Yöntem makalesi

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

DOI:

10.3791/54555

⸱

23 Ekim 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

spontan aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturarak yendi her kalbin başlatan kalbin doğal kalp pili olarak Sinoatriyal düğüm miyositler (SAMs) hareket. Bu kalp pili APs çok sayıda membran akımları ve hücre içi kalsiyum bisiklet koordineli etkinliğini yansıtır. Ancak SAMs spontan pacemaker aktivitesi sürücü kesin mekanizmalar halen mevcuttur. Akut izole SAMs deneyler kalp kalp vurusu moleküler temelini incelemek için önemli bir hazırlık vardır. Ancak, belirsiz anatomi, karmaşık mikrodisseksiyon ve titiz enzimatik sindirim koşulları akut izole SAMs yaygın kullanımını engellemiştir. Buna ek olarak, yöntemler, protein ekspresyon çalışmaları için SAM uzun dönemli kültür izin vermek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Burada erişkin farelerden SAM izolasyonu için adım adım protokolü ve video gösterimi sağlar. Bir yöntem olup, aynı zamanda in vitro ve in expressi yetişkin fare SAMs muhafaza etmek için gösterilmiştirAdenoviral enfeksiyon yoluyla ekzojen proteinlerin ilgili. Akut izole edilmiş ve bu yöntemlerle elde kültürlenmiş SAMs elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları çeşitli için uygundur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp pili, kalbin sinoatriyal düğüm miyositler (sinoatriyal miyositler, "SAMs") her kalp atışı başlatmak için miyokardın yayılması spontan ritmik aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturur. Birçok türlerden akut izole SAMs kullanarak deneyler pacemaker aktivitesi oluşturulmasına katkıda mekanizmaların aydınlatılması için gerekli olmuştur. SAMs morfolojisi, fonksiyon ve protein ifade bakımından atriyal ve ventriküler miyokardın kendi muadilleri önemli ölçüde farklılık çok özel kardiyomiyositlerde vardır. SAMs spontan AP damgasını sonraki AP 1,2 tetiklemek için eşik membran potansiyeli sürücüler diyastol sırasında bir spontan depolarizasyon olduğunu. Bu, "kalp pili potansiyeli" farklı "komik Geçerli" (I f) de dahil olmak üzere membran akımları, T ve L-tipi kalsiyum akımları ve sodyum-kalsiyum değiştirici Curr koordineli aktivitesine bağlısarkoplazmik retikulum 3,4 Ca 2+ salınımı tarafından yönlendirilen ent (I NCX).

akut izole fare SAMs kalp vurusu çalışmaları için önemli bir deneysel hazırlık iken fare SAN belirsiz anatomi ve küçük boyutlu bir nüanslı mikrodiseksiyon ve kombine enzimatik ve mekanik gerektirdiğinden, farelerden alınan SAMs izolasyonu benimsemeye zor bir yöntem olabilir hücre ayrışma dikkat optimizasyon gerektirir.

Biz burada başarılı yama kelepçe kayıtları 5-8 yetişkin farelerin SAMs izole etmek için kullanılan bir protokol ayrıntılı bir video gösteri sunar. Bildiğimiz kadarıyla, başka bir kaynaktan temin böyle bir görsel gösteri var. Buna ek olarak, yeni bir yöntem olup, burada gösterilmiştir erişkin farelerden böylece genetik olarak kodlanmış proteinlerin giriş izin, birkaç gün, in vitro olarak korunabilir SAMs izoleAdenoviral enfeksiyon 9 vasıtasıyla haberci moleküllerin veya RNAi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri Colorado Anschutz Tıbbi Campus Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır protokollere uygun olarak yapıldı. Standart protokol aşağıda yaşı 2-3 ay erkek C57BL / 6J fareler kullanılarak optimize edilmiştir.

1. Deneylerin Advance Çözüm Stoklar ve Malzemeleri hazırlayın

NOT: Gerekli ekipman ve malzeme malzemeleri Tablo bakın.

