin alt tabakasından 5 mL bırakın. Peleti aspire etmeyin.
    10. Her 15 mL tüpe, 15 mL tüp başına 10 mL'ye kadar yaklaşık 5 mL tam kültür ortamı ekleyin ve peleti dikkatlice yeniden süspanse edin.
    11. 2.2.8 - 2.2.9 arasındaki adımları tekrarlayın. Ardından, SVF'yi edinin.
  3. İki adet 60 cm2 kültür tabağı hazırlayın. SVF'yi 700 × g'da 5 dakika boyunca iki santrifüjlemeden sonra toplayın. SVF'yi askıya alın ve her 60cm2 kültür kabına 10 mL SVF solüsyonu koyun.
  4. Bulaşıkları %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 24 saat boyunca kültürleyin.
  5. Kullanıma kadar 4 ° C'de birkaç ay saklanabilen PBS ve% 0.25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) hazırlayın.
  6. İlk kaplamadan sonra (24 saat), bağlanmamış hücreleri ve kalıntıları temizlemek için hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın. Taze tam ortam ekleyin.
  7. 3. günde neredeyse alt birleşim halinde olan hücreleri geçin. 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 3 - 5 dakika < br / > inkübe edin NOT: Hücre hasarını önlemek için tripsinizasyon adımını 10 dakika içinde tamamlayın.
  8. Tüm hücrelerin bulaşıklardan tamamen ayrıldığını doğrulamak için tripsinizasyondan sonra hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Ardından, bulaşıklara 9 mL tam kültür ortamı ekleyin.
  9. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın.
  10. Hücreleri 1.7 x 103 hücre /cm2 yoğunlukta her 3 günde bir geçiş 3'e kadar alt kültürleyin 3. Alt kültürlenmiş hücreleri% 5 CO2 inkübatörünün nemlendirilmiş atmosferinde 37 ° C'de kültürleyin.

3. rASC Sayfalarının Oluşturulması

  1. 35 mm çapında birkaç sıcaklığa duyarlı kültür kabı hazırlayın. Bulaşıkları 37 °C'de %5CO2 inkübatörde 1 h.
    'den fazla süreyle FBS (veya FBS içeren tam ortam) ile önceden kaplayın NOT: 35 mm çapında sıcaklığa duyarlı bir kültür kabı, ticari olarak temin edilebilen bir üründür.
  2. Bir termo plaka hazırlayın ve aşağıdaki deneysel prosedürler için 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Hücrelerin tabaktan kendiliğinden ayrılmasını önlemek için 37 °C'lik bir termo plaka üzerinde sıcaklığa duyarlı kültür kapları kullanarak her prosedürü gerçekleştirin.
    1. Deneyden önce prosedürlerde kullanılan tüm kültür ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
    2. Lewis sıçanlarından türetilen 3 rASC'nin, toplam 2 mL hacminde tam kültür ortamı kullanılarak 3 gün boyunca 1.5 x 105 hücre / tabak yoğunluğunda 35 mm çapında sıcaklığa duyarlı bir kültür kabına tohum geçişi.
      NOT: rASC'ler yeni bir kültür kabı üzerine kaplandığında, tek tip rASC tohumlaması ve eşit kalınlıkta bir rASC tabakası elde etmek için çanak bir inkübatörde yavaşça ileri geri ve sola ve sağa sallanmalıdır.
    3. 37 ° C'lik bir termo plaka üzerinde inkübe edilen sıcaklığa duyarlı kültür kaplarına tohumlamadan sonraki 3. günde ortamın 2 mL'sini 16.4 μg / mL L-askorbik asit fosfat, magnezyum tuzu n-hidrat (AA) içeren tam kültür ortamının 2 mL'sini değiştirin.
      NOT: Çözünmüş AA -30 °C'de aylarca saklanabilir.
    4. Hücreleri 4-5 gün daha kültürleyin ve ortamı her 2 günde bir AA içeren taze ortamla değiştirin.
    5. Bitişik bir hücre tabakasındaki hücreler arasında boşluklar olup olmadığını belirlemek için bir ışık mikroskobu altında ASC'lerin çoğalmasını ve oluşumunu onaylayın.
  3. Hücre tabakalarını oda sıcaklığına soğutmak için 15 - 20 dakika boyunca inkübatörden tezgah üstüne aktarın; hücrelerin bitişik bir hücre tabakası olarak kendiliğinden ayrıldığını gözlemleyin. rASC tabakasını bir çift forseps ile bulaşık yüzeyinden hasat edin.
