İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi'nin olarak

Özet

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

Özet

humoral bağışıklık damgasını sentez ve bir patojen olarak bir antijen (Ag), özel Abs salgılar ve ana savunma için kullanılan fonksiyonel TSK, üretmektir. Bir bireyin hümoral bağışıklık tepkisinin fonksiyonel kantitatif tayini, serum Abs ve dolaşan TSK hem yaygın fonksiyonel çıktılan olarak ölçülür. İnsanlarda, çevresel kan ana B hücreleri tarafından ortaya hümoral bağışıklık tepkisinin saptanması için kullanılabilecek en uygun ve kolayca erişilebilir bir örneğidir. TSK kapsamda, farklı B hücresi alt-gruplar, akış sitometrisi ile sıralama seri spesifik Ab-konjuge mikro-veya hücre aracılığıyla seçim yoluyla periferal kandan doğrudan izole edilebilir. Ayrıca, arıtılmış naif ve bellek B hücreleri, aktive edilmiş ve kültür TSK olarak ayırt edilebilir. Ab salgılama katkıda TSK fonksiyonel aktivitesi, Enzim yakınsar bir deney olan, elispot testi ile tayin edilebilirB-bağlı immunoabsorbance deneyi (ELISA) ve Western lekeleme teknolojileri tek hücre düzeyinde tek tek TSK numaralandırılmasına sağlamaktır. Uygulamada, ELISPOT testi artan için kan örnekleri, çok sayıda kullanım kolaylığı aşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Periferik kandan insan B hücrelerini izole edilmesi yöntemleri, in vitro TSK olarak B hücrelerinin farklılaşmasını ve toplam IgM- IgG-TSK miktarının ELISPOT istihdam burada tarif edilecektir.

Giriş

B hücreleri, humoral bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynar. Onlar başlangıçta kemik iliğinde gelişir ve daha da geliştirilmesi için naif gibi dalak gibi lenfoid dokularda geçebilecek B hücreleri, lenf düğümleri ve bademcikler, kan akışı girin. Ag karşılaşma üzerine, bazı naif B hücreleri germinal merkez B hücreleri bellek B hücreleri ve plazmablastlar (PB) / plazma hücrelerinin (PC) içine ayırt edebilirsiniz lenfoid follikül içine göç ederler. En PB / PC'ler kan akışına çıkış yaparken, birkaç sonunda uzun ömürlü PC'ler ¹ içine terminal farklılaşma geçmesi kemik iliğinde bulunur. Dolaşımdaki B hücreleri heterojen ve kararlı durumda, PB / PC'ler, periferik kanda ² nadirdir. seri spesifik yüzey markerlerinin durumunu bir sonucu olarak, akış sitometrisi periferik kanda B-hücresi alt kümelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için uygun bir yöntem haline gelmiştir. Akış cytometr bir genişletilmiş uygulamaY, yüksek saflıkta ayrılmasını ve B hücrelerinin tek tek alt kümelerinin izole edilmesine izin veren, bir hücre sıralayıcı fonksiyonu eklenmesidir. İnsan dolaşımdaki B hücreleri, genel olarak üç temel alt popülasyonları sınıflandırılır farklı gelişim aşamalarında spesifik yüzey reseptörlerinin ekspresyonu göre: bellek B hücreleri (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-) saf B hücreleri ^{- (-} CD38 CD19 ⁺ CD27) ve PB / PC (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Şekil 1). doğası gereği Naif B hücreleri Ag'lerini karşılaşmadım. Bununla birlikte, IgM ⁺ CD27 ⁺ bellek B hücrelerine ayırt edilebilir. Naif B hücreleri B-hücresi antijen reseptörü (BCR) -associated molekülleri (örneğin, CD19, CD20 ve CD22) onların immünoglobulin repertuarı ⁵ heterojen ifade homojen olmasına rağmen. CD27 ⁺ bellek B hücrelerinin büyük bir çoğunluğu CD27 olarak ayırt edilebilir+ / hi CD38 ⁺ PB / PC'ler ^6. Buna ek olarak, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC poliklonal ve gelişimsel ve fonksiyonel heterojenliği ^4-7 sergiler. dolaşımda PB / PC'ler normalde kısa ömürlü ve CD138 ifade etmezler, ancak kemik iliğinde yerleşmek için yapılanlar ölümcül farklılaştırmak ve uzun ömürlü olacaktır. Terminal farklılaşmış PC'ler CD138 ifade ve yüzeyleri ⁸ CD27 molekülleri aşağı-düzenler. PB ve PC'ler hem Abs salgılayan yeteneğine sahip olduğundan, pek çok kez onlar topluca TSK olarak belirtilir. Buna mukabil, naif B hücreleri de bellek B hücreleri de Abs ^9-10 kayda değer miktarda üretebilir. Uygun kültür koşulları ^{6, 11-15} yerleştirildiğinde 10 gün - izole Yine de, hem naif ve bellek B hücreleri 3 TSK içine ayırt edilebilir. Aslında, TSK bu doğrudan izole fr ile CD27 ve CD38 in vitro farklılaştırma payı benzer yüzey ifadeler türetilmişom periferik kan ^6. Buna ek olarak, in vitro farklılaşan TSK bu PBS / PC ⁶ dolaşan benzer yüzey CD20 düşük seviyede eksprese eder. kültür kaynaklı TSK tüm kısa ömürlü olmasına rağmen, onlar işlevsel yetkin ve hümoral bağışıklık katkıda mümkün olduğunu belirten Abs salgılar olabilir.