  1. Komple Tyrode, Düşük Ca 2 + / Mg 2 + Tyrode en Modifiye Kraft-Brühe (KB) Çözüm ve Sığır Serum Albumin (BSA) Çözüm: Tablo 1'de gösterildiği gibi 1 L aşağıdaki çözümlerden her hazırlayın. Kullanım ultra saf tüm çözümler için deiyonize su süzülür. en fazla altı ay boyunca 20 ° C'de her biri 50 ml'lik miktarlar halinde solüsyonu ve mağaza bölün. hemen deneyler önce bireysel alikotları çözülme ve bir haftaya kadar 4 de için saklamak6 ° C.
  2. Ultra saf süzülmüş deiyonize edilmiş su (Tablo 1) NaCI ve CaCl2 çözülmesiyle, 10 mM NaCl ve 1.8 mM CaCl2 İntibak çözeltisinin 50 ml hazırlayın. altı aya kadar oda sıcaklığında saklayınız.
  3. mikrofüj tüplerine pipetleme elastaz 4.75 enzim aktivitesi birimi (U) alikotları hazırlayın. en fazla üç ay süreyle 4 ° C'de saklayın.
  4. Mikrofuge'de tüpler içine pipetleme kollajenaz-proteaz enzim karışımının (ultra saf H 2 O) 375 mg alikotları hazırlayın. üç aya kadar -20 ° C'de saklayın.
  5. (Şekil 1Aiv ve Şekil 1C ~ 1.5 mm nihai açılış çap) ve ayrışma için bir (~ 2 mm çap; Şekil 1Aiii ve Şekil 1C) iki yangın cilalı Pasteur pipet, doku transferi için bir hazırlayın.
    1. Skor Pasteur, bir cam kesici ile pipetler ve istenen boyuttan biraz daha büyük bir açıklık üretmek için skor boyunca oturtun. Ateşkalın cilalı duvar ve istenen çapta bir açılış üretmek için Bunsen beki üzerinde Kısık ateşte ~ 30-60 saniye boyunca her pipet kesik ucunu -Lehçe. yangın cilalı açılış herhangi bir çatlak veya pürüzlü kenarlara serbest olduğundan emin olun.
  6. Ekleyerek iki diseksiyon yemekleri hazırlamak ~ 25 ml silikon elastomer her 100 mm Petri kabı üreticinin talimatlarına (Şekil 1Ai ve Şekil 1B) göre karışık. 48 saat oda sıcaklığında bekletilmelidir.
  7. Kültür için sadece: ml'lik 25-50 hazırlamak her Kaplama Orta ve Tablo 2'de göre Kültür Orta Mağaza iki haftaya kadar 4 ° C..

2. hazırlayın Çözümleri Hücre İzolasyon günü Kullanılacak

NOT: Aşağıdaki tutarlar bir fareden sinoatriyal miyositler izolasyonu için vardır.

  1. Ekle 2.5 Düşük Ca mi 2+ üç küçük, yuvarlak tabanlı kültür tüpü her bir / Mg2 + Tyrode (pH 6.9)s. 35 ± 1 ° C su banyosunda yerleştirin borular.
  2. Düşük Ca 2 + / Mg 2 + Tyrode için büyük bir yuvarlak dipli bir kültür tüp 2.5 ml ekleyin. Bu tüp, 1 kısım (4.75 U) elastaz ve bir kısım (375 ug), kolajenaz-proteaz enzimi karışımını ekleyin. karıştırmak için girdap. 35 ± 1 ° C su banyosunda yer tüpü.
  3. Üç ilave küçük, yuvarlak dipli bir kültür tüpleri ve ek büyük, yuvarlak tabanlı kültür tüpüne KB aracı maddesi içinde 2.5 ml. 35 ± 1 ° C su banyosunda yerleştirin borular.
  4. büyük bir yuvarlak tabanlı kültür tüpü BSA çözeltisi ~ 7 ml ekleyin. Oda sıcaklığında bu tüp tutun.
  5. 50 ml'lik bir cam kaba (Şekil 1Aii) tam Tyrode çözeltisi 20-40 ml yerleştirin. karıştırmak için 10 USP / ml heparin, girdap ekleyin ve 35 ± 1 ° C su banyosunda beher yerleştirin.

