Yöntem makalesi

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

13.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54586

⸱

17 Eylül 2016

 , 
1Institute for Molecular Plant Sciences, University of Edinburgh

Bu makalede

Özet

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Özet

Bitki sirkadiyen saati, çevredeki günlük değişikliklerin öngörülmesini sağlar. Bu beklenti, zamansal olarak öngörülebilir biyotik ve abiyotik strese verilen tepkilere yardımcı olur. Tersine, sirkadiyen zaman işleyişinin bozulması bitki sağlığını ciddi şekilde tehlikeye atar ve tarımsal ürün verimini azaltır. Bu nedenle, transkripsiyonel saat mekanizmasının hareketini etkileyen faktörler de dahil olmak üzere, bitkilerdeki sirkadiyen ritimlerin karmaşık düzenlemesini anlamamız zorunludur.

Model bitki Arabidopsis thaliana'da (Arabidopsis) sirkadiyen kusurların test edilmesi, geleneksel olarak belirli mutant çizgileri, bir sirkadiyen saat gen promotöründen ateşböceği lusiferazını ritmik olarak ifade eden bir çizgiye geçmeyi içerir. Bu yaklaşım zahmetli, zaman alıcıdır ve bir mutantın sirkadiyen fenotipi yoksa sonuçsuz olabilir. Burada sunulan metodoloji, sirkadiyen fenotiplerin hızlı bir şekilde ilk değerlendirmesine izin verir. Mutant ve vahşi tip Arabidopsis'ten türetilen protoplastlar izole edilir, ritmik olarak ifade edilen ışıldayan bir raportör ile transfekte edilir ve 5 gün boyunca sabit ışık koşulları altında görüntülenir. Lüminesan izleri, mutant bitkilerin serbest çalışma periyodunun yabani tip bitkilerden farklı olup olmadığını doğrudan ortaya çıkaracaktır. Yöntemin avantajı, herhangi bir Arabidopsis hattının, bu mutant arka planda stabil bir şekilde transgenik ışıldayan bir saat işaretleyici hattı oluşturmaya gerek kalmadan verimli bir şekilde taranabilmesidir.

Giriş

Birçok canlı organizma çevreye günlük değişikliklerin etkili müzakere yardımcı olmak için bir endojen hakemi sahiptirler. Bu hakemi, sirkadiyen saat, dış ortamda öngörülebilir değişiklikleri tahmin etmek bir organizmanın metabolizması ve fizyolojisi birçok açıdan düzenler. 4 - örneğin bitkilerde, geçici öngörülebilir patojen veya otobur saldırıları beklentisiyle güçlü genel duyarlılık 1 azaltır. Nişasta metabolizması sıkıca uzun ya da kısa günün şartlarında 5 yetiştirilen olsun sabaha kadar son o nişasta rezervleri sağlamak için sirkadiyen saat düzenlenir. Nitekim, 24 saat çevre gösterisi artan büyüme oranları eşleşen sirkadiyen saatleri ile bitkiler, karbon fiksasyonu oranları ve sağkalım oranları uyumsuz dönemi 6 bir saat çalışan bitkilere kıyasla. Bütün bu süreçlerde sirkadiyen ritim geniş etkisi üçte kadar ritmik düzenlemelerinden büyük ölçüde ortaya çıkarArabidopsis 7 toplam transcriptome. Bu ritmik gen ürünleri metabolik yollar, hormon sinyalizasyon ve stres yanıtları 7 dahil, hücresel süreçlerin geniş bir yelpazede yer alırlar. Bunun üzerine, protein fonksiyonunun doğrudan sirkadiyen düzenleme fosforilasyon 8 sirkadiyen düzenlemesi ve büyük olasılıkla diğer post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) tarafından kurulmuştur.