kadar en sık uygulanan yöntemler hümoral immün yanıta fonksiyonel bilgi elde etmek için ELISA ve ELISpot hem de. ELISA 96 gözlü plaka bazlı deney, ve sık sık, serum Ag-spesifik Abs ve diğer analitler (örneğin, sitokinler) titreleri ölçmek için kullanılır. Bu uygun ve ölçeklenebilir. ELISA Sıvı bir numunede ^16, ABS veya serum gibi diğer maddelerin varlığını tespit etmek için bir katı-faz enzim tahlili kullanmak üzere tasarlanmıştır. Serum ELISA ile ilgili okumalar yaygın vücudun bağışıklık tepkisini temsil etmek için kullanılmaktadır. yeniden kazanılması için gerekli bir araçELISA tahlilleri ile ilgili adouts bir spektrofotometrik mikroplaka okuyucu. Okuyucu, tipik olarak yaban turbu peroksidazı (HRP) ile birleştirilmiş bayır algılama Abs ve spesifik alt tabakalar ¹⁷ reaksiyonundan elde edilen son ürünlerin optik yoğunluk (OD) belirleyebilir. humoral immün tepkisi raporlama ile ilgili olarak, ELISA ile tespit serum antikor düzeyleri vücutta TSK toplu, ancak tek tek değil, performans belirtmektedir. Buna ek olarak, ELISA dikkate Abs salgılar yok bellek B hücreleri tarafından katılımını almak için başarısız olur.

