Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları
Bu makalede
Özet
Özet
Yeşil floresan proteini (GFP) ve türevleri yaygın protein lokalizasyonu ve hücre iskeleti yeniden ve canlı hücrelerin veziküler kaçakçılığı gibi olaylar dinamiklerini incelemek için kullanılan araçlardır. Kimerik GFP füzyonu kullanılarak niceliksel yöntemler birçok uygulama için geliştirilmiştir; Ancak, GFP, proteoliz biraz dayanıklıdır böylece floresan endositik yolunda kargo ticareti ölçümü engelleyebilir lizozom / vakuol, devam etmektedir. endositoz sonrası endositik trafik olayları ölçülmesi için alternatif bir yöntem, superecliptic pHluorin, asidik ortamlarda söndürülür GFP bir pH-duyarlı bir varyantın kullanır. multiveziküler organları (MVBs) ve lizozom / vakuol lümene sunumuna kargo dahil edildikten sonra floresan nemlendirme transmembran Yük proteinleri sonuçlar sitoplazmik kuyruk pHluorin kimerik füzyon. Bu nedenle, vakuolar floresans söndürme quantifi kolaylaştırırendositoz ve endositik yolunda erken olayların katyon. Bu çalışma, floresan mikroskobu ile endositoz miktarının pHluorin etiketli yükleri yöntemler kullanılarak, hem de akış sitometrisi kullanılarak popülasyon bazlı tahliller açıklanmaktadır.
Giriş
Veziküler trafik ökaryotik hücrelerde organel kimliği ve işlevini muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynar ve tek tek hücre bölümlerinde protein ve zar bileşimi düzenlemek için önemli bir mekanizmadır. endositoz yoluyla üretilen keseler daha sonra geri dönüşüm veya lizozoma hedefleme için yüzeyinden zar ve proteinleri uzaklaştırmak ise plazma membranında, ekzositik veziküllerin füzyon, hücrenin yüzeyine yeni proteinler ve membranlar sağlar. Bu nedenle, endositoz besin alımı ve hücre dışı ortama yanıtları için önemlidir. Ekzositoz ve endositoz plazma zarı yüzey alanı düzenleyen ve hasarlı proteinlerin ciro izin dengelenir.
maya ve memeli ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Çözüm ve Medya
- Aşağıdaki Stoklar, Medya ve Tabaklar hazırlayın:
- 10x YNB hazırlamak için, suyun 1 L amino asitleri eksik maya azot baz 67 g çözülür. 0.22 mikron nitroselüloz filtre ile süzme ile sterilize edin.
- 2 (h stokunun w / steril% 50),% dekstroz ve 1 x amino asit / besleyici karışımı (10x stok) 1x YNB kullanılarak YNB orta hazırlayın (100X'lik bir stok, Aşama 1.1.4 bakınız). gerektiği gibi plazmid seçimi için, bireysel amino asitler ya da besin ihmal. Mup1 ekspresyon indüksiyonu için, ilave olarak, amino asit / besleyici karışımından metiyonin sayın.
- (H stokunun w / steril% 50) (10x stok) 1x YNB kullanılarak YNB pla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yapısal içselleştirilmiş endositik kargo protein ste3 kararlı hal lokalizasyonu ve miktar
canlı hücreler, ste3, maya a-faktör feromon alıcısının sitoplazmik bir C-terminal kuyruğu kimerik GFP ve pHluorin füzyonları lokalizasyonunda pHluorin-etiketli yükler endositoz ölçümü için kullanılabileceğini göstermek için, karşılaştırıldı. Ste3 kurucu bozulması 28 için vaküole, plazma zarına taşınmaktadır içs.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Maya hücrelerinde endositik olaylar miktarının pHluorin uygulamaları floresan etiketi proteini (Şekil 1A) sitoplazmik kuyruğuna kaynaşık olduğu transmembran yüklerinin kullanır. pHluorin etiketi nötr ortamlara maruz kalan, ama pHluorin etiketi asidik koşullar karşılaştığında söndürülür haline olduğunda burada tarif edilen deneyler için, kargolar parlak floresan vardır. Böylece, pHluorin-etiketli endositik kargo kolayca plazma zarının sitoplazmik yüzüne ve erken endozomlardan tespit edilirse, ancak lümen.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışmada reaktifler üretmek için kullanılan pHluorin cDNA'sını paylaştıkları için Gero Miesenböck ve Tim Ryan'a, mükemmel teknik yardım için Nathan Wright, Joanna Poprawski ve Lydia Nyasae'ye, yararlı tartışmalar için Wendland laboratuvarı üyelerine ve mikroskopi ve akış sitometrisi konusunda tavsiye ve yardım için Entegre Görüntüleme Merkezi'nden (Johns Hopkins) Michael McCaffery ve Erin Pryce'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (BW, GM60979'ye) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (BW, MCB 1024818'ye) hibelerle desteklenmiştir. K.W. kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (T32-GM007231) bir eğitim bursu ile desteklenmiştir. AFO, Duquesne Üniversite....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Adenin | Sigma | A8626-25G | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Plaka ortamının hazırlanması için kullanın |
| BD Difco Maya Azot Baz (amino asitler olmadan) | BD | 291920 | Sıvı ve plaka ortamlarının hazırlanması için kullanın |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Odanın kaplanması için kullanın slaytlar |
| Dekstroz | Fisher | BP350-1 | Sıvı ve plaka ortamının hazırlanması için kullanın |
| L-Histidin | Fisher | BP382-100 | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| L-Lösin | Acros | 125121000 | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| L-Lizin | Fisher | BP386-100 | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| L-Metionin | Fisher | BP388-100 | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| L-Triptofan | Fisher | BP395-100 | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| L-Tirozin | Acros | 140641000 | Amino asit karışımının hazırlanması için kullanın |
| Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı ( 8 kuyulu) | Thermo Scientific | 155411 | Mup1-pHluorin içselleştirmesinin kinetik ve uç nokta testleri için kullanın |
| Urasil | Sigma | U0750-100G | Amino asit karışımı ve stok çözeltisinin hazırlanması için kullanın |
| Axiovert 200 ters mikroskop | Carl Zeiss | Özel Yapı | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Yağa Daldırma Objektif Lensi | Carl Zeiss | Objektif 100X olmalıdır, 1.4NA veya daha yüksek | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Kamera 12 bit veya daha yüksek dinamik aralığa sahip olmalıdır | |
| X-Cite 120PC Q Aydınlatma Kaynağı | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 yazılımı | Akıllı Görüntüleme Yenilikleri | ||
| ImageJ yazılımı | Ulusal Sağlık | Enstitüleri http://imagej.nih.gov/ij/ |
Kaynaklar
- Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
