Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
spontan aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturarak yendi her kalbin başlatan kalbin doğal kalp pili olarak Sinoatriyal düğüm miyositler (SAMs) hareket. Bu kalp pili APs çok sayıda membran akımları ve hücre içi kalsiyum bisiklet koordineli etkinliğini yansıtır. Ancak SAMs spontan pacemaker aktivitesi sürücü kesin mekanizmalar halen mevcuttur. Akut izole SAMs deneyler kalp kalp vurusu moleküler temelini incelemek için önemli bir hazırlık vardır. Ancak, belirsiz anatomi, karmaşık mikrodisseksiyon ve titiz enzimatik sindirim koşulları akut izole SAMs yaygın kullanımını engellemiştir. Buna ek olarak, yöntemler, protein ekspresyon çalışmaları için SAM uzun dönemli kültür izin vermek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Burada erişkin farelerden SAM izolasyonu için adım adım protokolü ve video gösterimi sağlar. Bir yöntem olup, aynı zamanda in vitro ve in expressi yetişkin fare SAMs muhafaza etmek için gösterilmiştirAdenoviral enfeksiyon yoluyla ekzojen proteinlerin ilgili. Akut izole edilmiş ve bu yöntemlerle elde kültürlenmiş SAMs elektrofizyolojik ve görüntüleme çalışmaları çeşitli için uygundur.
Giriş
Kalp pili, kalbin sinoatriyal düğüm miyositler (sinoatriyal miyositler, "SAMs") her kalp atışı başlatmak için miyokardın yayılması spontan ritmik aksiyon potansiyelleri (AP) oluşturur. Birçok türlerden akut izole SAMs kullanarak deneyler pacemaker aktivitesi oluşturulmasına katkıda mekanizmaların aydınlatılması için gerekli olmuştur. SAMs morfolojisi, fonksiyon ve protein ifade bakımından atriyal ve ventriküler miyokardın kendi muadilleri önemli ölçüde farklılık çok özel kardiyomiyositlerde vardır. SAMs spontan AP damgasını sonraki AP 1,2 tetiklemek için eşik membran potansiyeli sürücüler diyastol sırasında bir spontan depolarizasyon olduğunu. Bu, "kalp pi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri Colorado Anschutz Tıbbi Campus Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır protokollere uygun olarak yapıldı. Standart protokol aşağıda yaşı 2-3 ay erkek C57BL / 6J fareler kullanılarak optimize edilmiştir.
1. Deneylerin Advance Çözüm Stoklar ve Malzemeleri hazırlayın
NOT: Gerekli ekipman ve malzeme malzemeleri Tablo bakın.
- Komple Tyrode, Düşük Ca 2 + / Mg 2 + Tyrode en Modifiye Kraft-Brühe (KB) Çözüm ve Sığır Serum Albumin (BSA) Çözüm: Tablo 1'de gösterildiği gibi 1 L aşağıdaki ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada anlatılan protokoller daha önce farklı yama kelepçe çalışmalarının 5-8 çeşitli için uygundur yetişkin farelerin kendiliğinden aktif SAMs izole etmek istihdam edilmiştir. Buna ek olarak, Protokoller, bir hafta süreyle kültür içinde muhafaza edilebilir izole SAM izin verir. Kültürlenmiş hücreler içine gene aktarılması adenoviral enfeksiyon 9 vasıtasıyla gerçekleştirilebilir. Bu bölümde sunulan sonuçlar önceki çalışmalarından elde ve akut izole ve kültürlü SAMs .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu kağıt yetişkin farelerin tamamen farklılaşmış sinoatriyal düğüm miyosit izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı protokoller sunar. yalıtım protokolü güvenilir anında elektrofizyolojik analizi ya da sonraki kültür ya da uygun kendiliğinden aktif fare SAMs üretir. Benzer protokolleri (örneğin, 11,12,10,13-17 referanslara bakın) birçok diğer gruplar tarafından rapor edilmiştir. Bununla birlikte, in vitro olarak yetişkin fare SAMs muhafaza edilmesi için protokol karakteristik morfolojisi, spontan aktivit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiç kimse.
Teşekkürler
Makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. Christian Rickert'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden (R01-HL088427) CP'ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir. EJS, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'nden 5T32-AG000279 tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sylgruard/Elastomer Kiti | Dow Corning | 184 SIL ELAST KİTİ 0.5KG | |
| Borosilikat 9" pastör pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Küçük, yuvarlak tabanlı kültür tüpleri | Fisher Scientific | 352059 | |
| Büyük, yuvarlak tabanlı kültür tüpleri | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biyokimyasal | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Doku ayrışma solüsyonu |
| Heparin | SAGENT İlaç Firması | NDC 25021-400-10 | |
| Fare Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm yuvarlak cam lameller | Fisher | 12-545-80 | |
| 24 kuyulu kültür plakası | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vektör Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vektör Biolabs | 1060 | |
| Plastik, tek kullanımlık transfer pipeti | Fisher Scientific | ||
| Mikro makas | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forseps | Roboz Aletleri | RS-4904 | |
| Doku Forsepsleri | Roboz Aletleri | RS-8164 | |
| Diseksiyon İris Makası | WPI, Inc. | ||
| Diseksiyon Pimleri | Güzel Bilim Araçları | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glikoz | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | >Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurin | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamat | Sigma | G1501 | |
| K-aspartat | Sigma | A6558 | |
| MgSO< sub>4 | Sigma | M7506 | |
| kreatin | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amfoterisin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-bütandion monoksit (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Sigma | A5611 | |
| İnsülin ve nbsp; | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma I3146 | ||
| Selenyum | Sigma | I3146 | |
| Penisilin | GE Sağlık | SV30010 | |
| Streptomisin | Hidroklon | SV30010 |
Kaynaklar
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
