Burada, nispeten kısa zaman dilimleri içinde ağaç ikincil kök dokusunda gen ve promotör yapılarının orta ila yüksek verimli fonksiyonel karakterizasyonunu kolaylaştıran bir protokol sunuyoruz. Verimlidir, kullanımı kolaydır ve çeşitli ağaç türlerine yaygın olarak uygulanabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
Ağaçlarda ikincil kök büyümesi ve buna bağlı ahşap oluşumu, biyolojik ve ticari açılardan hem önemlidir. Ancak, nispeten daha az gelişimlerini yönetir moleküler kontrolü hakkında bilinmektedir. Bunun nedeni genellikle ikincil büyüme süreçlerinin çalışma ile ilişkili fiziksel, kaynak ve zaman sınırlamaları bölümünde yer almaktadır. In vitro bir dizi teknik odunsu ve odunsu olmayan bitki türleri hem de her iki bitki parçası ya da tüm bitki sistemi kapsayan kullanılmıştır. Ancak, ikincil kök büyüme süreçlerinin incelenmesi için kendi uygulanabilirliği konusunda sorular, belirli türlerin ve emek yoğunluğu dinlemezlik yüksek hacimli uygulamalar için orta için genellikle engelleyici bulunmaktadır. İkincil kök gelişimi ve ahşap oluşumu bakarken Ayrıca, soruşturma kapsamında belirli özelliklerin sadece büyümenin birkaç yıl sonra geç bir ağacın ömrü ölçülebilir hale gelebilir. In vivo p bu zorluklar alternatif elerotocols doğrudan bitkinin ikincil kök transgenik somatik doku sektörlerin oluşturulmasını içeren Kaynaklı Somatik Sektör Analizi, adını geliştirilmiştir. Bu protokolün amacı ağaç türlerinin aralığında kullanılabilir geni ve hızlandırıcı fonksiyonel karakterizasyon için transgenik sekonder bitki dokusu yaratmak için, etkili, kolay ve nispeten hızlı bir araç sağlamaktır. Burada sunulan sonuçlar, ikincil ikincil promotör ekspresyonu yanı sıra ağaç türlerinin ve ahşap morfolojik özelliklerin çeşitli kaynaklanıyor transgenik ikincil kök sektörleri kolayca yüksek orta kolaylaştırıcı değerlendirilebilir kaynaklanıyor tüm canlı dokular ve hücre tiplerinde oluşturulabilir göstermektedir verim fonksiyonel karakterizasyonu.
Giriş
Ağaç gezegen biyokütle önemli bir miktarı içerir ve büyük biyolojik, kültürel ve ticari öneme sahiptir kaynaklanmaktadır. İkincil birçok diğer canlılar için kaynak ve barınak sağlayarak yaşam oluşturmak kaynaklanıyor. Onlar yaşamak ve kereste, kağıt hamuru ve kağıt ve diğer ahşap ve odun dışı ürünlerin üretimi için yenilenebilir bir kaynak olarak hareket ekosistemlerin diğer birçok hizmetler sunmak. İkincil kök gelişimi ve daha özel olarak ahşap oluşumu özel hücre tiplerinin gelişimi düzenleyen karmaşık bir moleküler sistem tarafından yönetilir, biyokimyasal hücre duvarlarının bir bileşim ve nasıl doku ve organ oluşturmak üzere düzenlenmiştir. ikincil kök gelişimi ve ahşap oluşumunun moleküler temelini Kesme içinde ve sapları arasında, uzun nesil süreleri, out-geçiş çiftleşme sistemleri, yüksek heterozigotluk, yüksek genetik yük, mevsimsel dinlenme, uzun ahşap ve kök özelliklerinin değişkenliği dahil olmak üzere birçok faktör tarafından şaşırmış olgunSürekli kuruluş dönemleri ve olgun ağaçlar sırf fiziksel boyutu. Sonuç olarak, bitki gelişiminin moleküler kontrolü çoğu diğer yönlerini ayrıntılı bilgiye ikincil kök gelişimi akrabası anlayışı, henüz emekleme aşamasında olduğunu.