Kültür Hücreler (Akut İzole Hücreler için bu adımlar atla) 3. Ek Çözümler ve Materyalleri hazırlayın

  1. steril doku kültürü kaputu, 24 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde fare başına iki adet 12 mm yuvarlak cam lameller üzerine yerleştirin.
    NOT: Kuyular sonraki viral enfeksiyonlar için hacmini sınırlamaya yarar uygun bir boyut, çünkü 24 plaka kullanılır.
  2. Pipet, her lamel üzerine steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltilmiş fare laminin bir 100 ng / ml çözelti, yaklaşık 200 ul.
  3. 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde izolasyon (en az 1 saat) boyunca laminin ile lamelleri inkübe edin.
  4. Pre-sıcak Kaplama Orta ve kültür ortamında 37 ° C (Kademe 1.7 ve Tablo 3'ten).

4. Sinoatriyal Düğüm İzolasyon

  1. Kimyasal davlumbaz, iki odacık kutusunun bir odasında bir fare koyun ve diğer odasına bir pamuklu çubukla aracılığıyla tanıtıldı ~ 200 ul sıvı izofluran ile uyutmak. Bir ayak tutam (genellikle 30-60 sn ~ içinde) anestezi onaylayın. euthanizeservikal dislokasyon ile fare.
    Not: Boş 1 ml pipet ucu kutusu, iki odacık kutusunu oluşturmak için kullanılabilir; doğrudan temas fare önlemek için izofluran için ayrı bir bölme oluşturmak için kutuya ters raf çevirin.
  2. Dış dokusu forseps (Şekil 1Aviii) ve diseksiyon makas (Şekil 1Avix) kullanarak göğüs boşluğuna maruz makas ve transect göğüs kafesine göğüs kürk çıkarın. ~ 2 ml Heparin bir transfer pipet kullanarak komple Tyrode en ısındı ile göğüs boşluğunu yıkayın.
    NOT: Gerektiğinde hazırlık kurumasına izin vermeyin, deniz göğüs boşluğunu devam edin.
  3. Bir mikroskop altında dikkatle akciğerleri kaldırmak ve iç makas (Şekil 1Avi) ve diseksiyon forseps (Şekil 1Avii) kullanarak timüs.
  4. yavaşça iç diseksiyon forseps ile kalbin apeks tutarken dikkatli inferior vena kava ve a kestiİç makas ile orta göğüs boşluğunda kalp kaldırmak için. Silikon diseksiyon yemekleri birine kalbini aktarın ve ~ 4 ml Komple Tyrode transfer pipet kullanarak heparinize ısıtılan ile yıkanmak.
  5. Orient kalp posterior damarları görünür ve deneycinin soldaki hayvanın deneycinin sağda sağ atrium ve sol atrium ile yukarı bakacak olduğunu. odaklı sonra, silikon diseksiyon çanak içine apeks ile iğneleyerek kalbi hareketsiz.
  6. Ventriküller ve kulakçıklar (ventriküllerin yukarıda açık halka) arasındaki oluk bulun.
  7. İç diseksiyon makas kullanarak, kulakçıklar daha ventriküllere yakın tutarak oluk bir kesi yapmak. Ek ısındı heparinize Komple Tyrode olarak kulakçıklar ve vanalar net bir görüş sağlamak için gerekli en oluk ve kesi yıkayın. ventriküllerden gelen atrial ayırmak için oluk boyunca kesmeye devam.
  8. İkinci silikon diseksiyon çanak atriyal doku transferi ve ~ 3 ml Komple Tyrode en heparinize ısıtılan ile yıkanmak.
  9. Orient hayvanın sağ atrium deneycinin solda şimdi doku böylece, ve sol atrium sağ açık.
    NOT: Sol atriyum koyu kırmızı tonu daha sahipken sağ atrium, daha şeffaftır.
  10. yavaşça hazırlık germe, alt ve üst vena kava inferior ve sağ ve sol atriyal uzantıları aracılığıyla doku sabitleyin. hazırlık (sinoatriyal düğüm oldukça hassas ve kolayca zarar görebilir olarak, atriyal duvar oyulmuş için dikkatli olun) net bir görüş sağlamak için kalan yağ veya diğer doku çıkarın.
  11. ana toplardamarlar aracılığıyla keserek atriyum ön duvarını açın. İnteratriyal septum görselleştirmek için gerekli işaretçilerine yeniden konumlandırmak.
  12. Sol atrium kaldırmak için septumun boyunca kesilir. nazikçe germe, hazırlık yeniden pin.
  13. t kaldırsağ kulakçık o ve atriyal apendiks çevreleyen koyu turuncu çizgi olarak görünür kristalarında terminalisin boyunca keserek sinoatriyal düğüm özgür.
  14. düğüm doku yeniden pin ve üç eşit büyüklükteki şerit üretmek için (krista terminalisin dik) yanal kesti.