Bu günlük transkripsiyonel yeniden programlamayı sürücüler sirkadiyen saat merkezinde / öteleme geri besleme sabah ifade genler de dahil olmak üzere (TTFLs), döngüler transkripsiyonal bir ağ yatıyor ifade bastırmak sirkadiyen saat ASSOCIATED 1 (CCA1) ve Geç UZATILMIŞ hipokotil (Lhy) - 11 LUX ARRHYTHMO (LUX), erken çiçek açan 3 (ELF3) ve ELF4 9; akşam genleri CAB 1 (TOC1), gigantea (GI) ve akşam kompleksi (EC) üyelerinin zamanlaması. birlikte zekâH Yalancı TEPKİ REGÜLATÖRÜ -genes (PRR3, 5, 7 ve 9) AT pozitif bir regülatörü 12 olarak görev yapar iken, TOC1 CCA1 / Lhy ekspresyonunu bastıran - 14. TTFL ağ bileşenleri, geri besleme mekanizmaları Ek transkripsiyon sonrası ve post-translasyonel regülasyon ayar sirkadiyen ritimler önemli bir rol oynar. Bugüne kadar, sirkadiyen saat proteinleri tespit en bol PTM fosforilasyonu 15'dir. Kazein Kinaz 2 (CK2) tarafından CCA1 fosforilasyonu onun promotörleri 16 hedef bağlanma ve sirkadiyen saat 17 sıcaklık dengelemesi açısından önemlidir etkiler. PRR proteinleri farklı şekilde sirkadiyen döngüsü boyunca fosforile ve TOC1 fosforilasyonu negatif regülatörü ile etkileşimi etkiler vardır, akşam aşamalı saat bileşeni ZEITLUPE (ztl) 18. Bu örnekler kadar 24 saat içinde PTMS ve protein-protein etkileşimleri ayar TTFL ağıtranskripsiyonel osilatör. Transkripsiyonel saat ağı ve düzenlenmesi için daha detaylı bir giriş için mükemmel son yorumları (örneğin referans 15) bulunmaktadır.

Ancak, ne daha az açık kalır ritmik düzenlenmiş süreçler ve hücresel metabolizma diğer yönleri geri timekeeping mekanizması kendi içine beslemek için derecesidir. Saat kusurları için Arabidopsis mutantlar geniş tarama mekanizmaları ya da sinyal yolları bir TTFL ağdan 24 saat ritimlerin üretiminde rol oynayan edilebileceği ileri anlayışa olabilir. Bu amaçla, Kim ve Somers önce herhangi bir Arabidopsis çizgisi 19 saat fonksiyonu etkin ve hızlı analiz için bir kırılma yoluyla yöntemi yayınladı. protoplast geçici ekspresyonu kullanımına göre, bu yöntem, stabil transgenik kuşaklar için ihtiyaç aşan ya da lüminesan saat markör hatları geçmektedir. Burada, bir yüksek verimli protoplast, izolasyon görselleştirmekoptimize edilmiş bir protokol ile birlikte n yöntemi 20, 96 oyuklu bir plaka okuyucusunda geçici olarak ifade saat belirteçlerin lüminesan görüntüleme sirkadiyen kusurları ekranlanması için kullanıldı.

Biz değişmiş sirkadiyen ritim algılar burada başarılı açıklanan metodoloji onaylamak için iyi karakterize saat mutantlar için yabani tip Koleji'nden 0 Arabidopsis karşılaştırır. LUC 19: CCA1pro; bu hatlar türetilen Protoplastlar sirkadiyen CCA1 promoterinden ateşböceği lusiferazı eksprese eden bir raportör yapısı ile transfekte edilir. Lusiferaz Bu da, bu protoplastlarda genlik, transkripsiyonel ritim faz değerlendirmek için zamanla görüntülendi olan, ışığı 21 yayar oksilusiferin luciferase için elektronik olarak uyarılmış dönüştürüldüğü çok aşamalı reaksiyonu katalize eder.

protokol üç ana bölümden oluşmaktadır; haberci plazmid ve lüminesan IM protoplast transfekte edilmesi, protoplast izolasyonyaşlanma. Bu üç parça, her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve reaktifler kullanılarak, tek bir günde yapılmalıdır. Bitki büyümesi ve raportör plasmidinin yeterli miktarda saflaştırılması önceden yapılmalıdır ve bu protokolde görselleştirilemediği.