In vitro bir dizi teknik çalışma ve özellikle ahşap ve ikincil hücre çeperi oluşumu, ikincil kök gelişimini anlamak için kullanılmıştır. Bu protokoller, transgenik bitkiler, ya oluşturulur ya da belirli ikincil hücreler ya da doku, ahşap ve / veya ikincil kök gelişimi 1 spesifik yönlerini çalışma için dönüştürülen tüm bitki ya da bitki parçası sistemlerinin kullanılmasını içerir. Transgenik bitkiler bitki dokularında ve hücre tiplerinin çeşitli sonrası genetik dönüşümü telafi edilebilir, ancak ilerleme yavaş, özellikle nedeniyle uzun rejenerasyon için ahşap lif özelliklerinin analiz edilmesi ve (yaş sırasına göre) olgunlaşma süreleri kök zaman, yüksek teknik ve emek demands, düşük aday genlerin verim yanı sıra bazı odunsu bitki türleri yayma zorluklar. Benzer teknikler başarıyla bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek Arabidopsis olmayan odunsu model sistemde geliştirilmiştir, fakat bu bir hediye değil tüm orta kök hücre tipleri sapları ve mevsimsel ya da uzun ömür ile ilgili özellikler bu türler 2 okudu edilemez. Alternatif olarak, pinu s radiata kallus kültürleri 3 gibi bitki parçası sistemleri, ilgili zaman dilimleri azaltır. Bu yöntemler ancak bireysel bir hücre tipi çalışmaya kısıtlı ve in vitro deneylerde belirtildiği gibi benzer kısıtlamalar acı vardır. Benzer şekilde, bütün kök eksplantlar içeren apikal kök kültürleri 4 söz göstermiştir ancak henüz spesifik genlerin veya ilgi ortakların çalışma için uygulanmamıştır. Daha yakın zamanda, saçak kök kültürleri içeren alternatif bir protokol eucalypts için geliştirilmiştir ve başarılı olmuştursapları ve tek ağaç türleri sınırlıdır tarihinden en az 5, bununla birlikte, bu yöntem, halen nitro ekimi gerektirir uygulanan çok ikincil kökler içerir.
Burada anlatıldığı gibi uyarılan somatik sektör analizi (ISSA), odun oluşumu ve ikincil kök doku gelişiminde şüpheli rollerle genler ve rehberleri için yüksek verimlilik fonksiyonel bir tarama aracı bir ortam sağlayarak bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. ISSA emek aşılır iken, dokunulmamış sekonder gövde transjenik hücrelerin ve dokuların üretilmesi için gerekli süreyi azaltmak için geliştirilmiş bir in vivo dönüşüm ve eleme sistemi, rutin teknik ve verimlilik sınırlamaları vitro yöntemler kullanılır. İkinci g olmayan ağaç türleri ve ilgi konusu dokuda, kısa bir zaman süresi içinde gövde burada tarif edilen protokoller, bağımsız olarak dönüştürülmüş doku sektör ve hücrelerden yüzlerce aynı anda oluşturulması için izinNispeten kısa zaman dilimlerinde ve düşük işgücü maliyeti içindeki enetic ve / veya çevresel varyasyon. ISSA in vivo teknikleri ilk ve kambiyal farklılaşmasında rol oynayan gen ve / veya ortakların çalışmaları ile ikincil kök dokusunda rafine edilmiş bu yana ikincil kök 6 ve tomurcuk 7 dokular için tarif ve var edilmiştir şunlardır: tubulin (TUB) 8, fasciclin benzeri arabinogalaktan ( FLA) 9, selüloz sentaz (CESA) 10, ikincil hücre duvarı ilişkili nac alanı (SND2) 11, ARBORKNOX (ark1) 12 ve gerçekten ilginç yeni gen (HALKA) H2 proteini 13. İkincil yapılmıştır Bu çalışmalar kavak ve okaliptüs bitki ve hücre morfolojisi, hücre duvarı kimyası ve gen ifadesi içine sağlanan anlayışlar kaynaklanıyor.
Burada anlatılan protokoller deneyim a bir araya getirmek için tasarlanmıştırnd bilgi son on yılda yayınlanmış ve yayınlanmamış çalışmaların bir dizi ISSA geliştirilmesi ve uygulanması yoluyla kazandı. Onlar ikincil kök dokularında 6 in vivo dönüşümü odaklanmak ve Ak Kavak 'Pyramidalis' klon, Okaliptüs Globulus yanı sıra 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonlar içeren çalışmalar üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu belge bitki ve bakteri, kök dokuları, büyüme ve doku hasat, transgenik hücrelerin ve dokuların belirlenmesi, veri toplama ve analizi için fenotipik değerlendirmeler ve yöntemler için hazırlık dönüşümün ekimi protokol ile araştırmacılar alır. Teknikleri başarıyla nedeniyle uzay sınırlamaları, aynı zamanda 9,11 hücre duvarı monosakkarit kompozisyona ölçmek için uygulanan olsa da, bu belge ikincil st gen ekspresyonu hücre ve doku morfolojisi ölçmek ve anlamak için kullanılan teknikler üzerinde yoğunlaşmaktadırems sadece. Buna göre, belirtilen protokol yüksek verimli yöntemi düşük maliyetli, teknik olarak kolay ve orta kullanarak kaynaklanıyor ikincil bağlantılı genlerin rolü ve / veya ifadeye daha fazla anlayışlar kazanmak isteyenler için uygundur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bitki Materyali hazırlanması 1.