    NOT: Genellikle, rASC tabakaları bir çift forseps ile ele alınabilir. Gerekirse, hücre tabakası kırılgan ve kırılgansa, bir hücre tabakasını kültür kabından yara bölgesine aktarmak için bir transfer zarı kullanılabilir.

4. Tam Kat Deri Defekti Yara Modelinin Hazırlanması ve rASC Levhalarının Transplantasyonu

  1. Bir kemirgen mekanik ventilatör ve% 4 izofluran hazırlayın. Birkaç steril pamuk ucu, temiz gazlı bez, 5-0 naylon sütür, bir neşter, bir periosteal raspatory, bir iğne tutucu, ameliyat makası ve bir çift forseps hazırlayın. Cerrahi aletleri ve malzemeleri sterilize edin. Cerrahi aletleri ve malzemeleri steril bir örtü üzerine yerleştirin.
  2. PBS'yi hazırlayın ve biraz yapay cilt ve yapışkan olmayan bir pansuman ile birlikte oda sıcaklığında tutun. Yapay cildi (15 x 10 mm) ve yapışkan olmayan sargıyı (20 × 15 mm) önceden kesin. Yapay cildi kullanmadan önce yapay cildin iç kollajen sünger tabakasını tuzlu suya batırın.
    NOT: Yapay deri iki katmandan oluşur: bir dış silikon tabaka tabakası ve bir iç kollajen süngeri.
  3. ZDF sıçanlarını (16 - 18 haftalık, erkek, 500 - 600 g) tip 2 diyabet ve obezite için yara iyileşme modeli olarak kullanın.
  4. Bir kemirgen mekanik ventilatörü kullanarak% 4 izofluran soluyarak ZDF sıçanlarını uyuşturun. Kemirgen mekanik ventilatörü ile% 4 - 5 oranında izofluran kullanarak anesteziyi indükleyin ve ameliyat sırasında% 3 - 4'te tutun. Her bir sıçanın solunum derinliğini ve hızını bir ayak parmağı tutamıyla gözlemleyerek anestezi derinliğini izleyin.
  5. Steril eldiven giyerken, fareyi steril bir örtü üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin. % 70 etanole batırılmış steril gazlı bez kullanarak farenin başını temizleyin, ameliyat bölgesini elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin ve% 70 etanole batırılmış steril gazlı bez kullanarak tıraştan sonra cildi temizleyin.
  6. Anestezi uygulanmış ZDF sıçanlarının kafasında epidermisten periosteuma kadar kutanöz dokuyu çıkararak kare şeklinde tam kalınlıkta bir cilt defekti (15 x 10 mm2) oluşturun. Cildi ve deri dokusunu bir neşter ile eksize edin ve periosteuumu bir periosteal raspatory ile çıkarın.
  7. 35 mm sıcaklığa duyarlı kültür kabı üzerindeki rASC'leri, transplantasyondan hemen önce inkübatörden oda sıcaklığındaki bir ortama taşıyın.
  8. 35 mm'lik sıcaklığa duyarlı kültür kabı üzerindeki rASC'lerin, bir yara oluştuktan sonra tabak yüzeyinden bir tabaka halinde kendiliğinden ayrıldığını gözlemleyin. Sıcaklığa duyarlı kültür kaplarında 7 günlük kültürlemeden sonra rASC tabakalarını hasat edin. Kültürlü ortamı çıkarın ve rASC tabakasını PBS ile üç kez yıkayın. Kurumayı önlemek için rASC tabakasını transplantasyona kadar PBS'de bekletin.
  9. rASC tabakasını bir çift forseps kullanarak hemen kafatası kusurunun üzerine yerleştirin. Hücre tabakası kırılgan ve kırılgansa, hücre tabakasını kültür kabından yara bölgesine aktarmak için bir zar iskele olarak kullanılabilir.
  10. rASC tabakasını ve defekti yapay deri (15 x 10 mm2) ile örtün ve yarayı 5-0 naylon sütür kullanarak yaklaşık 10 dikişle kapatın. Yarayı korumak için, yara ortamını nemli tutmak ve eksüdaları emmek için 5-0 naylon dikişler kullanarak yapay cildin üzerine yapışkan olmayan bir pansuman (20 x 15 mm2) yerleştirin.
