Yöntem makalesi

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

DOI:

10.3791/54587

⸱

23 Ekim 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeşil floresan proteini (GFP) ve türevleri yaygın protein lokalizasyonu ve hücre iskeleti yeniden ve canlı hücrelerin veziküler kaçakçılığı gibi olaylar dinamiklerini incelemek için kullanılan araçlardır. Kimerik GFP füzyonu kullanılarak niceliksel yöntemler birçok uygulama için geliştirilmiştir; Ancak, GFP, proteoliz biraz dayanıklıdır böylece floresan endositik yolunda kargo ticareti ölçümü engelleyebilir lizozom / vakuol, devam etmektedir. endositoz sonrası endositik trafik olayları ölçülmesi için alternatif bir yöntem, superecliptic pHluorin, asidik ortamlarda söndürülür GFP bir pH-duyarlı bir varyantın kullanır. multiveziküler organları (MVBs) ve lizozom / vakuol lümene sunumuna kargo dahil edildikten sonra floresan nemlendirme transmembran Yük proteinleri sonuçlar sitoplazmik kuyruk pHluorin kimerik füzyon. Bu nedenle, vakuolar floresans söndürme quantifi kolaylaştırırendositoz ve endositik yolunda erken olayların katyon. Bu çalışma, floresan mikroskobu ile endositoz miktarının pHluorin etiketli yükleri yöntemler kullanılarak, hem de akış sitometrisi kullanılarak popülasyon bazlı tahliller açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veziküler trafik ökaryotik hücrelerde organel kimliği ve işlevini muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynar ve tek tek hücre bölümlerinde protein ve zar bileşimi düzenlemek için önemli bir mekanizmadır. endositoz yoluyla üretilen keseler daha sonra geri dönüşüm veya lizozoma hedefleme için yüzeyinden zar ve proteinleri uzaklaştırmak ise plazma membranında, ekzositik veziküllerin füzyon, hücrenin yüzeyine yeni proteinler ve membranlar sağlar. Bu nedenle, endositoz besin alımı ve hücre dışı ortama yanıtları için önemlidir. Ekzositoz ve endositoz plazma zarı yüzey alanı düzenleyen ve hasarlı proteinlerin ciro izin dengelenir.

maya ve memeli hücrelerinde yapılan çalışmalar en çeşitli yanıt olarak bir endositoz katılan proteinlerin büyük sayıda, hem de belirli bir yükün içselleşmesini çerçevesinde çok endositik yollar ya da hareket belirledikvironmental koşullar. en iyi çalışılmış yol klatrin ve sitosolik yardımcı proteinleri oluşmakta endositik vezikül stabilize etmek için bir kaplama yapısına monte edildiği klatrin aracılı endositoz (STE) vardır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae yapılan deneyler dinamikleri ve birçok endositik proteinler 1-3 için işe alım düzenine temel anlayışlar vermiştir. Özellikle, CME makine yüksek evrim boyunca muhafaza edilir maya STE ile ilişkili proteinlerin çoğunluğu, insan ortologlarını olduğu; böylece, maya tomurcuklanan yüksek ökaryotlarda korunmuş olan endositoz mekanizmalarını anlamak için önemli bir araç olmuştur. Örneğin, tomurcuklanan maya kullanılarak çalışmalar ek endositik aksesuar işe ardından CME yapılarının bu oluşumunu ve olgunlaşmasını (maya olarak kortikal aktin yamalar anılacaktır) Klatrin ve kargo bağlayıcı adaptör proteinleri ile başlayan, pek çok protein sıralı akınıdır tespit proteinler,ARP2 / 3-aracılı aktin polimerizasyonu aktivasyonu ve vezikül kesme 1,2 katılan proteinlerin işe. aktin yamaları kortikal için CME makine proteinlerinin İşe çok sipariş edilen ve basmakalıp bir süreçtir ve birçok protein için işe kesin sipariş CME makine diğer bileşenleri ile ilgili olarak kurulmuştur. Daha da önemlisi, son çalışmalar memeli hücrelerinde 4 Klatrin kaplı çukurlar CME proteinler için işe benzer bir düzen doğruladı.