Protokol

NOT: Bu protokol, tarif edilen reaktifler ve miktarlar test edilir Arabidopsis satıra ifade edilmiştir ve bu genotip altı kopya kuyu neden olur. Birden fazla satır analiz ederken satır sayısı ile malzeme çarpın analiz edilecek. (Ek çizgilerinden Örnek sonuçlar daha sonra verilecektir rağmen) videoda, vahşi tür Arabidopsis sirkadiyen saat değişken sıra ZTL karşılaştırılacaktır.

Enzim çözeltisi
selülaz % 0.5 (ağırlık / hacim)
pektinaz R10 % 0.25 (ağ / hac)
D-manitol 400 mM
CaCl2 10 mM
KCI 20 mM
Sığır serum albumini % 0.1 (ağırlık / hacim)
MES, pH 5.7 20 mM
W5 çözümü
NaCI 150 mM
CaCl2 125 mM
KCI 5 mM
MES, pH 5.7 2 mM
glikoz 5 mM
MMG çözümü
MES, pH 5.7 4 mM
D-manitol 400 mM
MgCI2 15 mM
PEG çözeltisi
PEG4000 % 40 (w / v)
D-manitol 200 mM
CaCl2 100 mM
Görüntüleme çözümü
W5 çözümü nihai hacme
Fetal sığır serumu % 5 (h / h)
luciferin 1.2 mM
ampisilin 50 mg / ml

Tablo 1: çözümlerin listesi.

Malzeme ve Tamponlar hazırlanması 1.

  1. bitki Malzemeleri
    1. Arabidopsis Col tutmak -0 su içinde tohumları 1.5 ml bir tüp içinde, 4 ° C'de karanlıkta dört gün. Bir tencerede toprak üzerine tohum pipet ve 7 gün süreyle 21 ° C'de uzun gün koşullarında (16 saat ışık 8 saat karanlık) transfer. yüksek nem sağlamak için ilk üç gün boyunca pot bir kapak bırakın. Transplant altı yeni bir 8 cm x 13 cm x 5 cm pota fide ve anoth için aynı koşullar altında büyüyen bitkiler devam21 gün er. Toprak boyunca nemli olduğundan emin olun.
  2. Reporter plazmid
    1. Üreticinin talimatlarına göre bir DNA izolasyon kiti kullanılarak önceden bakteriyel kültürden LUC raportör plazmidi 19: CCA1pro saflaştınlır.
      NOT: 20 ug raportör plazmid bir transfeksiyon için (dH 2 O 2 mcg / ul 10 ul) gereklidir.
  3. Çözümler
    Not: Bu beş çözelti gerekli protokolü için: Enzim çözeltisi, yıkama 5 (W5) solüsyonu, mannitol-magnezyum (MMG) çözeltisi, polietilen glikol (PEG) çözeltisi ve görüntüleme çözeltisi (Tablo 1). protoplast izolasyon adıma geçmeden önce bu hazırlayın.
    1. Tablo 1 'deki gibi, enzim çözeltisi, 10 ml hazırlamak enzimler son ekleme ve filtre 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti sterilize edin.
    2. Aşağıdaki hacimlerde kalan çözümleri hazırlayın: 15 ml W5 çözüm, 10 ml MMG szüm, 1, Tablo 1 gereğince ml PEG çözeltisi ve 1.5 ml görüntüleme çözümü.
      Not: Bu, PEG çözeltisi PEG tamamen çözünmüş olmasını sağlamak için önce transfeksiyon, bir saat daha az hazırlanmış olması önemlidir. Filtre 0.22 mikron şırınga filtre ile görüntüleme çözümü sterilize edin.

figure-protocol-1

Şekil 1:. Protoplast izolasyonu yetişkin Arabidopsis bitkilerinin (A) yaprakları alt epidermal tabaka (B) yukarı bakacak şekilde otoklav banda sabitlenir. (C) sihirli bantta yavaşça 15 ml konik bir tüp ucu ile alt epidermal tabaka üzerine basılır. (D) magic bant mezofil hücreleri (E) ortaya çıkarmak için kaldırılır. (F) izni ile otoklav bant şeritlerEkli çözeltisinin içine protoplast serbest enzim çözüm içeren selülaz ve pektinaz süzülüyor edilir. (G) iskelet enzimi sindiriminden sonra otoklav bant kalır ve yaprak enzim solüsyonu (H) protoplast bırakarak atılır. (I) Final ortaya çıkan mezofil protoplastlar (Ölçek çubuğu = 50 um). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Protoplast İzolasyonu