5. Sinoatriyal Düğüm Sindirim

  1. Dar ateş cilalı bir pipet (Şekil 1Aiv) kullanılarak, düşük Ca 2.5 mL içeren üç küçük, yuvarlak dipli tüp, ilk olarak sinoatriyal düğüm dokusunun üç şerit aktarma 2 + / Mg2 + Tyrode 35 ± 1 ° 'de C su banyosu. 5 dakika boyunca inkübe edin.
  2. 2.5 ml düşük Ca içeren ikinci küçük, yuvarlak dipli tüp doku transferi şeritleri 2+ aynı dar pipet kullanarak / Mg 2+ Tyrode en 35 ± 1 ° C su banyosunda. Nazik tüp dönen ya da hafifçe dar pipet ile pipetleme doku şeritleri yıkayın. Do not invertüp t.
  3. 2.5 ml düşük Ca içeren üçüncü küçük, yuvarlak dipli tüp doku transferi şeritler 2+ / Mg 2+ Tyrode en ve adım 5.2'de açıklanan yıkama adımı tekrarlayın.
  4. Düşük Ca 2.5 ml su ihtiva eden büyük bir yuvarlak tabanlı tüp içine aktarın şeritleri 2 + / Mg2 + Tyrode 35 ° C su banyosu içinde enzimler (elastaz artı kolajenaz-proteaz karışımı) ile. Her üç doku şeritleri mevcut olduğundan emin olun. 35 ± 1 ° C'de 10-15 dakika inkübe edilir. tüp hafifçe dönen her 5 dakikada bir karıştırın. tüp ters etmeyin.

6. Sinoatriyal Düğüm miyosit Ayrılma

  1. enzim sindirimi takiben yavaşça 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB çözeltisi içeren ilk küçük, yuvarlak dipli tüp, doku şerit aktarma dar yangın parlatılmış pipet kullanın. tüp hafifçe dönen dokuyu yıkayın.
    Not: Doku şeritleri biraz saydam görünür ve inci de bir araya gelme olabilirnoktasıdır. hücreleri kaybetmemek için enzimatik sindirim sonra çok nazikçe anlaştım.
  2. 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB ihtiva eden ikinci bir küçük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. yıkamak için hafifçe karıştırılır.
  3. 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB ihtiva eden üçüncü bir küçük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın. yıkamak için hafifçe karıştırılır.
  4. 35 ± 1 ° C 'de 2.5 ml KB içeren büyük yuvarlak tabanlı tüp doku aktarın.
  5. Bakımı, yaklaşık 0.5-1 Hz 5-10 dakika sabit toz haline getirilerek büyük yuvarlak dipli tüp içinde hücreleri ayırmak, büyük yangın cilalı pipet (Şekil 1Aiii ve Şekil 1C) kullanarak batmış ayrışma tüp tutmak için 35 ± 1 ° C su banyosu çözeltiye baloncuklarının oluşumunu ortadan kaldırmak için.
    Not: tritürasyon süresi ayrışma pipet çapı ve pipetleme kuvvetine bağlı olarak değişir. doku parçaları t kalan böylece Zaman ayarlanabilir olmalıdıro ayrışma sonunda, ince şeffaf ve incecik görünür. Doku herhangi bir renk elde tutarsa, ayrışma eksik olması muhtemeldir. Frekans (0.5-1 Hz) elle tespit edilir.
  6. Su banyosu ayrışmış SAMs ihtiva eden yuvarlak tabanlı tüp çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye.