CME ek olarak, çok sayıda hücre tipleri, plazma zarının 5-7 vezikül oluşumu ve içselleşmesini teşvik etmek için alternatif mekanizmalar kullanan bir veya daha fazla klatrin bağımsız endositik (CIE) yollarına sahiptirler. Maya, biz son zamanlarda küçük GTPaz Rho1 ve aktive guanin nükleotid değişim faktörü (GEF), ROM1 8,9 kullanan bir CIE yolu belirledi. Rho1 aktin polimerizasyonu 1 teşvik formin Bni1 aktiveMaya 12 klatrin bağımsız endositoz bu formu için gerekli olan 0,11. Ayrıca, proteinlerin α-arrestin ailesi ubikitin ligaz Rsp5 CME 13-17 yoluyla kargo yayılmasını ve daha sonra içselleşmesini teşvik etmek ve aynı zamanda CIE 18 yer alan proteinlerle muhtemelen doğrudan etkileşim yoluyla, CIE yolu ile kargo içselleştirme teşvik işe. CIE yollarının çeşitli da Rho1 ortologunun, RhoA 9,19 kullanan klatrin bağımsız ve fagositik yollar dahil, memeli hücrelerinde mevcuttur. Memeli CIE RhoA rolü tam olarak anlaşılamamıştır; böylece, tomurcuklanan maya çalışmalar memeli CIE için geçerli olan ek mekanistik bakış açıları sağlayabilir.

endositik olayların doğru ölçümü endositoz düzenleyen spesifik proteinlerin rolleri hakkında önemli bilgiler sağlayabilir ve kargo içselleştirme veya progressio mutasyonların etkilerini ortaya çıkarabilirendositik yolu ile n. Bu amaç için, biyokimyasal yöntemler ligand alımını izlemek ve endositik kargo proteinlerin degradasyon oranları ölçmek için kullanılabilir. canlı hücrelerinde, yeşil floresan proteininin (GFP) ve ilgi kargolara türevleri füzyon kargo taşımacılığı doğrudan görselleştirme izin verir. GFP (maya veya vakuol) lizozom bozulmaya dirençli olduğu Ancak, GFP etiketli yükler endositoz miktarının sınırlı kullanıma sahiptir. Ayrıca, GFP flöresanmm, pH değişiklikleri kısmen duyarlıdır ve 20,21 lümen vakuol içerisinde tespit olmaya devam etmektedir. Sonuç olarak, GFP etiketi floresan kargo kalan bozulmuş olup, kargo yoğunluğuna tüm hücre tabanlı miktar nedeniyle vakuol uzun vadeli GFP floresan yanlış olabilir süre sonra vakuol devam etmektedir.

vakuolar GFP floresans sakıncaların üstesinden gelmek için, daha önce superecliptic pH kullandıluorin, nötr pH'ta parlak bir floresant, ancak bu 20,22,23 Lizozom vakuol / lümeni gibi asidik ortamlarda flüoresans kaybeder GFP bir pH-duyarlı varyantı. Endositik kargolar sitoplazmik kuyruk bir pHluorin etiketi yerleştirme plazma membranında ve pHluorin etiket sitoplazmaya (Şekil 1A) maruz kalır erken endozomlardan üzerinde kargoların görselleştirme izin verir. Erken endozomlar, endozomun lümenine tomurcuk veziküller içine taşıma (ESCRT) makine paketleri yüzey lokalize kargolar için gerekli endozomal ayırma kompleksleri, üreten multiveziküler cisim (MVBs) 24 olgun olarak. İç MVB veziküller içine dahil edilmiştir kargolar için, pHluorin etiket vezikül lümenine doğru dönüktür. İç MVB veziküller asitlendirilirler; Onlar MVBs 20 içine olgun olarak böylece pHluorin-etiketli kargolar erken endozomlardan üzerinde floresan kaybedersiniz. vakuol ile MVB daha sonraki füzyon MVB lümen içeriğini teslimindirgenmesi için ve pHluorin etiketler vakuol lümeninin asidik ortamda söndürüldü kalır.

Bu yazıda maya sitoplazmik pHluorin etiketleri ile kargoları kullanarak kantitatif endositik testlerin ayrıntılı açıklamalar sağlar. pHluorin etiketli yükleri sentezleyen cinsler, belirli yük özellikleri ve trafik davranışa bağlı olarak, kinetik ve / veya son nokta deneylerinde kullanılabilir. Buna ek olarak, bazı pHluorin-etiketli yüklerin akış sitometrisi içeren yüksek verimli analiz yöntemleri, elverişlidir. Önemli olarak, pHluorin etiketi, canlı hücrelerde endositik olayları incelemek endositoz ve vahşi tip ve mutant suşları endositik fonksiyonunun karşılaştırılması sayılmasına olanak tanıyan bir çok yönlü bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Çözüm ve Medya

