Yöntem makalesi

Nükleik Asitlerin bir Polyaniline tabanlı sensör

DOI:

10.3791/54590

⸱

1 Kasım 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleik asitler, biyolojik sistemleri değerlendirmek için yaygın analitlerdir; ancak, enzimatik manipülasyondan kaynaklanan yanlılık endişeye neden olabilir. Burada, polianilin kullanılarak nükleik asitlerin etiketsiz tespiti için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hassas, uygun maliyetli sensör teknolojisi, moleküller arasındaki tek nükleotid farklılıklarını ayırt edebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleik asitlerin tespiti, araştırma ve klinikte kullanılan tanı teknolojilerinin merkezinde yer alır. Bu teknolojilerde kullanılan standart yaklaşımlar, önyargı ve artefaktlara neden olabilen enzimatik modifikasyona dayanır. Yeni nesil algılama platformlarının kritik bir unsuru, doğrudan moleküler algılama olacak ve böylece amplifikasyon veya etiketleme ihtiyacını ortadan kaldıracaktır. Gelişmiş nanomalzemeler, etiketsiz sensörleri gerçekleştirmek için uygun kimyasal modaliteleri sağlayabilir. Konjuge polimerler, biyolojik algılama için idealdir, biyomoleküllerle uyumlu özelliklere sahiptir ve lokalize çevresel değişikliklere karşı yüksek hassasiyet gösterir. Bu makalede, elektroiletken polimer polianilin kullanılarak nükleik asitleri tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Hedef nükleik asitleri tamamlayan basit DNA "probu" oligonükleotidleri, polimere elektrostatik olarak bağlanır ve hedef moleküllerdeki tek nükleotid farklılıklarını ayırt edebilen bir sensör sistemi oluşturur. Bu teknolojinin spesifik ve tarafsız doğasının dışında, oldukça uygun maliyetlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konjuge polimerler, moleküler sensörler için birçok seçenek sunar. Buna floresan, elektronik ve kolorimetrik yanıtlardahildir 1. Konjuge polimerleri nükleik asit sensörlerine dahil etmek için birçok çaba sarf edilmiştir. Bununla birlikte, çoğu sistem, algılama seçeneklerini sınırlayan ikincil algılama gerektirir2. Son zamanlarda, bu polimerin özelliklerinden yararlanan ve etiketsiz bir sistem oluşturan polianilin (PANI) üzerine inşa edilmiş konjuge polimer bazlı bir sensör platformu bildirdik3. PANI, biyolojik sistemlerin ölçülmesi için uygun olan floresan ve direnç gibi özelliklere sahip, yaygın olarak konjuge edilmiş bir elektro-aktif polimerdir4. Yapı içindeki eksitonlar lokalize değildir, bu da monomerik alt birimler arasındaki pozitif yükün hareketliliğine yol açar. Bu, DNA5,6'nın negatif yüklü omurgası ile etkileşime girebilen esnek bir pozitif yük iskelesi sağlar. Daha da önemlisi, elektrostatik olarak bağlı DNA, azotlu bazların baz eşleşmesine katılabileceği şekilde yönlendirilir. DNA ile ilişki, UV ışınlaması ile geliştirilebilen bir etki olan PANI'nin elektronik özelliklerini değiştirir (Şekil 1)3. Bu sistem kullanılarak, hedef nükleik asitleri tamamlayan oligonükleotidler PANI üzerinde immobilize edilebilir. Birden fazla çalışma, hibridizasyon üzerine, elektrostatik olarak adsorbe edilen oligonükleotidlerin, çift sarmallı bir DNA yapısına geçişin neden olduğu konformasyonel değişiklikler nedeniyle PANI veya diğer katyonik matrislerden ayrıştığını göstermiştir3,5,7.

Prob ekinin konjuge polimer özelliklerini modüle ettiği bir sensör sisteminde, hibridizasyon olayları, probların veya hedef nükleik asitlerin etiketleri veya enzimatik modifikasyonu olmadan dönüştürülebilir. Konjuge polimerler, biri floresan olan tespit yöntemlerinde büyük esneklik sunar. PANI floresansının izlenmesi yoluyla, 10-11 M (10 pM) kadar düşük hedef nükleik asit konsantrasyonları tespit edilebilir3. Tespit hızlıdır, hibridizasyondan sonraki 15 dakika içinde meydana gelir ve bir hedef moleküldeki tek bir uyumsuzluğun ayırt edilebildiği durumlarda spesifiktir3.

PANI sensörlerinin üretimi basittir. Anilin monomeri, yüzey aktif madde ve kontrollü bir oksidan ilavesini içeren standart sentez prosedürleri kullanılarak suda iyi dağılmış yüksek moleküler ağırlıklı PANI üretilebilir. Verim çok yüksek olabilir ve reaksiyona girmemiş oksidan su ile yıkanarak uzaklaştırılabilir, bu da daha fazla PANI büyümesi olmamasını sağlar. PANI-prob ilişkisi, karışım üzerine kendiliğinden meydana gelir ve hafif UV maruziyeti ile kompleks oluşumu artar. Hibridizasyon hemen gerçekleştirilebilir ve PANI floresansındaki değişiklikler kısa bir inkübasyonun ardından test edilebilir. Bu teknolojinin basitliği, birçok laboratuvar için son derece erişilebilir olmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İşlenebilir PANI Sentezi