7. Sinoatriyal Düğüm Kalsiyum yeniden adaptasyon (oda sıcaklığında gerçekleştirilir)

Not: SAMs kültürü deneyleri için tahsis edilmiş, aşağıdaki bölümde prosedürü steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır. SAMs akut deneyler için kullanılacak ise, steril bir ortamda aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için gerek yoktur.

  1. NaCI / CaCl2 adaptasyon çözeltisi (Tablo 2) 75 ul ekle. karıştırmak ve 5 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
  2. NaCI / CaCl2 adaptasyon çözeltisi 160 ul ekle. karıştırmak ve 5 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
  3. BSA sol 390 ul ekleyinKatkı (Tablo 2). karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
  4. BSA çözeltisi, 1.25 ml ilave edilir. karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
  5. BSA çözeltisi 4.37 ml ilave edilir. karıştırmak ve 4 dakika boyunca inkübasyona hafifçe karıştırılır.
    Not: kalsiyum nihai konsantrasyon 1.8 mM olacaktır.
  6. Kalsiyum yeniden adaptasyonu sonra 3 dakika boyunca ~ 2,000 x g'de 10 dakika ~ ya da santrifüjleme ile yerçekimi ile yerleşmeye izin vererek SAMs toplar.
    1. akut izole hücreler için, hafifçe yaklaşık 2 ml'lik bir hacme hücreleri bırakarak çıkarın ve bir cam Pasteur pipet kullanılarak süpernatan, yaklaşık 5 ml atın. yama kelepçe kayıtları için 8 ° 'ye kadar saat oda sıcaklığında bu hücreleri saklayın.
    2. kültürlenmiş hücreler için, steril bir cam Pasteur pipet kullanılarak mümkün süpernatan kadar çıkarın. Önceden ısıtılmış 1 ml içinde süspanse hücre topağı (37 ° C) Kaplama Orta (Tablo 2).

Sinoatriyal Myo 8. Kaplama ve Kültürlenfositler (akut olarak izole edilmiş hücreleri için yap)

  1. Pasteur pipeti ile Adım 3,3 lamelleri gelen laminin çözüm çıkarın. Hemen (adım 3), her bir laminin kaplı lamel üzerine 500 ul (~ 50-100 hücre) tohum.
    Not: Kontraktil inhibitörü 2,3-bütandion monoxime (DGM), hücrelerin 9 yıpratma neden kasılmasını önlemek için kaplama ve kültür ortamı dahildir.
  2. Inkübatör yeni ekilmiş SAMs ihtiva eden 24 oyuklu plaka geri dönün ve% 95 hava /% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de muhafaza. Hücreler kaplama medyada 4-6 saat (Tablo 2) lamelleri uymak için izin verin.
  3. Yavaşça steril bir Pasteur pipeti kullanarak Kaplama Orta kaldırın. Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür Orta oyuk başına 500 ul (Tablo 2) ile değiştirin.