- Önceki deneyler için, tohum veya kesme ile ilgili tercih edilen bir ağaç türlerinin yeni bir fide yükseltmek ve deney için amaçlanan bölgede kök çapı çapı yaklaşık 1 cm kadar ağaç / s büyür.
Not: Bitki büyüme oranları bu nedenle bu adım için üç ila dokuz ay arasında izin dolayı değişebilir gereken süreyi.
2. İkili vektör oluşturulması
- Bir laboratuvar veya Agrobacterium tumefaciens ele alınabilir sera ve laboratuvar için öngörülen, uygun kişisel koruyucu ekipman bölümünde 7'ye bu bölümden çalışmaları yapmak için kullanılır.
- İlgi devirme veya aşırı ekspresyonu kaseti ve bir β-glukuronidaz (GUS) raportör gen kasetinin bir geni veya çalışma türüne bağlı olarak, bir GUS genine kaynaşmış ilgi bir promoter ya da ihtiva eden bir ikili vektör hazırlanır.
Not: ikili vektör bac bir dizi vardırikili vektörlere genleri ve ilgi proje sahiplerine eklemek için kullanılabilir araştırma ağlarına yanı sıra çok sayıda teknikleri ile ticari ya da kaynaklı olabilir kbones. Bu protokol çerçevesinde bir ikili vektör oluşturma konusunda karar vermek için deneyci kalmıştır. - A. silahsız bir gerginlik içine ikili vektör Dönüşümü elektroporasyon veya ısı şoku 14 kullanılarak ve deney için gerekli olana kadar uygun şekilde saklamak tumefaciens.
- herhangi bir pozitif ve / veya negatif kontroller için yineleyin 2.2.
Not: Negatif kontroller faiz çalışmanın bir gen ve faiz çalışmanın promotör için promotorsuz GUS ilgi hiçbir geni içeren bir ikili vektör içermelidir. İlgi çalışmanın bir promotör için pozitif kontrol, bir GUS raportör kaynaşmış bir karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (CaMV35S) içermelidir.
A. 3. hazırlanması Aşılama için tumefaciens
- exper için en az bir hafta önceimentation, A. küçük bir miktar (yaklaşık 1 ul) sunar Bakteriyel seçimi için uygun antibiyotik içeren 14 tabak adım 2.2 ve 2.3 sırasında hazırlanan ve agar ile ayrı LB ortamında yayılmaya tumefaciens. küçük koloniler meydana getirmek üzere, bir kuluçka makinesi içinde 28 ° C'de büyütülmüştür ve daha sonra 4 ° C'de saklayın ihtiyaç kadar ° C.
- 48 saat deney öncesinde, A'nın bir koloni aktarmak ayrı ayrı 50 ml her plaka tumefaciens önceden ısıtılmış (28 ° C), LB ortamı 14, bakteriyel seçim için uygun antibiyotikler ihtiva eden kadar ve 28 ° C 'de yaklaşık 48 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe 200 rpm'de ajitasyon 5 ml ihtiva eden En tüpler vida karışım çok bulutlu.
- 4-6 saat bitki aşılama öncesinde gövde arasında (bölüm 4) LB / A 1 ml ekleyin yeni bir 50 ml'lik tumefaciens Karışım için uygun antibiyotik ile en taze sıcak (28 ° C) 19 ml (1:20 seyreltme) ihtiva eden tüp LB ortamı vidabakteriyel seçim. 600 nm'de (spektroskopi ile ölçülen OD 600) de optik yoğunluk (OD) 0.1 üzerinde ise, bu elde edilene kadar, sıcak bir LB ile daha fazla seyreltilir.
- Seyreltilmiş LB / A yerleştirin OD 600 kadar tumefaciens karışım geri çalkalama inkübatör ve sallamak aynı koşullar altında (200 rpm, 28 ° C) 0.4-0.6 ve çıkarın arasındadır.
- Santrifüj LB / A. 1,000 x g'de 15 dakika 4 ° C tumefaciens karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
- Sıvı Durusu ve hemen A. tekrar süspansiyon tumefaciens pelet 1 ml MS ortamı 15 soğutmalı içine, 2 ml mikrotüp aktarmak ve aşılama (bölüm 4) için gerekli kadar buz üzerinde saklayın. Bu çözelti, aşılama ortamı olarak adlandırılır.