ELISA gibi, ELISpot tespit ve periferik kan örnekleri ^17-18 bağışıklık yanıtı izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. ELISPOT bir sandviç ELISA ile ilgili bir tekniktir. İçinde hücre polivinilidin diflorin (PVDF) kısa süreli bir kültür 96 çukurlu mikrolevhaların membran destekli kuyu içine yerleştirilir. ELISpot tahlil bir mikroplaka ve developin batı blotting gerçekleştirmeden benzerdirg her kuyuda PVDF zarı üzerinde lekeler. Bir otomatik ELISpot okuyucu sistemi veya elle sayım için bir stereomikroskopta gereklidir. bir bağışıklık tepkisinin tespit bölgesindeki ELISPOT ana avantajı TSK ve sitokin salgılayan hücrelerin miktarının onun süper hassasiyettir. Sırasıyla, humoral ve hücresel bağışıklık işlevsel faaliyetlerini bildirir. Hümoral bağışıklık fonksiyonu ölçümünde, ELISA ve ELISPOT tarafından numaralandırılan TSK sayısına göre belirlenir serum Ab düzeyleri sıklıkla ilişkilidir, ancak bu iki deneyleri veri readouts fonksiyonel etkileri ^19-20 bazı farklılıklar var. ELISPOT ana avantajı yönteminin onun hassasiyetidir. Abs uygun izotiplerinin bilinen bir miktarı, referans olarak dahil edildiğinde, ELISA ile belirlendiği şekilde, serum antikor titrelerinin seviyesi konsantrasyon çıktılan olarak, daha çok nicel göre antikor seviyesi gösteren OD çıktılan olarak da yarı-nicel olarak sunulmaktadır, ya da. Bunun aksine, ELISPOT sonuçları presente olanilgi konusu bir hücre havuzu TSK mutlak sayısı D (ör bölünmemiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve PBMC'lerden Saflaştırılmış B hücreleri) içerir. ELISpot tek ASC algılayabilir, ancak ELISA ölçümden önce optimize tahlil bağımlı konsantrasyonları ulaşmak için TSK dan Ab miktarda gerektirir. Bu nedenle, ELISpot ölçümü duyarlılığı ELISA besbelli üstündür. Ayrıca, ELISPOT, aynı zamanda aktive edilmiş hafıza B hücreleri in vitro farklı TSK ölçülmesi için uygundur. Bellek B hücreleri Abs salgılar yok ama aktivasyon üzerine TSK içine ayırt edebilirsiniz; bu nedenle ELISA ile tespit edilen serum Abs hiçbir katkısı var. Bu nedenle, ELISPOT kültüründe aktif hale bellek B hücrelerinin, dolaşımdaki bağışıklık tepkisinin ölçümü tercih edilen bir yöntemdir. Uzun vadeli humoral bağışıklığın bakım izlenmesi için izin verir.

Protokol

İnsan periferal kan aydınlatılmış onam altında sağlıklı donörlerden elde edilen edilmeli ve kan örneklerinin kullanılması bireysel kurumsal inceleme kurulları tarafından kurulan onaylanan yönergelere uyması gerekir. Bu çalışmada, protokol Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi İç İnceleme Kurulu (protokol numarası 201307019RINB) tarafından onaylandı akış sitometri (Şekil 1) ve ELISpot deneyleri (Şekil 3) sonuçlarının bir gösteriye insan kanı kullanmak için.