Yetişkin Sinoatriyal miyosit Kültürlerin 9. adenoviral İletimi (Akut İzole Hücreler için atla)

  1. ce sayısını tahminhemen büyütme için düzeltme, bir mikroskop altında bir görüş alanı hücreleri sayılarak adenovirüs uygulamadan önce lamel başına rf. tüm hücreleri değil, sadece SAMs güvenin.
  2. Ortama 199 adenovirüs seyreltilir ve 1-10 ul bu uygulama, hücre başına 100, viral birimlerinin enfeksiyonun nihai çok sayıda (İB) elde etmek için gerekli olan şekilde, viral titresi için seyreltme ayarlayın. doğrudan kaplamalı SAM üzerine damla damla adenoviral solüsyonu ekleyin.
  3. virüs içeren ortam gece boyunca (~ 12-14 saat) kuluçkaya bırakılır. Sonra taze kültür ortamı ile değiş tokuş. istenilen protein ifadesi elde edilene kadar, kültür ortamı, her 48 saat değişen inkübatör hücreleri korumak.

Akut İzole veya Kültür SAMs 10. Fonksiyonel Değerlendirme

NOT: Aşağıdaki protokol spontan AP ve ben hem kayıt delikli yama tekniği amfoterisin kullanılarak izole SAMs fonksiyonel değerlendirmelerin bir örnektir aynı hücreden f (referans 9 bakınız).