  1. bir petri kabı etiketleyin ve 10 ml filtre ile sterilize edilmiş enzim çözeltisi ekleyin.
  2. Temiz bir laboratuvar yüzeyinde yapışkan tarafı yukarı ile otoklav bant dört şeritler düzeltmek ve şeritler üzerinde petri boyutunu işaretleyin.
  3. (4 haftalık bitkilerin (Şekil 1a) yaprakları kesin ve yukarı bakacak şekilde alt epidermal yüzeye yani (otoklav bant üzerine üst epidermis basın Şekil 1b)).
  4. Yavaşça 15 ml konik tüp kullanarak alt epidermal yüzeye sihirli bant şeritler basın. Yaprak dokusu (Şekil 1c) ezmek için özen gösterin. Dikkatle alt epidermis şerit sihirli bandı çekip (Şekil 1d) ve mezofil hücreleri (Şekil 1e) maruz kalmaktadır.
  5. Petri içine bandı taşımak ve enzim solüsyonu (Şekil 1f) üzerinde yüzer, kullanım cımbız petri sığdırmak için otoklav bandı kesti, aşağı bakacak bırakır. protoplastlar çözeltisi içine çıkacak sırasında, 60 dakika için bir platformlu sallayıcı üzerinde 60 rpm'de döndürün.
  6. 50 ml konik tüp içine protoplast (Şekil 1h) içeren çözüm kaldırmak ve otoklav bandı (Şekil 1g) şeritler atmak ve pipet için cımbız kullanın. Geniş çaplı bir pipet (örneğin P5000 ucu ve sonu olmayan bir P1000 ucu kesilmiş gibi) kullanın.
  7. 100 x protoplast santrifüj4 ° C'de 3 dakika boyunca g bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu için, dikkat edin.
  8. tüp hafifçe dönen 10 ml W5 protoplastlar çözüm ve tekrar süspansiyon ekleyin.
  9. 30-60 dakika boyunca buz üzerinde protoplast bekletin. Bu adım sırasında, bir hemasitometre (Şekil 1i) 'de protoplast sayılarak verim değerlendirmek.
  10. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj ile protoplast toplamak ve bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu için, dikkat edin.
  11. Mmg çözeltisi içinde 5 x 10 5 protoplastlar / ml'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse protoplast.

3. Protoplast Transfeksiyon

  1. 15 ml konik tüp, 10 ul raportör plasmidini (2 ug / ml) eklenir.
  2. tüpe 400 ul protoplast ekleyin.
  3. bir hacmi (410 ul) PEG çözeltisi ekleyin ve protoplast transferinde yavaşça 12 kez tersini tüp karıştırın.
  4. 8-15 dk inc sonraOda sıcaklığında ubation, dört ciltlik (1640 ul) W5 çözeltisi ile protoplast-DNA-PEG karışımı sulandırmak ve yavaşça altı kez ters yüz edilerek karıştırılır.
  5. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj ile ara enfekte edilmiş protoplastlar toplamak ve bir pipet ile süpernatantı. pelet çok gevşek olduğu gibi bir kez daha, dikkat edin.
  6. 1250 ul görüntüleme çözelti içinde protoplast yeniden süspanse edin.
  7. altı içine kısım 200 ul W5 çözeltisi ile boş kuyu doldurun ve lüminesan görüntüleme için uygun bir yapışkan açık bir kapak plakası mühür, 96 kuyulu plakanın kuyularının çoğaltırlar.