    NOT: Yapışkan olmayan pansumanlar, uygulamadan sonraki birkaç gün içinde ZDF sıçanları tarafından çıkarılacaktır. Bu nedenle, transplantasyondan sonra sıçanları düzenli olarak izlemek gerekir. Genellikle, yapışkan olmayan pansuman genel anestezi altında her 2 günde bir değiştirilir.
  11. Ameliyat geçiren her fareyi, tamamen iyileşene kadar ayrı bir kafese koyun (kafes başına bir sıçan). Bir gözlem süresinden sonra, onaylanmış izofluran doz aşımı yöntemini kullanarak sıçanları ötenazi yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu iletişim kuralı bir yeni hücre tabanlı terapi dirençli diyabetik yaralar için kurmak çalıştı. (Olarak şekil 1' deki resimli), kısaca allojeneik rASC sayfaları normal sıçanlarından emir hücre sayfalık mühendislik kullanılarak oluşturulmuş ve sonra suni deri üzerine bir tam kalınlıkta deri kusur bilayer bir diyabetik sıçan kullanarak nakledilmektedir. İyi bir örnek bir rASC sayfasının (şekil 2A) ve kötü bir örnek bir rASC sayfasının (şekil 2B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir rASC sayfası başarıyla kültür için en kritik adımlar şunlardır: 1) sıcaklık sıcaklık duyarlı kültür yemekleri kültür sırasında yaklaşık olarak 37 ° C'de saklanması gerekir. Bir rASC sayfası oluşturma sırasında her yordam 37 ° C termo-plaka üzerinde gerçekleştirilmiş ve her reaktif kendiliğinden çanak31ayırma hücreleri önlemek için 37 ° c ısıttı. 2) alıcı ZDF fareler rASC sayfaları başarılı ekimi için kritik olmayan yapışkan soyunma kaldırılmasını önlemek için izlenmesi gerekir. Soyunma kaldırı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansal ilişkileri bu yayın için ilgili aşağıdaki yazarlar ifşa: Teruo Okano kurucusu ve Yöneticisi, teknoloji ve patent Tokyo kadın Tıp Üniversitesi'nden lisans verir, hücre tohum Inc.'in yönetim kurulu ve Teruo Okano ve Masayuki Yamato paydaşların hücre tohum A.ş Tokyo kadın Tıp Üniversitesi Araştırma Fonu hücre tohum Inc alır Diğer yazarlar onlar finansal ilişkileri bu yayına ilgili yok bildirin.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Dr Yukiko Koga bölümü plastik ve Rekonstrüktif cerrahi, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi, pratik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Biz de Bay Hidekazu Murata diyabetik Merkezi, Tokyo kadın Tıp Üniversitesi Tıp Fakültesi mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışmada oluşturma yenilik merkezleri tarafından gelişmekte olan yenilik sistemleri "hücre sayfası doku Mühendisliği Merkezi (CSTEC)" için projenin disiplinler arası araştırma alanları programı gelişmiş için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT) Japonya'nın desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
α-MEM glutamaxInvitrogen32571-036Carlsbad, CA
Fetal sığır serumu (FBS)Japan Bioserum Co Ltd.S1650-500
Penisilin / streptomisinYaşam Teknolojileri15140-122
Kollajenaz ARoche Diagnostics10 103 578 001Mannheim, Almanya
60 cm2 Primaria doku kültürü kabıBD Biosciences353803Franklin Lakes, NJ
Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin (PBS)Yaşam Teknolojileri1490-144
% 0.25 Tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (EDTA)Life Technologies25200-056
L-askorbik asit fosfat magnezyum tuzu n-hidratWako013-19641
35 mm sıcaklığa duyarlı kültür kabı (UpcellTM)CellSeedNUNC-174904Tokyo, Japonya
Mikro sıcak plaka (MP-1000)Kitazato Science Co., Ltd. 1111
Kemirgen mekanik ventilatörÇalmak# 50206Wood Dale, IL
% 4 izofluranPfizer Japonya114-13340-3Tokyo, Japonya
Yapay cilt (Pelnac® )Smith & YeğeniPN-R40060  Tokyo, Japonya
Yapışkan olmayan pansuman (Hydrosite plus® )Smith & Yeğeni66800679Allevyn non-adhessing® olarak bilinir; Amerika Birleşik Devletleri'nde
5-0 naylon sütürAlfresaEP1105NB45-KF2
20 CELLSTAR TÜPLERİgreiner bio-one227 261
15 mL Santrifüj TüpüCorning Incorporated430791
14 GOLDMAN-FOX PERIOSTEALHu-FriedyP14Chicago, IL

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 7 ed.. , International Diabetes Federation. Brussels, Belgium. Available from: http://www.diabetesatlas.org/ (2015).