1. İzolasyon ve insan çevre kan B hücreleri ile saflaştırılması

1. K ₂ EDTA (1,5-2,0 mg / ml kan) içeren bir 15 ml tüp içine (dirsek kübital fossa anterior) medyan kübital damardan kan ~ 10 mL çizme ve Tüp hemen pıhtı önlemek için birkaç kez ters çevirin oluşumu.
2. Kırmızı kan hücresi (RBC), tampon (150 mM _NH4CI, 10 mM KHCO ₃ ve 1 mM EDTA lizis (121 ° C, 15 dakika) otoklava 35 mL ekleme sTaze kan örneği (≥ 3 içeren tüp H 7.4): 1 hacim / hacim) ve bundan sonra daha 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
   NOT: tüp aracılığıyla ışık geçirgenliği görünümü RBC lizis tamamlandığını gösterir.
3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. pelet beyaz renklidir olduğundan emin olun.
4. 10, otoklavdan geçirilmiş fosfat tamponlu tuz mL pelletini (PBS, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na ₂ HPO ₄ ve 1.47 mM KH ₂ PO _4; pH 7.4) ve 1.3 adım olarak santrifüj.
5. Süpernatantı atın ml RPMI 1640 ortamında (takviyeleri:% 10 fetal buzağı serumu, 100 U / ml penisilin / streptomisin, 0.25 ug / ml amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin) 10 pelletini, ve sonra plaka 10 cm'lik bir kültür tabağı içine hücreleri (tabak başına 10 ml kan). 30 dakika boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin.
6. Yavaşça kültür çanak birkaç kez girdap ve koyun15 ml plastik konik tüpler içine kültür ortamı (süspansiyon hücreleri). kültür yemekleri yapışık hücrelere (çoğunlukla makrofajlar) atın.
7. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
8. RPMI 1640 ortamı içinde 1 mL pelletini. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını sayın.
   Not: İzole lökositlerin canlılığı normal tripan mavi dışlama% 90 daha büyüktür.
9. Aşama 1.7 olarak santrifüj ve 5 konsantrasyonda soğuk PBS tampon (% 0.5 inek serumu albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) içinde ~ 200 uL hücreler tekrar süspansiyon - 10 x 10 ⁶ hücre / mL idi.
10. 10 ⁶ hücre başına (B hücrelerinin negatif seçim için) kan hücrelerine spesifik biyotinile edilmiş anti-insan antikor kokteyli 5 uL ilave edin ve 30 dakika ²¹ buz üzerinde inkübe edilir.
    Not: Anti-insan antikor kokteyli, en azından CD2 (ya da CD3), CD14, CD16 özgü Abs içermelidir.
11. 10 kat fazla hacim eklemesteril PBS hücreleri, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ve süpernatant atmak.
12. Eşit streptavidin-konjuge mikroboncuk miktarda pelet (10 ⁶ hücre başına 5 uL) ilave edin ve iyice karıştırın.
13. 15 ml plastik konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
14. tüpe PBS tamponu 2 mL ekleyin.
15. Manyetik bir stand içine tüp yerleştirilir ve 8 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Kahverengi mikroboncuklarının yavaş yavaş yanında mıknatıs ²² tüp duvar eklenecektir.
16. Manyetik stand kalan tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril 15-ml tüp ²² içine süpernatant aktarın.
17. Tekrarlayın 1.16 ile 1.14 arasındaki adımları ve el değmemiş B hücrelerini içeren iki süpernatantlar birleştirir. mikrobilyeleri atın.
18. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
19. alt deneyler için RPMI 1640 ortamında pelletini.
    NOT: Genellikle, 1-5 x 10 ⁵ B hücreleri zekâhektar periferik kan, 10 mL% 95 daha yüksek saflıkta ²³ izole edilebilir.

İzole B Hücreleri 2. saflaştırılması ve Bellek Ayırma ve naif B Hücreleri

1. Adım 1 saflaştırılmış hücreleri kullanın ve bir hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayısını belirlemek.
2. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ve oda sonra soğuk PBS tampon 100 ul hücrelerin tekrar.
3. Kapalı 1 - 10 ⁶ hücre başına biyotinile CD27 mAb'nin 2 ug ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
4. 5 dakika boyunca 600 x g'de tüp ve santrifüj PBS tamponu 10 mL ekleyin.
5. Süpernatantı atın ve PBS tampon 50 mcL hücreleri tekrar süspansiyon.
6. 15 ml plastik konik tüp hücrelere - (2 ug / 10 ⁶ hücre 1) streptavidin manyetik mikro boncuklar eşit miktarda ekleyin.
7. Yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
8. tüpe PBS tamponu 3 mL - 2 ekleyin.
9. YeriManyetik bir stand içine boru ve kahverengi bir mikro-mıknatıs en yakın tarafına takmak için izin 8 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
10. manyetik stand tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril tüpe süpernatant fraksiyonu aktarın. Naif B hücreleri ^- Bu fraksiyon zenginleştirilmiş CD27 içerir.
11. Mikroboncuklar içeren tüp 5 ml ilave edilir ve yavaşça, mikro-boncuklar tekrar süspansiyon (örneğin, CD27 ⁺ bellek B hücrelerinin zenginleştirilmiş fraksiyon) ^24-25.
12. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. alt deneyler için RPMI 1640 ortamı ile pelet yeniden süspanse edin.
    Not: Genellikle, ~ 30 - B hücreleri% 60 sağlıklı donörden ^{7, 25-26} PBMC'lerden CD27 ⁺ bellek hücresi saflaştırılabilir.

