Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için
Bu makalede
Özet
Özet
Birçok paralellik. Drosophila memeli adaptif bağışıklık karakterize lenfoid soyu eksikliği olsa bile, Drosophila ve memeli hematopoetik sistemler arasında mevcut Drosophila ve memeli hematopoez çeşitli kan hücre soylarından üretmek için mekansal ve zamansal farklı aşamalarında ortaya çıkar. Her iki sistem de genişletmek veya olgun soy yerine hangi kan hücresi atalarıdır rezervuarları korumak. Hematopoetik sistem Drosophila ve memeliler yanıt vermek ve bağışıklık zorluklara uyum sağlar. Önemlisi, nesil, bakım ve hematopoetik sistemin fonksiyonunu kontrol transkripsiyonel düzenleyicileri ve sinyal yolları memelilere sinekler muhafaza edilir. Bu benzerlikler Drosophila genetik model, hematopoetik gelişimi ve hastalığa kullanılmasına izin.
Burada ayrıntı deneyleri Drosophila larvaların hematopoetik sistemi incelemek için. İçindeÖzellikle, biz, kan hücre sayıları ve konsantrasyonu ölçmek in vivo belirli bir olgun soy görselleştirmek ve dolaşımdaki ve hematopoetik organ kan hücrelerinde immünhistokimya gerçekleştirmek için yöntemler özetlemektedir. Bu deneyler, gen ifadesi değişikliklerini ve sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hücresel süreçleri ortaya çıkarabilir ve hematopoezisi ilgili çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Drosophila uygun genetik araçlar ile birlikte, bu deneyler, tanımlanmış genetik değişiklikler üzerine hematopoietik sistem değerlendirmek için de kullanılabilir. Özellikle, burada belirtilen olmasa da, bu deneyler, aynı zamanda hematopoietik sistemi üzerinde enfeksiyon veya diyet gibi çevresel değişiklikleri, etkisini incelemek için kullanılabilir.
Giriş
hematolojik hastalıklarda hematopoetik sisteminin geliştirilmesi ve bu arızaya koordinat transkripsiyon faktörlerini ve sinyal yolları düzenleyen karmaşık mekanizmalar yeterince anlaşılamamıştır. Bu transkripsiyon faktörleri ve sinyal yolları, hem de bunların düzenlenmesi, yüksek Drosophila ve memeli hematopoez 1-5 arasında muhafaza edilir. Böylece Drosophila hematopoetik sistem hematopoezisi ve altta yatan hematolojik hastalıkları kontrol moleküler mekanizmaları tanımlamak için mükemmel bir genetik modeli temsil etmektedir.
Memelilere benzer şekilde, Drosophila hemopoeziste mekansal ve zamansal farkl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Sirkülasyon Hemocyte Konsantrasyon
- 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak.
- 1X fosfat tamponlu salin (PBS, Tablo 1) ile doldurulmuş bulaşık kuyu kesme larvaları toplamak.
- Her larva için, buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde PBS 1x 10 ul ve temiz bir diseksiyon pad üzerinde PBS 1x 10 ul yerleştirin. ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde diseksiyon yastık yerleştirin.
- bir doku üzerine yerleştirerek bireysel larva kurutun diseksiyon pad üzerinde bir PBS damla aktarm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hemosit dolaşımsal konsantrasyonu
Hemocyte numaraları larva gelişimi 35 boyunca artar. Bu yöntem hemocyte numaraları ve konsantrasyon farklılıkları algılar olduğunu göstermek için, ne olursa olsun biyolojik nedeni, biz gecikmeli ve gecikmesiz larvaların hemocyte konsantrasyonlarını ölçtük. Ptth üreten nöronların (ptth> gaddar) genetik ablasyonu prothoracicotropic hormon (ptth) Zarar larva gelişimi 36 bir .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Genetik ya da çevresel değişiklik üzerine, burada açıklanan dört yöntem gibi sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hematopoez sırasında farklı süreçleri analiz etmek ayrı ayrı ya da birlikte kullanılabilir Drosophila hematopoez dinamik bir süreçtir.; hayvan başına hemocytes sayısı 35 artar ve lenf bezinin yapısı ve gen ifadesi gelişimi sırasında 32 değiştirir. Bu analizler gerçekleştirmeden önce, bu nedenle, o zaman sabit bir miktar için yumurtalarını bırakmak için ve.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip veya mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi ve Andreas Jenny'ye yardımları için teşekkür ederiz. Plazmasit spesifik antikorlar için István Andó'ya, dome-meso-EBFP2 sinekleri için Utpal Banerjee'ye, antp>GFP sinekleri için Julian Martinez-Agosto'ya ve ptth ve ptth>grim sinekleri için Michael O'Connor'a teşekkür ederiz. Bu yöntemler Kimmel Vakfı, Lösemi ve Lenfoma Derneği, NIH / NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD / NFRP W81XWH-14-1-0059 ve NIH / NCI T32CA078207'nin desteğiyle geliştirilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PBS tabletleri | MP Biyomedikal | 2810305 | |
| diseksiyon tabağı | Corning | 7220-85 | |
| mikrosantrifüj tüpü | Denville | C2170 | |
| silikon diseksiyon pedi, Sylgard 184 kit | Krayden'den yapılmıştır (Fisher aracılığıyla dağıtılır) | NC9644388 (Fisher katalog numarası) | Sylgard elastomer kitinin bileşenlerinin üretici talimatlarına göre karıştırılmasıyla petri kabında yapılır. |
| stereomikroskop | Morrell Instruments (Nikon distribütörü) | mna42000, mma36300 | Nikon modelleri SMZ1000 ve SMZ645 |
| doku mendili | VWR | 82003-820 | |
| forseps | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 72700-DZ | |
| p200 pipet | Eppendorf | 3120000054 | |
| Kontes Otomatik Hücre Sayacı | Invitrogen | C10227 | |
| Kontes hücre sayma odası slaytları | Invitrogen | C10283 | |
| hemositometre | Hausser Scientific | 3200 | |
| tripan mavi leke | Yaşam Teknolojileri | T10282 | |
| formaldehit | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| sığır serum albümini | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal keçi serumu | Sigma | G9023-10ML | |
| normal eşek serumu | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 geçirmez etanol | VWR | V1001 | |
| N-propil gallat | MP Biyomedikaller | 102747 | |
| gliserol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) | Fisher | 62248 | |
| 6 oyuklu plaka | Corning | 351146 | |
| 12 oyuklu plaka | Corning | 351143 | |
| mikroskop kapak camı, 22 mm kare | Fisher | 12-544-10 | |
| mikroskop kapak camı, 18 mm dairesel | Fisher | 12-545-100 | |
| cam mikroskop slaytları | Fisher | 22-034-980 | |
| termal döngüleyici | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tüpleri | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24 kuyulu plaka | Corning | 351147 | |
| tek kullanımlık transfer pipeti | Fisher | 13-711-9AM | |
| floresan mikroskop | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
Kaynaklar
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
- Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
- Crozatier, M.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