4. Görüntüleme

  1. Bitki görüntüleme için uygun olan herhangi bir ışıldayan görüntüleme kurulum plaka aktarın. kuyular arasında yoğunlaşma ve basınç farklılıklarını önlemek için transferinden sonra plakalar 10-15 dk yapışkan kapakları değiştirmek, daha sonra görüntüleme başlatın. Plaka, oda sıcaklığında beş gün süre ile her ~ 45 dakika (3 san oyuk başına) okuyun.
    NOT:plaka frekans okur ve kuyu başına okuma zamanlı görüntüleme kurulumuna bağlı olarak değişebilir.

5. Veri Analizi

  1. Herhangi bir analiz yazılımı (örneğin, Biyolojik Ritimleri Analizi Yazılımı Sistemi (PİRİNÇ) 22) kullanarak lüminesans sonuçlarını analiz. sirkadiyen kusurları ortaya çıkarmak için, vahşi tipli kontroller ile değişken sıra Karşılaştırması.

Sonuçlar

Vahşi tip Arabidopsis protoplastlarını cca1 / Lhy (kısa süreli mutantı 2), ZTL (uzun süreli mutantı 23) ve aşın hattı CCA1 OX (24, ritmik) bilinen saat mutantları ile karşılaştırıldı. Tüm geçici CCA1pro ile transfekte edildi: LUC raportörünün, 5 gün boyunca, bir plaka okuyucusu üzerinde sabit ışık görüntüsü alınmıştır.

Burada cca1 / Lhy mutant, sirkadiyen kontrollü gen ekspresyonunun serbest çalışma süresi lüminesan saat stabil transgenik ekspresyon 2,9 belirteçleri ile analiz geçme süresi ile uyumlu olarak, (Şekil 2a) kısaltılır göstermektedir. ZTL mutant protoplastlarını sirkadiyen salınım süresi yabani tip daha uzun (Şekil 2b), fidelerden yayınlarla uygun olarak, hücre süspansiyonu, Cultures ve protoplastlar 19,23,25.

CCA1 aşırı ekspresyonu sabah fazda saat kilitler ve küresel transkripsiyon aritmik 24 olur. CCA1 OX protoplastlar (Şekil 2c) 'de LUC ifade: Tutarlı, biz CCA1pro hiçbir salınımların gözlemledi.

figure-results-1
Şekil 2: col- 0, cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 ve Protoplast Günlük ritimler Protoplasts OX geçici CCA1pro ile transforme edilmiştir: LUC inşa ve lüminesans sirkadiyen ritimler 5 gün içinde görüntülendi (A - C). (D) Col -0, cca1 / Lhy ve ZTL lüminesans izleri dayalı Sirkadiyen dönem tahminleri (A - B). Ben miBir ± SEM, n = 3-5, belirtilen t-testi p değeri olarak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Genotip Dönem (protoplastlar) Dönem (transgenik) Tarafından rapor edildi: Referanslar
col- 0 23.0 ± 0.21 24.4 ± 0.09 pCCA1: Col LUC -0 (2)
cca1 / Lhy 20.6 ± 0.13 19.9 ± 0.11 pCCA1: Col LUC -0 (2)
~ 18 L er arka RNA (9)
ZTL 25.1 ± 0.12 27.4 ± 0.5 CAB2: C24 ekotipindeki LUC (22)
CCA1 OX aritmik aritmik pCCA1: LUC (LD verileri sadece) (2)
aritmik Col -0 arka RNA ve protein (23)

Tablo 2: Transgenik fidanı ile karşılaştırıldığında protoplastlan Günlük ritimler pCCA1 sirkadiyen dönemi:. Dönem ilk mutasyon rapor uzunluklarda ve varsa kıyasla protoplastlarda LUC ifadesi pCCA1 ile: Col -0 yılında LUC ifadesi.