Naif B Hücreleri, Bellek B Hücreleri ve PB / PC'ler Tahsil sıralama 3. Hücre

1. 1 aşamasından gelen arıtılmış, hücreleri kullanarak, bir hemocytome kullanılarak hücre sayısını belirlemekter ya da otomatik hücre sayacı.
2. 5 ml polistiren tüp içinde 10 ^7'deki mL konsantrasyonda soğuk PBS tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri.
3. Kapalı 1 - 10 ⁶ hücre başına, insan IgG 2 ug ve Fc blok için, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
4. 1 ug her bir ekleme, anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323) ve anti-CD38-PE (klon: HIT2), 10 ⁶ hücre başına; karıştırın ve 30 dakika ^{4, 27} için buz üzerinde inkübe edilir.
5. Adım 3.4 son 5 dakika içinde, ticari 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 5 mcL ekleyin.
6. 5 dakika boyunca 600 x g'de tüp, girdap ve santrifüj 2 mL PBS ekleyin.
7. 15 ml bir tüp içinde mL başına 5 x 10 ⁷ hücre - 1 bir konsantrasyonda (% 2 BSA ve 2 mM EDTA ile, steril PBS) tampon sıralama tekrar süspansiyon hücreleri.
8. hücre kümeleri ortadan kaldırmak için bir naylon örgü hücre süzgecinden (40 mikron gözenek boyutu) aracılığıyla hücrelere Filtre.
9. bir akış sitometri tür hücreleri ayırınmor (405 nm), mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm): er üç lazer ile donatılmış.
   NOT: 3 renkli sitometri ^27-28 akış yalnız mavi lazer yeterlidir.
10. Sıralama, üç saf B hücrelerinin aynı anda toplama (5 ml RPMI ortamı ihtiva eden) 15 ml tüpler (CD19 ⁺ CD27 ^-) içine hücreleri, hafıza B hücreleri (CD19 ⁺ CD27 ^+), ve PBS / PC (CD19 ⁺ CD27 ^{+ / hi} CD38 ^{+) 3-4, 28.}
    Not: Aşama 4'te tarif edildiği gibi kriteri naif ve bellek B hücreleri, kültürlenebilir.

Naiv B hücreleri ^- izole edilmiş insan CD19 ⁺ B hücreleri, CD19 ⁺ CD27 ⁺ hafıza B hücreleri, ve CD19 ⁺ CD27 in vitro ayrımında 4.

1. adımlarda 1.19, 2.10, 2.11 ve 3.10 olarak saflaştırılmış hücreleri kullanarak, bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını belirlemek.
2. RPMI 1640 ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri1 bir konsantrasyonda - ve ml başına 10 X 10 ^5, 12 oyuklu plakanın kuyularına kısım.
3. / Ml ^{18, 29} 5 mg / 10 ⁶ hücre CpG (ODN 2006) ekleyin.
4. Kültür, 5 gün boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C inkübatör hücreleri.
5. Her bir oyuğa hücreleri hasat 15 ml tüpler içinde ayrı ayrı yer, her tüpe 5 ml PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'de ve oda sıcaklığında santrifüj.
6. Hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. RPMI 1640 ortamı ile mL başına 10 X ^Ekim 5-1 arasında bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri.