  1. Aşağıdaki Stoklar, Medya ve Tabaklar hazırlayın:
    1. 10x YNB hazırlamak için, suyun 1 L amino asitleri eksik maya azot baz 67 g çözülür. 0.22 mikron nitroselüloz filtre ile süzme ile sterilize edin.
    2. 2 (h stokunun w / steril% 50),% dekstroz ve 1 x amino asit / besleyici karışımı (10x stok) 1x YNB kullanılarak YNB orta hazırlayın (100X'lik bir stok, Aşama 1.1.4 bakınız). gerektiği gibi plazmid seçimi için, bireysel amino asitler ya da besin ihmal. Mup1 ekspresyon indüksiyonu için, ilave olarak, amino asit / besleyici karışımından metiyonin sayın.
    3. (H stokunun w / steril% 50) (10x stok) 1x YNB kullanılarak YNB plakaları,% 2 dekstroz hazırlayın, 0.7 g / L amino asit / besleyici karışımı (adım 1.1.5) ve% 2.5 agar. ağar, 25 g su ve 860 ml başına amino asit / besin karışımı 0.7 g otoklav tarafından plaka ortamı hazırlayın. mi O karışım 100 10x YNB üzerine ilave edildi ve 40, daha sonra, 55 ° C'ye kadar soğumaya eklemesine izin verinF% 50 glükoz. , Plakalar (10 cm tabak başına ortamın yaklaşık 30 mi) dökün ortamı oda sıcaklığında katılaşmaya izin ve mağaza plakalar 4 ° C 'de.
    4. iyonu giderilmiş su, 100 ml aşağıdaki çözündürülmesiyle (sıvı ortam için) 100 x amino asit / besleyici stok çözelti hazırlayın: 0.1 g L-Metionin, 0.3 g L-lösin ve L-lizin, ve 0.2 g L-histidin, her her biri L-triptofan, adenin ve urasil (spesifik suşları için gerektiği şekilde başka amino asitler ve besin dahil edilebilir). çözünmesi için gerekirse hafif ısı kullanın ve 0.45 mikron nitroselüloz filtre ile sterilize edin. ışıktan korunarak oda sıcaklığında saklayınız. Plazmid seçimi için, gerektiği gibi, belirli bileşenlerin bulunmadığı stok çözelti hazırlayın.
    5. birleştirerek amino asit / (plakaları için) besin karışımının hazırlanması Aşağıdaki: adenin 0.5 g, L-lösin 4 g, 2 g L-histidin, L-lizin, L-metiyonin, L-triptofan, her, L- tirosin ve urasil. Bir havanda eziyet ve pro ile saklamakışıktan koruması. Plazmid seçimi için, gerektiği gibi, belirli bileşenlerin bulunmadığı karışımlarını hazırlamak ve plaka ortamında (adım 1.1.3 bakınız) her bir litresi için, amino asit karışımı ve 0.7 g kullanın.
  2. konkanavalin A (ConA) ile slayt yüzeyini kaplayarak mikroskopi için 8-iyi odasının slaytlar hazırlayın. slaytı, her sıra için, su içinde çözülmüş, 2 mg / ml ConA 25 ul ekle. Bir pipet kullanarak, kuyunun alt yüzeyi boyunca CnA yayılmış, sonra en az 4-8 saat oda sıcaklığında hava içinde kurumasına slayt sağlar. İdeal olarak, ConA kaplama 24 saat içinde odasının slaytlar kullanın.
  3. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Longtine et al merkezli entegrasyon metodu kullanılarak söz endositik kargo GFP veya pHluorin çerçeve içi füzyon maya suşları oluşturur. ve Goldstein ve McCusker 25,26.
    Not: pHluorin direnci kanamisin genleri (KANMX6) ve nourseothricin kasetler etiketleme ihtiva eden plasmidler ( NATMX4) daha önce 20 tarif edilmiştir.
    1. Genomik entegrasyon 20,25 site özel ek sekanslar ihtiva eden primerler ile seçilebilir işaretleyiciler içeren GFP ya pHluorin kasetleri yükseltin.
    2. Lityum asetat yöntemi 27 kullanarak istenen maya suşu içine çıkan PCR ürünü Transform.
    3. Uygun ilaç içeren YPD plakalar üzerinde büyüyen hücreleri tarafından kasetin entegrasyonu için seçin. tabak, otoklav 10 g maya özü, 20 g pepton, 0.1 gr triptofan ve 960 ml su içinde 25 g agar hazırlamak. Plakaları, dökme önce, karışım daha sonra kan şekeri ve KANMX6 seçimi için, 200 ug / ml bir son konsantrasyona kadar G418 ya da ya da nourseothricin 100 ug / ml'lik bir son konsantrasyon için, 40 ml% 50 eklemek 55 ° C'ye kadar soğuması NATMX4 seçimi.
    4. PCR ile tek tek koloniler GFP ya pHluorin etiketinin entegrasyonu teyit ve / veya anti-GFP antikorları kullanılarak Western lekeleme,yanı sıra floresan mikroskobu 20 tarafından etiketlenen proteinin tespiti ile.
      Not: Belirli maya kökleri ve bu çalışmada kullanılan plazmidler, sırasıyla Tablolar 1 ve 2'de sıralanmıştır.