Tartışma

Burada, protoplast izolasyonu, transfeksiyon ve luminecent görüntüleme dahil olmak üzere Arabidopsis hatlarında sirkadiyen dönem kusurları, ekrana hızlı bir test sunuyoruz. Yabani tip sirkadiyen süresi Arabidopsis ve saatli mutantları cca1 / Lhy, ZTL ve CCA1 OX bir CCA1pro gelen lüminesan ölçümlerinden hesaplandı: LUC raportörünün daha sürülme süresini kullanarak bütün bitkilerde üretilen yayınlanmış verilerle tutarlı olduğu bulunmuştur tüketen transgenik yaklaşımlar (Tablo 2). Arabidopsis mutantlar taranması için Bu tayin kullanılarak, zaman alıcı ve yalnızca belirli bir mutant yabanı ritimleri sergiler ortaya çıkarabilir transjenik lüminesan hatları oluşturmak için ilk şartı önler. Bu protokolün açık bir avantajı, herhangi bir Arabidopsis hat tesislerinde timekeeping etkileyen daha genlerin belirlenmesini yardımcı olacaktır değişmiş sirkadiyen ritimler transkripsiyon, kısa sürede ekranlı olmasıdır.

protoplast izolasyonu mutant hat bodur bir fenotip görüntüler, özellikle zahmetli olabilir. Protoplast üretilmesi için önce bildirilen yöntemlerle enzimler, hücre duvarları 26,27 ulaşmasını sağlamak için enzim solüsyonu ile şeritler infiltre ince şeritler ve vakum yaprakları veya fide kesme içerir. sonraki sindirim enzim çözeltisi içine protoplast serbest bırakmak için karanlıkta en az 3 saat inkübasyon gerektirmektedir. Vakum infiltrasyon uygulanmadığı zaman, 18 saat kadar olan kuluçka süresi tavsiye edilir. enzimlere aşılmaz epidermal hücre tabakası bant çıkarılır, çünkü burada sunulan protokolde, vakum infiltrasyon gereksizdir. bitki materyali keserek protoplast oluştururken sindirim sonra hücre duvarı enkaz ayrı protoplastlar için gereklidir; Bu, genellikle solüsyon filtre veya bir şeker degrade 27,26 üzerinde saflaştırılması yapılır. Burada, herhangi bir sindirilmemiş doku otoklav bandı sonra kalacaksindirim, protoplast filtrasyon ve şeker degrade arıtma atlanabilir böylece. Uzun süreli protoplasting prosedürlerden kaynaklanan stres, hücre canlılığı ve sirkadiyen saat etkileyen bir şans var. Burada görüntülenmiştir bant tabanlı protoplasting yöntemi 20 protoplastlar yüksek sayıda verir; ve sirkadiyen zaman serisi üzerinde hücrelerin canlılığını verildi ve protoplast ve bütün fideleri (Tablo 2) uygun süresi uzunluğu, burada açıklanan yöntem protoplast meydana getirmek için alternatif yöntemleri tercih edilir.

protokolün transfeksiyon adımı o protoplast canlılığı üzerindeki etkileri kritik bir adımdır. PEG çözeltisi hücreye taşınması için DNA, ve her iki inkübasyon süresi, bu çözelti içinde (aşama 3.4) ve deneysel olarak tespit edilmelidir PEG yüzdesinin sağlar. standart konsantrasyon dönüşüm verimliliği ve yüksek azaltarak düşük konsantrasyonlarda ile% 20 olduğucanlılığı 28 azaltılması konsantrasyonları. Beş dakika kadar kısa inkübasyon süresi protoplastlar 27 verimli transfeksiyon verim verebilir.

protoplastlar herhangi Işıklı görüntüleme platformu üzerinde görüntülenebilir. Bu videoda, biz yüksek verimli tarama ve sık ölçümler için izin verir, (~ 20 μE kombine yoğunluğu sırasıyla kırmızı ve mavi LED'ler, 630 ve 470 nm,) dış ışıkları ile donatılmış bir parlaklık plaka okuyucu kullandık. aydınlatma fotosentez için kullanılabilir gibi bir şarj çiftli aygıt (CCD) kamera etrafında dayalı alternatif plaka okuyucu veya kurulumları olarak lüminesans algılar diğer görüntüleme ekipmanları, sürece eşit şekilde uygulanabilir. kontrol edilebilen bir kabin üzerine monte edilmiş bir CCD kamerası kullanılarak bir avantajı, hafif ve sıcaklık programlanabilir. Bir dezavantaj perturb ek olarak protoplastlar için strese neden olabilir karanlığın uzun süreli dönemleri tanıtan, uzun yakalama zamanıendojen timekeeping ing. Ne olursa olsun seçilmiş deneysel hangi platformu, ayarları, fide ya da olgun bitkiler için ayarlara göre gerekli olması muhtemeldir. Bizim tecrübelerimize göre, görüntüleme tamponunda transfeksiyonu ve / veya luciferase sırasında raportör plazmid artan konsantrasyonları ilk deneylerde oluşabilecek düzensiz veya hızlı nemlendirme ritimleri çözebilir.