Tesisi 4. Aşılama A. ile Stem tumefaciens
- geç ilkbahar veya etkin ve hızlı büyüyen kambiyumu sahip bölüm 1'de oluşturulan bitkileri kullanarak erken yaz aylarında deney başlayın. Bir için iyi bir tanıAktif ve hızlı büyüyen kambiyum floem kolayca ksilem soyulmuş olmasıdır.
- bitkinin tabanına yakın kök net bir düz bölümünü bulun ve herhangi bir yaprak ve dalları temizleyin.
- Keskin bir neşter (tercihen No. 11) ya da jilet kullanarak, uzunluğu 20 mm ve bir 5 mm floem yoluyla ayrı sonra bir iki dikey paralel insizyon getirerek kök net bir bölümünde 1 cm 2 'kambiyal penceresi' oluşturmak bazal sonunda iki dikey kesimler bağlayan yatay kesim.
- Peel kesi yukarı gelişmekte olan ksilem dokusu açığa ve bir pipet (genellikle 5-10 ul) kullanılarak maruz gelişmekte olan ksilem yüzeyini ıslak adım 3.6 yeterli Aşılama Medya eklemek tarafından oluşturulan floem şerit. Hemen Floem şerit takın.
- sıkıca Parafilm ile gövdeye floem şerit bağlayın.
- Tekrarlayın ilgi bir yaratma gen (ler) ya da yükseltici (ler) için herhangi bir ek kambiyal pencereler için 4.5'e 4.2 adımlarıEn az ny yeni kambiyal pencereler üzerinde veya diğer kambiyal pencerelerin altında ve offset bir 90 ° 1 cm.
- Tam adımları, her vektörü, deneyde kullanılan her bitkinin aynı köke eklenir sağlamak pozitif ve negatif kontrol vektörleri (2.4 adım a) 4.5 4,2.
- GUS deneyi için kök çapı periyodik büyüme ve hasat en az 5 mm radyal büyüme kaynaklanıyor gözlenmiştir (bölüm 5) izleyin.
Not: gerekli radyal büyüme miktarı aşağı analiz için gerekli olan doku miktarına bağlıdır.
GUS histolojik analiz 5. Hasat
- Tüketim herhangi bir doku kambiyal pencere içinde yeni büyüme parçası olmayan kaldırma sapından 'kambiyal pencere'.
- ksilemini ve floem hücre / doku morfolojisi olgun ilgili çalışmalar için, ksilem gelen floemi soyun.
- kambiyal bölgesi sağlam veya promotör ekspresyonu kalması için gerekli olan çalışmalar için değerlendirilmesi edileceked, enine kalınlığı 0,5 ila 1 mm diskler içine bir jilet veya başka bir keskin bıçak kullanarak kambiyal pencereyi dilim.
- 14 hafta ml alt borular işleme kambiyal cam dokular yerleştirin ve pH 7 ila 14 0.1 M fosfat tamponu içinde iki kez yıkayın., En az beş dakika süre ile çözelti içinde kalır ve fazla çözelti sonunda çıkarılır, doku tamamen daldırılmış olduğundan emin olun ikinci durulama.
- GUS reaktifi (0.5 mm X-gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-glukuronik asit), 10 mM EDTA,% 0.5 Triton X-100, h / h, 0.5 mM potasyum 5 mL . bkz Hawkins ve arkadaşları 16) her bir tüpe, ferrisiyanür (III), 0.05 mM potasyum ferrosiyanür (II), 0.1 mM fosfat tamponu pH 7 ile nihai hacme tamamlanır. Doku tamamen sular altında değilse, ek GUS reaktifi ekleyin.
- Karanlıkta 55 ° C sıcaklıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Karanlıkta 37 ° C sıcaklıkta bir çalkalamalı bir inkübatör üzerinde daha fazla 12-16 saat boyunca inkübe edin(Rpm 30 ila 60) narin ajitasyon kullanılarak karışımın sağlanması için.
- Shaker inkübatör çıkarıldıktan sonra rastgele bir pH aralığı 0-7 ile turnusol kağıdı kullanarak tüpler küçük bir alt GUS reaktif pH'ı kontrol edin.
- tüplerin herhangi 6'nın altında bir pH değerine sahip sonra etiketleyin. pH'ı onaylamak ve pH altında 6 veya eğer etiket tüplerin kalanını kontrol etmeye devam.