Konstitütif İçselleştirilmiş Endositik Cargo kararlı durum Floresans 2. Endpoint Testi

  1. (Varsa) plazmid bakımı için gerekli olan amino asitler ya da besin eksik YNB ortamın 5 ml hücreler (~ 3 küçük koloni) inoküle. 250 rpm çalkalanarak, 30 ° C'de yörüngesel çalkalamalı bir enkübatörde 16-24 saat boyunca hücrelerin büyütün. Alternatif olarak, amino asitler ya da plazmid seçimi için besin eksik YNB plaka üzerine hücre çizgi bir p, 1-2 mm kolonisi ile 30 ° C 'de bir gece boyunca hücreler büyür.
  2. Bir spektrofotometre kullanılarak, her bir gece boyunca kültür yoğunluk (OD 600) ölçülür. Pla için amino asitleri veya besin eksik YNB ortamında 0,35-0,4 OD 600 / ml 5 ml seyreltme hazırlayınSmid bakımı ve çalkalanarak 30 ° C'de yaklaşık 3 saat büyür. kullanarak hücrelerin bir tabakta çizgili, bu adımı atlayın ve adım 2.4 (aşağıya bakınız) ile devam edin.
  3. Şimdi 0,6-1,0 OD 600 / ml arasında olmalıdır hücrelerin yoğunluk (OD 600), ölçün. 2 dakika boyunca 8.000 rpm'de (6,800 xg) 1.5 kadar bir mikrofüj tüpüne kültür ml ve pelet hücreleri aktarın. süpernatant 1475 ul çıkarın.
  4. bir floresan mikroskobu hücreleri getirin. Her bir örnek görüntüleme önce, geri kalan ortam içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla, bir slayt hazırlayın ve bir kapak slip altında hücre süspansiyonu 3 ul monte edin. Plazmid seçimi için uygun bir şekilde YNB ortamı kullanılarak, protokol 3'te aşağıda tarif edildiği gibi alternatif olarak, 8 oyuklu odası preparatların hazırlanması. İdeal olarak, bir 100X, 1.4 veya daha yüksek sayısal açıklık (NA) yağ daldırma objektif lens, 12 veya 16-bit kamera ve uyarma / emisyon filtreleri ile görüntü hücreleri GFP floresan için optimize edilmiş.
    NOT: kullanan hücreler o çizgiler büyüdüğü takdirdena plaka, bir kapak kayma taze YNB orta 3 ul koyarak slayt hazırlamak. Bir pipet kullanarak, plakadan hücrelerin küçük koloni toplama YNB ortama hücreleri dağıtmak ve görüntüleme hemen önce bir cam lam üzerine elde edilen süspansiyon monte edin.
  5. Görüntü bir deney içindeki tüm görüntüler için aynı satın alma parametreleri (örneğin, filtre setleri ve maruz kalma süresi) ile her bir durum için hücrelerin 4-6 rastgele alanlar.
    NOT: her alan için bir aydınlık ya da DIC görüntü Toplama pHluorin sinyali MVB ve vakuoler bölümlerinde söndürülür hücreleri için yararlı olabilir.
  6. her bir durum için, en az 30-50 hücrelerin floresans yoğunluğunu ölçülmesi (protokol 5).