5. ELISPOT testi

1. 30 s için ELISPOT levhaların her çukuruna damıtılmış su içinde% 35 etanol içinde 30 uL ekleyin.
   NOT: pipetlerken zaman her zaman kuyularda membran dokunmaktan kaçının.
2. etanol kaldırmak için ELISpot plakları ters çevirin.
3. Her kuyuya 150 ul otoklava GKD ₂ O koyun ve inkübe5 dakika boyunca oda sıcaklığında bunları bakiye Etanol temizlemek için; 3 dakika boyunca oda sıcaklığında steril PBS yıkama ile takip edin.
   NOT: 5.3 5.1 plakaların imalatı bağlı isteğe bağlı olabilir adımlar.
4. Adına 5 ug / ml poliklonal F (ab ') anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) ₂ fragmanı, 50 uL bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe (PBS içinde) ELISPOT plakaların her kuyuya ve (tercih edilir) ya da 2 saat ¹¹ süreyle 37 ° C.
   NOT: kullanılıncaya kadar Parafilm ile plakaların kenarları mühür.
5. 3 dakika her zaman için oda sıcaklığında iki bağlanmamış Abs kaldırmak her iyi PBS 200 mcL ekleyin ve bunları inkübe plakları ters çevirin.
6. de bloke edilmesi için her bir% 5 BSA (ya da RPMI 1640 ortamı) 200 ul PBS ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe.
7. engelleme tampon kaldırmak için plakları ters çevirin. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın.
8. Her bir oyuğa RPMI 1640 ortamı, 100 uL ilave edin ve 37 ° C'de inkübe.
9. hazır hücreleri tohum olduğunda, RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin.
10. Tohum 100 uL (5 x 10 ^4), 50 uL (2.5 x 10 ⁴⁾ ve bir kuyu içine 25 uL hücre (1.25 x 10 ⁴⁾ (adımlar 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 ile ilgili ve 4.6) ELISpot plaka. RPMI 1640 ortamı ile, / oyuk 150 uL hacim getir.
    Not: hücreleri kaplama için bir ya da iki 2-kat seri seyreltiler en az tavsiye edilir.
11. 14 saat ^18-8 için% 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör inkübe edin. inkübasyon sırasında plakalar hareket kaçının.
12. hücreleri ve RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin.
13. 3 dakika boyunca, oda sıcaklığında, her zaman 5 kez (% 0.05 Tween 20 ile PBS) 200 uL / ​​göz PBS-T ilave edin ve inkübe. 5 yıkar her biri arasındaki yıkama tamponu çıkarmak için plakayı ters çevirin.
14. Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz (AP), Fcy özgü Abs ya ekleme (IgG tespiti, 1: 5000 PBS-T içinde) Ya da keçi anti-insan IgM-AP, Fcμ fragmanı spesifik Abs (IgM algılama, 1: PBS-T içinde 5,000) tahsis edilen gözleri içinde ve karanlıkta, 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
15. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın.
16. 50 uL / ​​oyuk bromochloroindolyl fosfat nitro mavi tetrazolyum (BCIP / NBT) alt-tabaka çözeltisi ekleyin. 15 dakika - Mor renkli lekeler normalde 5 görünür.
17. Noktalar aşırı gelişimini önlemek için 100 uL / oyuk GKD ₂ O ekleyin.
18. tüm noktalar tam gelişiminden sonra akan musluk suyu ile plakaları durulayın.
19. Plakaların Alt drenaj çıkarın ve onları karanlıkta kuru hava için izin verir.
20. Bir görüntü alıcı / analiz ünitesi (örneğin, otomatik bir tarayıcı veya manuel bir mikroskop ile) ile otomatik bir plaka okuyucusu kullanılarak noktalar sayın.
    NOT: plakalar, karanlıkta oda sıcaklığında saklanır ve daha sonra analiz edilebilir.

Sonuçlar

PBMC'ler eritrosit ve yapışık hücrelere (1.7 1.2 adımlar) tükenmiş bulundu. Hücrelerin bir tümböleni (2 x 10 ⁶⁾ periferal kan (Şekil 1) saf B hücreleri, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC popülasyonunu gösteren bir akış sitometrik analizi yapıldı. Bu vericinin PBMC'ler olarak, lenfositler, yaklaşık% 10 CD19 ⁺ B hücreleri idi. B-hücresi bölümünde, CD19 ⁺ CD27 yüzdesi ^- naif B hücreleri% 50 civarında idi. Öte yandan, CD19 ⁺

Tartışma

İzolasyon ve İnsan periferal kan B hücrelerinin saflaştırılması

Normalde, RBCs verimli rüptüre ve lizis tamponu (adım 1.2) tarafından silinebilir. hücre canlılığı amonyum klorür ile etkilenebilir gibi, 5 dakika daha uzun RBC parçalama tamponu ile PBMC'ler inkübe önemlidir. Seçenek olarak ise, RBC ve trombositlerin aynı zamanda aşağıdaki protokol ile temizlenebilir.