Not: 6'nın altında bir pH değerine sahip numuneler analiz için uygun olmayabilir. Bu numuneler bundan başka analize dahil edilmesi gerekir.
- tüplerin herhangi 6'nın altında bir pH değerine sahip sonra etiketleyin. pH'ı onaylamak ve pH altında 6 veya eğer etiket tüplerin kalanını kontrol etmeye devam.
- GUS reaktif boşaltacaktır ve doku karşılamak için yeterli% 70 etanol ile değiştirin.
- 4 ° C'de saklayın kadar gerekli.
Transgenik Doku 6. Kimlik
- forseps kullanarak, mikroskobik görünüm için izin küçük tepsiye veya petri bir tüp ve bir yerden tüm kambiyal pencere doku çıkar.
- 1X ve 4X büyütme arasında bir diseksiyon mikroskobu kullanarak tanımlamak ve hücrelerin veya dokuların sayısını taksitliBu parlak mavi boya var. Mavi boyanmış hücreler ya da doku Bu noktadan itibaren bir sektör olarak belirtilir. aşağıdaki şekillerde onları çetelesini.
- Floem (adım 5.1.1) kaldırıldı numuneler için, gelişmekte olan ksilem (kambiyal sektörü, Şekil 1a) yüzeyinde bulunan kambiyal dokuda sektörlerin sayısını.
- Diskler (aşama 5.1.2) halinde kesilmiş numuneler için, farklı bir hücre ya da doku tiplerinde bulunan sayı kesimleri (Şekil 1b, 1c, 1d) sayısı. Sektörler aşağıdaki doku tiplerinde bulunabilir: peridermeyı (Periderm sektörü, Şekil 1e), floem (Floem sektörü, Şekil 1f), kambiyal dokuyu (Kambiyal sektörü, Şekil 1g, 1h, 1I), yara parankimi (Yara Parankima Sektörü, Şekil 1j) ve tyloses bölgesindeki (Tylose kesimi Şekil 1k).
- mikroskopik a sırasındaBir diskin her iki tarafı inceledi edildiğini ve numaralar abartılmıştır değil böylece iki diskler üzerinde meydana gelen sektörler uyumlu olmasını sağlamak ssessment.
- ihtiyaç kadar% 70 etanol ve mağaza içeren tüpe geri sadece doku içeren sektörlerin yerleştirin.
- pozitif ve / veya negatif kontrol dahil olmak üzere herhangi bir ek kambiyal pencereler için 6.3'e adımı tekrarlayın 6.1.
- Dokularına cm2 dönüşüm olaylarının arasında ortalama bir sayı türetmek için 1 cm2 kambiyal pencere toplam sayısına göre sektörlerin toplam sayısına bölünmesi ile ayrı ayrı gen veya ilgi promoter ve kontrol için, her sektör tipi için ortalama transformasyon etkinliğini hesaplayın Aşılanmış (ATScm -2).
- promotör ekspresyonu analizi için 7,2 ve 8. adıma ve teknikleri kambiyal dokusunda hücre ve doku morfolojisi değerlendirmek için 7.1, 7.2 ya da 7.3 adıma geçin.
7. AnaliziKambiyal Doku Hücre ve Doku Morfoloji
Not: Aşağıda ISSA analizi için başarıyla kullanılmıştır tekniklerin bir seçim vardır örnekleri türetilmiş.
- Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile ksilem hücre alanı, lümen alanında, hücre duvarı kalınlığı ve hücre duvarı alanının analizi.
Not: Bu protokol asgari numune hazırlık gerektirir ve belirtilen morfolojik özellikleri ile ilgili sektör analizi nispeten yüksek verimlilik sağlar.- Bu adımdan itibaren laboratuvar önlüğü, göz koruma sağlamak ve odunsu doku ele ve tedavi ediliyor her eldiven kullanılır lütfen.
- Analiz için kambiyal sektörü tanımlamak ve bir kesi disk (Şekil 2a) oluşturmak için tek bir kenar jilet kullanarak bunun her iki tarafında yaklaşık 0,5 mm yapmak.
- Sektörün teğet tarafına ksilem dokusunun yaklaşık 1 mm bırakarak aşırı ksilem dokusu keserek (Şekil 2b).
- Dikkatlily taze çift kenar jilet (Şekil 2c) kullanarak sektörün merkezi aracılığıyla enine kesti.
- Transgenik doku (Şekil 2d) ayırmak için enine düzlemde her iki sektörün yanında iki ek sığ radyal kesiler olun. GUS boyama doku derin nüfuz edeceği gibi kambiyal yüzeyinde bulunan boyanmış dokunun her iki yanına hücre radyal dosyaları birlikte izleyin.