Ayarlı endositoza uğrayabilmektedir kargoların endositozun Niceleme 3. Kinetik Testi

  1. metionin yoksun YNB ortamın 5 ml maya hücreleri (koloni başına çap olarak yaklaşık 2 mm) 2-3 koloniler inoküle ekleyinPlazmid seçimi muhafaza etmek için itional amino asitler ya da besin. çalkalanarak 30 ° C'de 16-24 saat boyunca kültürler büyütün.
    NOT: Bu yazıda, düzenlenmiş endositik kargo proteinleri çalışmak için protokoller metiyonin permease, Mup1 kullanımı yapacak. düzenlenmiş endositoza uğrayabilmektedir diğer yükler de pHluorin ile etiketleme için uygundur (örneğin, urasil yokluğunda plazma membranında birikir ve Fur4 permeaz urasil, harici urasil uygulanan tepki olarak içselleştiren); Bu kargolar için, medya koşulların bu yükler için özel anlatım, indüksiyon ve içselleştirme koşullarını yansıtacak şekilde modifiye edilmelidir.
  2. Yaklaşık 3 saat görüntüleme önce her gecede kültür yoğunluk (OD 600) ölçün. Plazmid bakım metiyonin ve ilave amino asitler ya da besin eksik YNB ortamında 0,35-0,4 OD 600 / ml'de 5 ml'lik bir seyreltme hazırlayın ve çalkalanarak 30 ° C'de büyütülmüştür.
  3. Mikrolara önceden dengeyeAdım 3.2 3 saat inkübasyon sırasında 30 ° C çevre odasını veya ısıtmalı sahne (varsa) baş.
  4. Transferi 2 dakika boyunca 8.000 rpm'de (6,800 xg) 1 kadar bir mikrofüj tüpüne hücre kültürünün mi, ve pelet hücreleri. süpernatan 975 ul çıkarın.
  5. görüntüleme (protokol 1.2) için bir ConA ile tedavi edilen, 8-iyi cam tabanlı bölme slayt hazırlayın.
  6. her bir plazmid seçimi için metiyonin ve ilave amino asitler ya da besin eksik YNB ortamı 200 ul ekle. Kalan süpernatant adım 3.4 den hücre pelletini ve her bir merkezi haline hücre süspansiyonu 2.5 ul bırakın. aşağı yukarı pipetleme kuyu yüzeyinde hücreleri dağıtmak ve hücreler 5-10 dakika yerleşmek için izin verir.
  7. 30 ° C (adım 3.3) dengelenmiş bir ters floresan mikroskop odası slayt yerleştirin. aydınlık aydınlatma kullanarak hücrelerin bir alan bulun.
  8. 100 ug / ml metionin ihtiva eden YNB ortamı 50 ul ekle20 ug / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek için metionin kuyudaki ortam 200 ul (30 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış). alt yüzer hücreler önlemek amacıyla kuyudaki ortam bozmamak.
  9. Hücreler görüntüleme başlamadan önce 2 dakika süreyle dengelenmeye bırakın. Hemen ilk fotoğraf çekiminden önce, istenen odak düzlemine mikroskop ayarlamak (genellikle, bir ekvatoral odak düzlemi en iyi şekilde çalışır).
  10. GFP filtre kullanarak (örneğin bir zaman serisi içindeki tüm görüntüler için, 100X 1.4 NA immersiyon yağı hedefi ve 500 msn edinme zamanı aynı edinme parametreleri kullanılarak, 45-60 dakika süreyle 100 5 dakika aralıklarla GFP ve aydınlık (veya DIC) görüntüler elde msn alma süresi DIC filtre kullanarak).
    NOT: mikroskop sahne ve görüntüleme yazılımı odak düzlemi sürüklenme otomatik olarak düzeltilmesi için izin vermezseniz, elle her bir görüntüleme zaman noktası öncesinde odağı yeniden ayarlanması gerekebilir. Ayrıca, satın alma süreleri olacaknedeniyle aydınlatma ve filtreler farklılıklara mikroskoplar arasında değişir ve en iyi şartlar deney başlamadan önce manuel olarak belirlenmelidir. Mup1 dışında bir endositik kargo kullanılırsa, yükün içselleştirme kinetiklerini yansıtmak için, elde etme süresi ve görüntüleme aralıkları, hem de deney süresini değiştirmek için gerekli olabilir.
  11. Her bir zaman noktasında tek tek hücrelerin floresans yoğunluğunu ölçülmesi (protokol 5) ve birinci görüntünün ilk yoğunluğu yüzdesi olarak değerleri ifade eder.