Gelecekteki deneylerde, burada tarif edilen yönteme göre herhangi bir mutant arabidopsis çizgisinin sirkadiyen fenotip çalışma uygulanabilir. Küçük değişiklikler yapılarak, zaman tutma gibi değişik ilaçların etkisi bu kurulum okudu olabilir. Ayrıca, transfeksiyon daha bu protokolün çok yönlülük genişleyen, 19 susturulması gen için yapay microRNA içerecek şekilde modifiye edilebilir. Pirinç protoplast oluşturmak için Protokoller 29 köklü ve burada sunulan görüntüleme protokolü eşit bizim u ilerletmek için uygulanan olabilirekonomik açıdan önemli monokot mahsul bitkilerinde saatin nderstanding.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Prof. David Somers ve Dr. Jeongsik Kim'e lusiferaz raportörü plazmidi ve ilk yöntem geliştirme çalışmaları için teşekkür ederiz. Prof. Karen Halliday, bu çalışmada kullanılan tüm sirkadiyen mutant hatlarını nazikçe sağladı. Bu araştırma, Royal Society araştırma hibeleri RS120372 ve RS140275 tarafından desteklenmiştir. GvO, Royal Society Üniversitesi Araştırma Görevlisidir (UF110173).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
SELÜLİZİN Selülaz, Trichoderma viride  Merck Millipore219466
Pektinaz R10Sigma AldrichP2401
D-mannitolSigma AldrichM4125 ve nbsp;
CaCl2Sigma AldrichC4901
KClSigma AldrichP3911
Sığır Serumu AlbüminiSigma AldrichA4503
MESAcros Organics327765000
NaClAcros Organics327300010
GlukozFischer ScientificG/0500/60
MgCl2Sigma AldrichM2670
Polietilen glikol (PEG) 4000Acros Organics434630010
Fetal Sığır Serumu Sigma AldrichF4135
D-Luciferin, FireflyBiosynth AGL-8200Luciferin tozunu 0.1 M trisfosfat tamponu pH 8.0'da 50 mM konsantrasyona kadar çözün
AmpisilinSigma AldrichA9618
Uyumlu Buhar Gösterge Bandı3M1222
Sihirli Bant3M819-1460
Petri KaplarıBilimsel Laboratuvar MalzemeleriSLS2002
Mikroplaka, 96 kuyulu, düz tabanlı, beyazGreiner Bio-One655075
TopSeal-A, 96 oyuklu plakalar için yapışkan kapaklarPerkin Elmer6050195
Şırınga, 10 ml, iğnesizBD Plastipak302188
Şırınga filtresi 0.22 ve mikro; mMerck MilliporeSLGP033RS
Biyolojik Ritim Analiz Yazılım Sistemi (PİRİNÇ)QIAfilter'da ücretsiz indirin
Maxiprep KitiQiagen12262
Modifiye Fuch-Rosenthal sayma odası, çift hücreliHawksleyAC6000
Parlak alan mikroskobuOptika MikroskoplarB-150POL-B
LB942 TriStar2 çok modlu okuyucu, lüminesans modüllüBerthold Technologies Ltd57947/57948
amillar.org

Kaynaklar

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968(2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130(2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16(2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30(2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sirkadiyen Periyot AnaliziProtoplast zolasyonuL minesans Raporlay cProtoplast TransfeksiyonuSirkadiyen Fenotip TaramasL minesans G r nt lemeSerbest Ko an PeriyotSabit I k Ko ullarBiyolojik Ritim Analizi
Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.