- Bir SEM pim saplama aşamasına kadar hazırlanan kambiyal sektörü yüzünü takın SEM iletken bant (Şekil 2e) kullanarak monte ve SEM görselleştirme için gerekli olana kadar desikatörde tutmak.
- Tekrarlayın negatif kontrol gelenler de dahil olmak üzere herhangi bir ek sektörler için 7.1.6 için 7.1.2 adımları.
- Düşük vakum modunda SEM kullanılarak, (enerji 5 kV, 3.0 nm nokta) görselleştirmek ve sektör içindeki hücre / doku fotoğrafları yanı sıra hücre / doku doğrudan bitişik sektör (Şekil 2f) alır. büyütme miktarıÇevrede özelliklerine bağlıdır. Ksilem elyaf için, 2,000X uygun (Şekil 2 g) 'dir.
- Bir kambiyal sektörü görüntülenmiştir ve fotoğraflar uygun bir büyütmede alınmış sonra, görüntü ölçme yazılımı kullanılarak ilgi ksilem hücre / doku morfolojik özellikleri ölçülür.
- İstatistiksel analiz için, transgenik sektör ve bir p belirlemek için her bir sektör için (sektör kenardan 0,5 mm içinde ölçülen) komşu transgenik olmayan kontrol hücre / doku içinde ölçülen morfolojik arasındaki farkı karşılaştırmak için eşleştirilmiş t-testi kullanılarak çoklu pairwise analizleri taahhüt -değeri.
- Negatif kontrol için yineleyin 7.1.10.
- Pozitif kontrol, düşük p-değeri (α <0.05) göstermektedir durumlarda, bir morfolojik özellik için transgenik ve bitişik olmayan transgenik hücre / doku arasındaki farkı hesaplar. negat ile ilgilenilen genin etkisini karşılaştırmak için eşleştirilmemiş t-testi, bu 'fark değeri' kullanınp-değerini belirlemek için kontrol ive.
- ışık mikroskobu kullanılarak kök hücre / dokularda kambiyal hücre / doku morfolojisi veya promotör ekspresyonu histokimyasal analizi.
Not: daha zaman alıcı olmakla birlikte, bu yöntem, kambiyal dinamiği, örneğin, kambiyal genişliği hem de hızlandırıcı ekspresyonu yönleri de dahil olmak üzere daha fazla analiz amaç için izin verir. Buna ek olarak, bir SEM ulaşmak mümkün, bu protokolün adım 7.1 için bir alternatif olarak kullanılabilir.- Tüketim ustura kullanılarak ilgi alanı ve 4 ° C'de en az 2 gün boyunca vidalı kapaklı bir numune şişesi içine 1-3 ml% 100 etanol içinde doğrudan çevredeki bazı küçük bloklar doku (Resim 1 mm'den 3) ve bir yer bir karıştırıcıda. Bir mikrotom tarafından erişilebilir ilgi yüzeyi için izin verecek şekilde küçük blok hazırlayın.
- negatif kontrol de dahil olmak üzere herhangi bir ek sektörler için tekrarlayın.
- Sıvı çıkarın ve 2 ile değiştirin% 5 etanol: koşullar muhafaza 2 gün boyunca% 75 LR beyaz karışım.
- % 50 etanol ile adımı tekrarlayın 7.2.3:% 50 LR beyaz,% 25 etanol:% 100 LR beyaz nihayet iki kere daha sonra beyaz ve% 75 LR.
- kısa sonuna kadar hizalanmış ilgi yüzeyi ile Kalıp gömülmesi küçük blok yerleştirin ve dikkatlice taze LR beyaz ile kaplayın ve üreticinin talimatlarına göre polimerize.
- bir döner mikrotom faiz yüzeyinden 5 mikron bölümleri kesmek ve bir bardak slayt monte edin. Hücre duvarı ve / veya başka özellikleri görselleştirmek için Safranin O (% 0.01) boyama kullanın.
- Montaj medya ekleyin bir kapak kayma yerleştirin ve bir gecede ayarlamanızı sağlar.
- 100X ve 600X büyütme ve yakalama görüntü arasındaki bir ışık mikroskobu altında görünümü.
- görüntü ölçüm yazılımı kullanarak görüntüleri morfolojik özellikleri yakalayın.
- Kantitatif morfolojik özelliklerin istatistiksel analizi için, adım 7.1.10 itibaren izleyin.
- morfolojik özelliklerin niteliksel analizi için,karşılaştırarak gen veya ilgi promoter ve negatif ve / veya pozitif kontrol için gözlemlenen kalıpları tarif eder.