Ayarlı endositoz GeçecekANKARA Endositik Cargos Niceleme 4. Endpoint Testi

  1. protokol 3'te tarif edildiği gibi görüntüleme için hücrelerin hazırlanması (3.6 ile 3.1 adım).
  2. Görüntü hemen aydınlık ve GFP filtre setleri kullanılarak, metionin eklemeden önce her bir durum için hücrelerin 4-5 rastgele alanlar.
  3. 100 ug / ml metionin ihtiva eden YNB ortamı 50 ul ekle (savaş öncesikuyudaki ortam 200 ul), 30 ° C'ye kadar Med 20 ug / ml'lik bir son konsantrasyon elde etmek için metionin. alt yüzer hücreler önlemek amacıyla kuyudaki ortam bozmamak.
  4. 0 dakika zaman noktası (aşama 4.2) aynı edinim koşulları kullanıldığında metiyonin ilave edildikten sonra hücreler resmi 4-5 rastgele alanları 30 dakika.
  5. Her bir zaman noktası için, en az 30-50 hücrelerin floresans yoğunluğunu ölçülmesi (protokol 5). formülü kullanarak 30 dakika sonra içselleştirilmiş Mup1-pHluorin yüzdesi olarak ifade değerler: - x% 100 [0 dak ortalama yoğunluğu] / [30 dk yoğunluğunu ortalama 0 dk yoğunluğunu ortalama].
    NOT:. Aynı anda her testin başlangıç zamanını şaşırtıcı sekiz uç noktaları deneyleri kadar gerçekleştirmek mümkündür Tablo 3 sekiz eşzamanlı deneyleri için örnek iş akışı sağlar.

5. Post-satın alma Analizi

  1. 1 olarak satın alma yazılımı ihracat görüntüleri6-bit etiketli görüntü dosyası biçimi (.tif veya .tiff formatında).
    Not: Diğer dosya formatları da uygun olabilir ve ideal kayıpsız sıkıştırma algoritmaları kullanmak gerekir. 8-bit görüntüler, genel olarak ölçümü için uygun değildir.
  2. varsa ( 'Dosya' menüsünden 'Aç' seçeneği serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı (kullanarak açık dosyaları. ölçümü için floresan görüntü kullanın ve bir referans olarak aydınlık / DIC görüntü hücrelerinin yerini belirlemek ve ölü hücreleri hariç ), DIC tarafından görüntülenen ve GFP uyarma / emisyon filtreleri ile bakıldığında autofluorescent olan canlı hücreler daha koyu görünür hangi.
  3. floresan görüntü bir arka plan çıkarma gerçekleştirin. dengesiz bir arka plan sinyali ile görüntüler için, 'İşlem menüsünden' bulundu 'Arka Plan Çıkarma' algoritmasını kullanır. Miktar belirleme amaçları için genellikle yeterli olmaktadır varsayılan ayarı (50 piksel top yarıçapı haddeleme) kullanın.
    Not: Alternatif bir backgroüniforma arka plan ile görüntüler için und çıkarma yöntemi adım 5.3.1.-5.3.2 anlatılmıştır; Bununla birlikte, yukarıdaki yöntem, homojen bir arka plan için de kullanılabilir.
    1. Üniforma kökenli görüntülerde (yani, arka plan yoğunluğu tüm kenarlarda ve görüntünün merkezine yaklaşık sabittir), manuel arka plan çıkarma işlemleri. Ana ImageJ penceresinde bulunan 'serbest Seçmeler' butonuna tıklayın, ve hücreleri içermeyen görüntü içinde 3-5 rastgele bölgeleri seçin.
    2. 'Analiz' menüsünde bulunan 'Set Ölçümler' işlevini açın 'Mean Gray Değer' parametreyi seçin ve (aynı zamanda 'Analiz' menüsünde bulunur) 'Tedbir' fonksiyonunu kullanarak yoğunluk değerlerini ölçmek. 3-5 ölçülen bölgelerden ortalama değerini hesaplayın ve bu görüntüdeki sonraki tüm ölçümlerden çıkarılır.
  4. Kinetik deneyler ölçümü için (protokol 3), Tim için tek bir yığın görüntü oluşturmakE serisi. kronolojik sırayla her zaman noktasından floresan görüntüleri açın ve (Yığınlar alt menüsü altındaki 'Resim' menüsünde bulunan,) işlevini 'Stack Görüntüler' kullanarak bir yığın oluşturur.
  5. mümkün olduğunca hücre dışında tüm hücre ama küçük alanı da kapsayacak şekilde emin, serbest seçim aracını kullanarak bir hücreyi Anahat.
  6. Aşağıdaki parametreleri ölçün: 'Alan, Entegre Yoğunluk' ve 'Mean Gri Değeri'. 'Analiz' menüsünde bulunan 'Set Ölçümler' fonksiyonunu kullanarak seçiniz parametreleri.
    NOT: Entegre Yoğunluk seçilmiş bölge içindeki tüm piksel yoğunluğunun toplamına karşılık gelir ve ortalama Gri Değer hücre boyutu yoğunluk değerlerini düzeltir [Entegre Yoğunluk / Alan], karşılık gelir.
  7. 'Araçlar' alt menüsü altındaki 'Analiz' menüsünde bulunan YG Yöneticisi 'açın. ROI Manager penceresinde vurgulanır regio girmek için 'Ekle' butonuna tıklayınn faiz (ROI) yeni bir bölge olarak.
  8. Tekrarlayın görüntüde kalan hücreler için 5.6 ile 5.4 arasındaki adımları. Ve görüntünün kenarına dokunacak herhangi bir hücre; aydınlık / DIC ve floresan (Şekil 2F bkz ölü hücreler DIC görüntülerde koyu görünür ve GFP uyarma / emisyon ile inceledi autofluorescent sitoplazmik sinyal var) tarafından değerlendirilen herhangi bir ölü hücreleri hariç. YG Yöneticisi 'penceresinde' Diğer 'düğmesini tıklayarak .zip dosyası olarak seçilen ROI'ları kaydedin ve bir elektronik tablo veya istatistiksel analiz yazılımı tüm ölçümleri ihracat.
  9. Kinetik tahliller miktarının (protokol 3) için, anahat ve adımları 5.4 ve 5.5 açıklandığı gibi ilk zaman noktasından bir hücreyi ölçün. Deneyde sonraki tüm zaman noktalarında ölçülmesi için aynı ROI kullanın.
  10. Son nokta tahlilleri (protokolleri 2 ve 4), her bir durum için 30-50 hücre ölçüldüğünde en az. En az 2-3 görüntüler için ölçümü gerçekleştirin ve her tüm hücreleri dahilanalizinde adım 5.8 belirtilen kriterlere uygun görüntüsü.
  11. Post hoc analiz için Tukey çoklu karşılaştırma testi ile takip tek yönlü ANOVA kullanılarak numuneler arasındaki istatistiksel anlamlılık değerlendirin.