  1. Tablo 3'te tarif edildiği gibi bir kayıt çözelti hazırlayın.
  2. kayıt gününde taze DMSO içinde 20 mg / ml amfoterisin B bir stok çözelti hazırlayın. Oda sıcaklığında stok tutmak ve ışıktan korumak. 200 ug bir son konsantrasyona kadar, hücre içi çözelti içerisinde bir grup amfoterisin B stokunu / kullanımdan hemen önce ml. Buz üzerinde nihai bir pipet çözeltisi muhafaza etmek ve ışıktan koruyunuz.
    Not: deneyler için amfoterisin içeren pipet çözeltisi, en az 1 dakika boyunca hücre içi çözeltisi ve vorteks içine stok çözeltisinin bir tam kısmı seyreltilmesiyle saat taze hazırlanmalıdır.
  3. bir kısım transfer akut SAM hücre süspansiyonu veya 35 ± 1 ° C 'de Tyrode çözeltisini ihtiva eden bir kayıt odasına kültürlenmiş SAMs taşıyan cam lamel bir fragmanını ayrıştırılır. en az 2 dakika önce elektrofizyolojik recordin için Tyrode çözeltisi ile hücrelerin serpmekGS kültür ortamından geri kalan herhangi bir artık BDM kaldırın.
    NOT: Spontan kasılmalar hemen Tyrode çözümü transfer üzerine belirgin olmalıdır. Kayıt için SAMs spontan kasılma aktivitesi, karakteristik morfolojisi (örneğin., Şekil 2), şeritlerin eksikliği HCN4 proteininin ekspresyonu, bir ön akımın varlığı, membran kapasitans <50 pF ve kendiliğinden APS gibi özelliklerin bir kombinasyonu ile tespit edilebilir bir diyastolik depolarizasyon fazı ve yavaş upstroke içeren dalga ile.
  4. 1.5-3.0 M? Dirençleri ile borosilikat cam pipetler kullanılarak, hücre içi çözelti ile ucu doldurmak 10-30 saniye daldırma tarafından amfoterisin yetersizdi. Sonra amfoterisin içeren çözelti ile pipet geri doldurun. Bir GΩ hücre bağlı mühür mümkün olduğunca çabuk alınmalıdır. mühür oluşumu zor ise, uç-dolgu süresini artırın.
    NOT: Erişim direnci sürekli olmalıdırHücre-conta takılı oluşumu takip izlenir ve kayıtları sadece <10 M? istikrarlı bir erişim direncini alındıktan sonra başlanmalıdır.
  5. spontan AP kaydetmek için, hiçbir geçerli enjeksiyonu ile hızlı akım kelepçe moduna amplifikatörün.
    Not: Daha önce 10 belirtildiği gibi, ateşleme hızı kararlı hale APS kaydederken 1 nM izoproterenol hücre dışı Tyrode çözeltisi dahildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada anlatılan protokoller daha önce farklı yama kelepçe çalışmalarının 5-8 çeşitli için uygundur yetişkin farelerin kendiliğinden aktif SAMs izole etmek istihdam edilmiştir. Buna ek olarak, Protokoller, bir hafta süreyle kültür içinde muhafaza edilebilir izole SAM izin verir. Kültürlenmiş hücreler içine gene aktarılması adenoviral enfeksiyon 9 vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bu bölümde sunulan sonuçlar önceki çalışmalarından elde ve akut izole ve kültürlü SAMs ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kağıt yetişkin farelerin tamamen farklılaşmış sinoatriyal düğüm miyosit izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller sunar. yalıtım protokolü güvenilir anında elektrofizyolojik analizi ya da sonraki kültür ya da uygun kendiliğinden aktif fare SAMs üretir. Benzer protokolleri (örneğin, 11,12,10,13-17 referanslara bakın) birçok diğer gruplar tarafından rapor edilmiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak yetişkin fare SAMs muhafaza edilmesi için protokol karakteristik morfolojisi, spontan aktivit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. Christian Rickert'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden (R01-HL088427) CP'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir. EJS, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden 5T32-AG000279 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sylgruard/Elastomer KitiDow Corning184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG
Borosilikat 9" pastör pipetleriFisher Scientific13-678-20C
Küçük, yuvarlak tabanlı kültür tüpleriFisher Scientific352059
Büyük, yuvarlak tabanlı kültür tüpleriCorning14-959-11B
ElastaseWorthington BiyokimyasalLS002279
Liberase TMRoche5401119001Doku ayrışma solüsyonu
HeparinSAGENT İlaç Firması NDC 25021-400-10
Fare LamininCorningCB-354232
12 mm yuvarlak cam lamellerFisher 12-545-80
24 kuyulu kültür plakasıFisher08-772-1
Ad-mCherryVektör Biolabs1767
Ad-eGFPVektör Biolabs1060
Plastik, tek kullanımlık transfer pipetiFisher Scientific
Mikro makasFisher Scientific17-467-496
Dumont #4 ForsepsRoboz AletleriRS-4904
Doku ForsepsleriRoboz AletleriRS-8164
Diseksiyon İris MakasıWPI, Inc.
Diseksiyon PimleriGüzel Bilim Araçları26002-20
NaClSigma71376
KClSigma60128
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma60353
HEPESSigma54457
glikozSigmaG0350500
MgCl2>SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
taurinSigmaT0625
BSASigmaA2153
K-glutamatSigmaG1501
K-aspartatSigmaA6558
MgSO< sub>4SigmaM7506
kreatinSigmaC0780
EGTASigmaE3889
Mg-ATPSigmaA9187
Amfoterisin-BFisher Scientific1397-89-3
IsoproterenolCalbiochem420355
Media199SigmaM4530
2,3-bütandion monoksit (BDM)SigmaB0753
Fetal Sığır Serumu (FBS)SigmaSH30071
Sığır Serumu Albümini (BSA)SigmaA5611
İnsülin ve nbsp;  SigmaI3146
TransferrinSigma I3146
SelenyumSigmaI3146
PenisilinGE SağlıkSV30010
StreptomisinHidroklonSV30010
501264

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
  4. Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
  5. Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
  6. Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
  7. Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
  8. St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
  9. St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
  10. Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
  11. Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
  12. Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
  13. Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
  14. Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
  15. Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652(2012).
  16. Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633(2013).
  17. Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  18. Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
  19. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
  20. Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre zolasyonuDoku DiseksiyonuEnzimatik SindirimYama KenetlemeKalsiyum G r nt lemeAdenoviral EnfeksiyonH cre K lt rElektrofizyoloji

İlgili makaleler