- Işık Mikroskobu kullanılarak macerated Elyaf içinde Mikrofibril Açısı (MFA) analizi.
- Bir sektör hem de ona bitişik, transgenik olmayan dokuların şirketinden Tüketim transjenik ksilem dokusu ayrı 1.5 ml tüpler ve yeri (0.5 mm, Şekil 2 saat içinde). negatif kontrol de dahil olmak üzere herhangi bir ek sektörler için tekrarlayın.
- Komple adımlar Davlumbaz 7.3.5 için 7.3.3.
- hidrojen peroksit, 250 ul, her bir tüpe, buzlu asetik asit, 250 ul ekle.
- çeker ocak içinde, 2 saat boyunca 90 ° C'de ısıtma bloğu tüp yerleştirin.
- tüpler doku kaldırmak ve dikkatle en az iki kez damıtılmış su ile durulayın.
- suda eriyen bir montaj medyayı kullanarak, bir cam slayt doku monte ve bir kapak kayma yapıştırılması önce keskin forseps ile ayrı kızdırmak.
- Görünüm400X'lik daha yüksek büyütmede tek tek liflerden oluşan bir ışık mikroskobu ve çekim görüntü altında.
- Liflerin mikrofibril açısını belirlemek için, çukur deliklerin ve / veya hücre duvarı şeritlerin ve görüntü ölçme yazılımı kullanılarak fiber (Şekil 2i) uzun ekseni arasındaki açı ölçer.
- İstatistiksel analiz için, adım 7.1.10 itibaren izleyin.
8. Analiz Promoter İfadesi Kalıpları
- İkincil Kök Dokularındaki Yarışmayı İfade Desenleri analizi.
- Adım 6.2.2 de belirtildiği gibi ilgi promotör yanı sıra pozitif ve negatif kontroller için her sektör Çeşidi sıklığını taksitli.
- p-değerleri kurmak için Ki-kare testleri kullanılarak pozitif kontrol ile ilgi organizatörü farklı sektör türlerinin sıklığını karşılaştırın. Hücre / Doku spesifikliği daha fazla analizi, gereken şekilde bir adım 7.2 kullanılarak yapılabilir.
- birden fazla hızlandırıcı Eğerilgi daha sonra ilgi tüm yararlanıcı ve pozitif kontrol arasındaki bu analiz yapma karşılaştırma tekrar araştırılmaktadır.
- Sektörler veya mavi boyama negatif kontrol gözlenir sonra analiz bu ekleyebilir veya boyutuna bağlı olarak veya endojen boyama şüphesi varsa (Tartışma) terk.
- Kambiyal Türev Geliştirme ve Farklılaşma sırasında Yarışmayı İfade Desenler analizi.
- Bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak, Aşama 6.2'de tanımlanan tüm kambiyal kesimleri (Şekil 1 g, 1 H, 1 H), görselleştirmek ve kambiyumda türetilen üç doku tiplerinde, mavi lekelenme varlığını / yokluğunu tespit etmek; floem (P), ksilemini (X1) veya gelişmiş ksilem dokusu (X2) (gelişen Şekil 3A).
- Aşama 8.1.2 uyarınca, Int promotör P, X1 ve X2, bölgelerindeki GUS boyama varlığı / yokluğu sıklığını karşılaştırmakp-değerleri kurmak için Ki-kare testleri kullanılarak pozitif kontrol ile erest. Hücre / Doku spesifikliği daha fazla analizi, gereken şekilde bir adım 7.2 kullanılarak yapılabilir.