Akış Sitometrisi ile Mup1-pHluorin endositozun 6. Nüfus Analizi

  1. metionin ve plazmid seçimi muhafaza etmek için ilave amino asitler ya da besin eksik YNB 0.5 ml ortamda maya hücrelerinin (koloni başına çap olarak yaklaşık 2 mm) 2-3 koloniler inoküle. bir silindir tamburu üzerinde, 30 ° C'de 16-24 saat boyunca 5 ml yuvarlak tabanlı tüplerde hücreleri büyütün.
  2. Plazmid bakım metiyonin ve ilave amino asitler ya da besin eksik YNB ortamın 1.5 ml ilave edilir, ve bir silindir tambur üzerinde, fazladan bir 3 saat boyunca 30 ° C'de büyütülmüştür.
  3. Aktarım iki adet 5 ml'lik yuvarlak dipli tübe hücre 1 mi. İlk tüp (Met koşul) için YNB Met orta 0.25 ml ekleyin ve YNB ortamı 0.25 ml 100 ug içeren/ Ml ikinci tüpe metionin 20 ug / ml (+ Met durum) bir son metionin konsantrasyonu elde edildi. bir silindir tamburu üzerine, 45 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe hücreleri.
  4. Yük içselleştirme bir ölçüsü olarak, floresanlı bir izotiyosiyanat (FITC) filtresi bir hücre boyutu ölçümü ve Mup1-pHluorin floresan yoğunluğu olarak ortaya dağılım (FS) seçerek, akış sitometrisi ile analiz hücreleri.
  5. Kullanılan maya hücrelerinin boyut aralığı ve floresan yoğunluğu için algılama optimize etmek için FS ve FITC kanallarının voltajını ayarlamak için kaydırıcı düğmelerini kullanın (Bu deneyler için kullanılan ayarlar FS 50 V ve FITC için 400 V idi).
    Not: her iki kanal için gerilim kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişecektir. Bu adım, daha önce ya da metionin (adım 6.3) ile 45 dakika işlemi sırasında yapılmalıdır.
  6. yüksek akış hızı ayarı kullanarak, her bir durumda 10.000 hücreleri için FS ve floresan yoğunluğu ölçmek. fluo karşı FS bir dağılım grafiği oluşturmakyoğunluğu rescence: 'grafiği eklemek tıklayın FITC (x-ekseni) ve FS (y-ekseni) seçin ve grafik 1.000 puan (yazılım 10,000 hücre ölçüldü olsa bile, 1000 hücreleri değerlerini gösterecektir).
    NOT: maksimal tutarlılık için, hücreler metiyonin ilave edildikten sonra 45-50 dakika analiz; örneklerin çok sayıda içeren deneyler için, akış sitometri analizi için gerekli zamanı karşılamak için metionin ilave yalpalayarak.
  7. Bir kontrol olarak, vahşi tip (WT) hücreler için Met ile + Met koşulları içerir. kapı fonksiyonunu kullanarak, parlak hücrelerin yaklaşık% 5'i kapısının sağında düşmek öyle ki, WT + Met koşulunu kullanarak dikey bir kapı atayın. deneyde tüm diğer koşullar için bu yolluk kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal içselleştirilmiş endositik kargo protein ste3 kararlı hal lokalizasyonu ve miktar