  2. Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. The global burden of diabetic foot disease. Lancet. 366 (9498), 1719-1724 (2005).
  3. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  4. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  5. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Laharrague, P., Cousin, B. Adipose-derived stromal cells: Their identity and uses in clinical trials, an update. World J Stem Cells. 3 (4), 25-33 (2011).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  7. Zuk, P. The ASC: Critical Participants in Paracrine-Mediated Tissue Health and Function. , (2013).
  8. Nie, C., et al. Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis. Cell Transplant. 20 (2), 205-216 (2011).
  9. Shin, L., Peterson, D. A. Human mesenchymal stem cell grafts enhance normal and impaired wound healing by recruiting existing endogenous tissue stem/progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 33-42 (2013).
  10. Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide). J Biomed Mater Res. 27 (10), 1243-1251 (1993).
  11. Yamato, M., et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. Tissue Eng. 7 (4), 473-480 (2001).
  12. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  13. Kuhlmann, J., et al. Intramyocellular lipid and insulin resistance: a longitudinal in vivo 1H-spectroscopic study in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 52 (1), 138-144 (2003).
  14. Slavkovsky, R., et al. Zucker diabetic fatty rat: a new model of impaired cutaneous wound repair with type II diabetes mellitus and obesity. Wound Repair Regen. 19 (4), 515-525 (2011).
  15. Oltman, C. L., et al. Progression of vascular and neural dysfunction in sciatic nerves of Zucker diabetic fatty and Zucker rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (1), E113-E122 (2005).
  16. Coppey, L. J., Gellett, J. S., Davidson, E. P., Dunlap, J. A., Yorek, M. A. Changes in endoneurial blood flow, motor nerve conduction velocity and vascular relaxation of epineurial arterioles of the sciatic nerve in ZDF-obese diabetic rats. Diabetes Metab Res Rev. 18 (1), 49-56 (2002).
  17. Galiano, R. D., Michaels, V., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 12 (4), 485-492 (2004).
  18. Lin, Y. C., et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. Acta Biomater. 9 (2), 5243-5250 (2013).
  19. McLaughlin, M. M., Marra, K. G. The use of adipose-derived stem cells as sheets for wound healing. Organogenesis. 9 (2), 79-81 (2013).
  20. Cerqueira, M. T., et al. Human adipose stem cells cell sheet constructs impact epidermal morphogenesis in full-thickness excisional wounds. Biomacromolecules. 14 (11), 3997-4008 (2013).
  21. Koga, Y., et al. Recovery course of full-thickness skin defects with exposed bone: an evaluation by a quantitative examination of new blood vessels. J Surg Res. 137 (1), 30-37 (2007).
  22. Cianfarani, F., et al. Diabetes impairs adipose tissue-derived stem cell function and efficiency in promoting wound healing. Wound Repair Regen. 21 (4), 545-553 (2013).
  23. Matsuda, K., Suzuki, S., Isshiki, N., Ikada, Y. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials. 14 (13), 1030-1035 (1993).
  24. Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med. 12 (4), 459-465 (2006).
  25. Iwata, T., et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Elloumi-Hannachi, I., Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering: a unique nanotechnology for scaffold-free tissue reconstruction with clinical applications in regenerative medicine. J Intern Med. 267 (1), 54-70 (2010).
  27. Watanabe, N., et al. Genetically modified adipose tissue-derived stem/stromal cells, using simian immunodeficiency virus-based lentiviral vectors, in the treatment of hemophilia. B. Hum Gene Ther. 24 (3), 283-294 (2013).
  28. Kim, W. S., et al. Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 48 (1), 15-24 (2007).
  29. Nakagami, H., et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (12), 2542-2547 (2005).
  30. Asahara, T., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 18 (14), 3964-3972 (1999).
  31. Kato, Y., et al. Allogeneic transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet combined with artificial skin accelerates wound healing in a rat wound model of type 2 diabetes and obesity. Diabetes. , db141133(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adipoz Kaynakl K k H crelerS cakl a Duyarl K lt r KabStromal Vask ler FraksiyonZucker Diyabetik Ya l S anYapay DeriH cre TransplantasyonuEpididimal Adipoz DokuTam Kat Deri Defekti

İlgili makaleler