- Ek hususlar için adımlar 8.1.2.1 ve 8.1.2.2 bakın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tüm canlı ikincil kök hücre ve doku tipleri gösterilmiştir bu protokolü kullanarak A'ya duyarlı olmak dönüşümleri tumefaciens ve başlangıçta dönüştürülmüş hücre türüne göre sektör türleri ve daha sonraki gelişim büyüme kalıbı içine tanımlanmıştır. Sektör türleri peridermeyı, floem, kambiyal, yara parankimi ve TYLOSE (Şekil 1b, 1c, 1d) içerir ve tutarlı yerleri bu paragrafın geri kalan kısmında tarif bulunabilir. Bir...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
ISSA protokol genler ve ahşap yer alan ilgi rehberleri analizi için birkaç ay uzayda ağaç türlerinin transgenik kök dokuların oluşturulması için nispeten basit ve etkili bir yöntemdir ve oluşumunu kaynaklanıyor. Canlı bitkiler tutmak ötesinde küçük bir çaba, geniş kültür dokusu veya bitki, ağaç üretimi yıla kadar sürebilir başlamak için ya da nerede bir gerçek korumak için gerekli olan in vitro yöntemlerin aksine duruyor inokülasyon aşağıdaki transgenik kök dokusunun büyümesi için gereklidir ikincil kök 1<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) ve LP0211919 (GB) ve endüstri ortakları Sappi ve Mondi'nin yanı sıra Avustralya Araştırma Konseyi'nden Avustralya Lisansüstü Ödülü (EM) ve Avustralya Tarım Bakanlığı (LT) aracılığıyla Genç Yenilikçiler ve Bilim İnsanı Ödülü aracılığıyla çalışmanın bir yönü için finansman desteğine teşekkür etmek ister. Ayrıca, bu protokolün geliştirilmesi sırasında öne sürdükleri birçok tartışma ve fikir için Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan ve Simon Southerton'a ve laboratuvarla ilgili çalışmalardaki yardımları için Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel ve Noemie Defaix'e teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bitkiler | NA | NA | Lütfen gerektiğinde bitkiler için yerel fidanlık tedarikçilerine danışın |
| Agrobacterium suşu | NA | NA | Agrobactrium suşlarını elde etmenin birçok olası yolu vardır. Ülkenizde ve bölgenizde bakteri elde etmede kısıtlamalar olabileceğinden, yerel araştırma topluluğunuzu takip etmenizi öneririz. |
| İkili vektör (gen ve promotör) | NA | NA | Ağ Geçidi Rekombinaz sistemi kullanarak ISSA protokolüne uygun bir dizi vektör geliştirdik. Bu, aşırı ekspresyon, RNAi nakavtları ve modifiye edilmiş pCAMBIA vektörlerine dayalı promotör füzyon vektörlerini içerir ve gerektiğinde sağlamaktan mutluluk duyar. Ek olarak, araştırma topluluğunun kullanabileceği birçok vektör vardır. |
| LB media | Sigma | L3022 | Aynı ürün başka bir firmadan temin edilebilir |
| Agarlı LB media | Sigma | L2897 | Benzer bir ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Antibiyotikler | Sigma | NA | Katalog numarası, ikili vektörlerde bakteri seçimi için bir dizi antibiyotik kullanıldığından, ihtiyacınız olan antibiyotiğe bağlı olacaktır. Bu ürün a Şirket Yelpazesi |
| 50 ml Vidalı üst tüpler | Fisher Scientific | 14-432-22 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| MS Media | Sigma | M9274 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Neşter bıçağı no. 11 | Sigma | S2771 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | Bu, kambiyal pencere direği oluşturmayı bağlamak için kullanılacak en iyi üründür |
| 14 ml yuvarlak tabanlı tüpler | Thermo Scientific | 150268 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| EDTA | Sigma | E6758 | Aynı ürün başka bir firmadan |
| Triton | Sigma | X100 | Aynı ürün başka bir firmadan temin edilebilir |
| X-GLUC | X-GLUC doğrudan | Sipariş vermek için web sitesine gitmeniz gerekecek - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potasyum Ferrisyaniür(III) | Sigma | 244023 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Potasyum Ferrosiyanür(II) | Sigma | P9387 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Litmus kağıdı | Sigma | WHA10360300 | ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Tek kenarlı tıraş bıçağı | ProSciTech | L055 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Çift kenarlı tıraş bıçağı | ProSciTech | L056 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Vidalı kapaklı numune şişesi | ProSciTech | L6204 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Ethanol | sigma | E7023 | Aynı ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| LR white | ProSciTech | C025 | Aynı ürün başka bir firmadan temin edilebilir |
| Gömme Kalıp | ProSciTech | RL090 | Bu çeşidi öneriyoruz, ancak birçok seçenek mevcuttur |
| Water Soulable montaj ortamı | ProSciTech | IA019 | Kullanılabilecek bir montaj ortamı örneği, ancak başka seçenekler de mevcuttur ve keşfedilebilir. |
| Hidrojen peroksit | Sigma | 216763 | A benzeri bir ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Buzlu asetik asit | Sigma | A9967 | Benzer bir ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | Benzer bir ürün başka bir şirketten temin edilebilir |
| Quanta Çevresel Taramalı Elektron Mikroskobu | FEI | Bu, bu çalışmanın bir bölümünde kullanılan araçtır, ancak düşük vakum moduna sahip başka herhangi bir SEM kullanılabilir: | |
| ImageJ görüntüleme yazılımı | aşağıdaki URL'den elde edilebilir: http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
Kaynaklar
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