canlı hücreler, ste3, maya a-faktör feromon alıcısının sitoplazmik bir C-terminal kuyruğu kimerik GFP ve pHluorin füzyonları lokalizasyonunda pHluorin-etiketli yükler endositoz ölçümü için kullanılabileceğini göstermek için, karşılaştırıldı. Ste3 kurucu bozulması 28 için vaküole, plazma zarına taşınmaktadır içs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya hücrelerinde endositik olaylar miktarının pHluorin uygulamaları floresan etiketi proteini (Şekil 1A) sitoplazmik kuyruğuna kaynaşık olduğu transmembran yüklerinin kullanır. pHluorin etiketi nötr ortamlara maruz kalan, ama pHluorin etiketi asidik koşullar karşılaştığında söndürülür haline olduğunda burada tarif edilen deneyler için, kargolar parlak floresan vardır. Böylece, pHluorin-etiketli endositik kargo kolayca plazma zarının sitoplazmik yüzüne ve erken endozomlardan tespit edilirse, ancak lümen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada reaktifler üretmek için kullanılan pHluorin cDNA'sını paylaştıkları için Gero Miesenböck ve Tim Ryan'a, mükemmel teknik yardım için Nathan Wright, Joanna Poprawski ve Lydia Nyasae'ye, yararlı tartışmalar için Wendland laboratuvarı üyelerine ve mikroskopi ve akış sitometrisi konusunda tavsiye ve yardım için Entegre Görüntüleme Merkezi'nden (Johns Hopkins) Michael McCaffery ve Erin Pryce'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (BW, GM60979'ye) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (BW, MCB 1024818'ye) hibelerle desteklenmiştir. K.W. kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (T32-GM007231) bir eğitim bursu ile desteklenmiştir. AFO, Duquesne Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü ve Ulusal Bilim Vakfı KARİYER hibe 553143'nden gelen geliştirme fonları tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AdeninSigmaA8626-25GAmino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
Bacto-agarFisherBP1423-2Plaka ortamının hazırlanması için kullanın
BD Difco Maya Azot Baz (amino asitler olmadan)BD291920Sıvı ve plaka ortamlarının hazırlanması için kullanın
Concanavalin ASigmaC5275-5MGOdanın kaplanması için kullanın slaytlar
DekstrozFisherBP350-1Sıvı ve plaka ortamının hazırlanması için kullanın
L-HistidinFisherBP382-100Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
L-LösinAcros125121000Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
L-LizinFisherBP386-100Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
L-MetioninFisherBP388-100Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
L-TriptofanFisherBP395-100Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
L-TirozinAcros140641000Amino asit karışımının hazırlanması için kullanın
Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı ( 8 kuyulu)Thermo Scientific155411Mup1-pHluorin içselleştirmesinin kinetik ve uç nokta testleri için kullanın
UrasilSigmaU0750-100GAmino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın
Axiovert 200 ters mikroskopCarl ZeissÖzel Yapı
100X/1.4 Plan-Apochromat Yağa Daldırma Objektif LensiCarl ZeissObjektif 100X olmalıdır, 1.4NA veya daha yüksek
SensicamCooke CorporationKamera 12 bit veya daha yüksek dinamik aralığa sahip olmalıdır
X-Cite 120PC Q Aydınlatma KaynağıExcelitas Technologies
Slidebook 5 yazılımıAkıllı Görüntüleme Yenilikleri
ImageJ yazılımıUlusal SağlıkEnstitüleri http://imagej.nih.gov/ij/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

pHluorinEndocytosisFluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

İlgili makaleler