asit dekstroz sitrat (ACD) tamponu taze tam kan karıştırın (39 mM sitrik asit, 75 mM sodyum sitrat...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD Vacutainer K2E	BD Biosciences	367525	10 mL tüp
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02	endotoksin içermeyen
Tripan mavisi %0,5 çözelti	Biyolojik Endüstriler	03-102-1B
IMag İnsan B lenfosit zenginleştirme seti	BD Biosciences	558007
Biyotinillenmiş CD27 mAb	Biolegend	302804	klonu O323
Streptavidin manyetik mikro boncuklar	BD Biosciences	9000810
15 mL Falcon tüpleri	BD Falcon	352196
Mavi naylon örgü hücre süzgeci, 40 & mu; m	BD Falcon	352340
Anti-insan CD19-APC	Biolegend	302212	klonu HIB19
Anti-insan CD27-eFluor 450	eBioscience	48-0279-42	klonu O323
Anti-insan CD38-PE-Cy7	Biolegend	303516	klonu HIT2
Anti-insan CD38-PE-Cy7	BD Biosciences	560677	klonu HIT2
Anti-insan CD45-FITC	Biolegend	304006	klonu HI30
Anti-insan CD45-FITC	BD Biosciences	555482	klonu HI30
Anti-fare / sıçan / insan CD27-PerCP Cy5.5	Biolegend	124213	klonu LG.3A10
Anti-insan CD27-PerCP Cy5.5	BD Biosciences	65429	klon L128
Anti-insan CD19-FITC	Miltenyi Biotec	130-098-064	klon LT19
Anti-insan CD19-FITC	GeneTex	GTX75599	klonu LT19
Anti-insan CD20-FITC	BD Biosciences	555622	klonu 2H7
biyotinile anti-insan CD27	Biolegend	302804	klonu O323
biyotinile anti-insan CD27	eBioscience	13-0279-80	klonu O323
7-aminoaktinomisin D (7-AAD)	BD Biosciences	559925
CpG (ODN 2006)	InvivoGen	tlrl-2006	tip B CpG
Rekombinant insan IL-2	PeproTech	200-02
Rekombinant insan IL-10	PeproTech	200-10
Rekombinant insan IL-21	PeproTech	200-21
Rekombinant insan sCD40L	PeproTech	310-02
S. aureus Cowan (SAC)	Protein ASigma-Aldrich	82526
Pokeweed mitojen (PWM)	Sigma-Aldrich	L9379
MultiScreen filtre plakaları, 0.45 ve mikro; m gözenek boyutu	Merck Millipore		MSIPS4510 steril, şeffaf 96 oyuklu, hidrofobik PVDF membranlı
filtre plakası BCIP/NBT çözeltisi Sigma-Aldrich		B6404
BCIP/NBT tek reaktif, alkalin fosfataz substrat	Merck Millipore	ES006
İnsan IgG	Jackson ImmunoResearch	009-000-003
İnsan IgG, Fc parçası	Jackson ImmunoResearch	009-000-008
F (ab') < sub>2< / sub> keçi anti-insan Ig parçası (IgG + IgM + IgA)	Jackson ImmunoResearch	109-006-127
Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz, Fc & gama; fragmana özgü	Jackson ImmunoResearch	109-055-008
Keçi anti-insan IgM-alkalin fosfataz, Fc & mikro; fragmana özgü	Jackson ImmunoResearch	109-055-043
Keçi anti-insan IgG-peroksidaz, Fc & gama; fragmana spesifik	Jackson ImmunoResearch	109-035-008
Keçi anti-insan IgM-peroksidaz, Fc & mikro; fragmana özgü	Jackson ImmunoResearch	109-035-095
BD ELISPOT AEC substrat kiti	BD Biosciences	551951
CTL ImmunoSpot analizörü	C.T.L.