  1. 250 mL'lik yuvarlak dipli bir şişede kloroform, 60 ml tamamen (1 mi, 11 mmol) anilin içinde çözülür. 600, 5 dakika boyunca rpm'de ve buz ile 0-5 ° C'ye soğutun karıştırın. Bu, genellikle 15-20 dakika (Şekil 2A) alır.
  2. 600 rpm'de karıştırılırken, yuvarlak dipli bir reaksiyon kabına, anilin çözeltisine, sodyum dodesil benzen sülfonat (NaDBS) (7.44 gr, 21 mmol) ekleyin.
  3. 20 ml su içindeki amonyum persülfat (APS) (3.072 gr, 13.5 mmol) çözündürülür ve tüm damla damla 30 dakika boyunca reaksiyon aşırı ısınmasını önlemek için ekleyin.
  4. 24 saat süre ile 0-5 ° C'de reaksiyonun yürütülmesi ve başka bir 24 saat süre ile oda sıcaklığına ulaşmasına izin verir.
  5. Reaksiyon karışımı başlangıçta 15 dakika sonra süt beyazı edecek dikkat, 2 saat sonra, ve son olarak da 24 saat (Şekil 2B-F) sonra, koyu yeşil, sonra koyu kahverengi.
  6. Buchner hunisi ile PANI-NaDBS çözelti filtre. olarak 80 ml kloroform ve 120 ml su ile karıştırılırAyırma hunisi (Şekil 2G).
  7. Sulu süpernatan içinde reaksiyona girmemiş NaDBS ve APS bırakarak, oda sıcaklığında 24 saat boyunca çözelti inkübe ve ayırma hunisinden koyu yeşil Pani toplar.

2. PANI-prob Karıştırma ve UV Işınlama

  1. kloroform-su ile PANI çözeltisi 10x seyreltilir (1: 3 h / h) ile bir mikrofüj tüpü içinde, 15 dakika boyunca hafif sallanan probun DNA oligonükleotitleri 6.4 umol ile seyreltildi PANI 200 ul karıştırın.
  2. 2 dakika boyunca, bir çapraz bağlayıcı UV 1200 μJ / cm2 olan PANI-DNA eriyiği ışın tedavisi. UV maruziyeti belirtilen tutarla sınırlı olduğu önemlidir. UV uzun süre maruz Bayan ve DNA kovalent çapraz bağlanma nedeniyle olası Pani floresans değişikliği ödün.
  3. 6 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüj ile pelet kompleksleri ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanır. Yine pelet ve PBS içinde yeniden askıya.

3. HPani-prob ybridization

  1. Pani-prob komplekslerinin 200 ul nükleik asitleri 100 uM tamamlayıcı DNA oligonükleotidleri 8 ul ekle hedefler.
  2. 40 ° C'de 15 dakika boyunca çözelti karışımı sallanmasıyla hibridizasyon gerçekleştirmek ° C.
  3. 6 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüj ile PANI kompleksleri Pelet. PBS ile yıkayın ve su yeniden askıya.

4. Emisyon Kararlı Hal Floresan Ölçüm

  1. 250 nm'de eksitasyon ile 96 oyuklu mikro-, farklı tedaviler Pani ekleyin ve 270-850 nm aralığında emisyon floresan ölçer. Pani bir emisyon tepe 500 nm civarında gözlenmelidir.

Melezleştirilmiş Dubleks 5. Floresan Mikroskopi Ölçümü

  1. 48 saat süre ile, 40 ° C'de bir borosilikat cam lamel üzerine kuru kaplama Pani bırakın.
  2. Kurutulmuş PANI film üzerine prob (100 uM 8 ul) ilave edin ve UV ışığı (1.200 μJ / cm2 ile ışın ) 2 dakika karıştırıldı.
  3. 48 saat süre ile, 40 ° C'de PANI-prob PBS ile film ve kuru yıkayın.
  4. Hedef nükleik asitleri ilave edilerek 15 dakika boyunca hibridizasyon gerçekleştirmek. Bu, bir biyolojik numune veya bir kontrol hedef oligonükleotit (100 uM 8 ul) olabilir. PBS yıkama izleyin.
  5. 500 nm uzun geçiş filtresi ile, 40X büyütmede floresan görüntüleri elde edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2A, APS ilave edilmeden önce polimerizasyon işlemi, örneğin, başlangıcında Reaksiyon setup yakalar. Misel oluşumu misel arayüzü süreç PANI sentezi meydana reaksiyonda ilk adımdır. Şekil 2B, 5 dakika sonra süt bir çözümü göstermektedir. APS Reaksiyon ilave edildikten sonra 30 dakika hafif kahverengi bir renge dönüşür. Şekil 2C oligomerler oluşumu ile bağlantılı bir renk değişikliği gösterir. Şekil 2B, uygun...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleik asitlerin bir PANI tabanlı sensör DNA ve RNA ile etkileşime girmesi için, su içinde polimerin çözünür hale gerektirir. Su içinde PANI dispersiyon, daha önce rapor edildiği gibi 8 miseller oluşturan, yüzey aktif maddeler kullanılarak gerçekleştirilir. 4-sülfoftalik asit dodesil ester gibi diğer anyonik yüzey aktif maddeler Burada kullanılan NaDBS ek olarak, nonil fenol etoksilat veya setiltrimetil amonyum bromür katyonik yüzey iyonik olmayan yüzey aktif maddeler de işlenebilir PANI 9,10 sent...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Güney Mississippi Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Koleji ve Mississippi Bilim ve Teknoloji Koleji ve Mississippi INBRE programı (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Ödül Numarası P204M103476) tarafından desteklendi.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anilin Fisher Bilimsel A7401-500 ACS, sıvı, soğutmalı
Amonyum peroksidisülfatFisher Scientific A682-500 ACS, kristal
Sodyum dodesilbenzen sülfonatPfaltz & Bauer D56340 ve nbsp;%95 katı
KloroformFisher Scientific MCX 10601 sıvı
DNA primerleriMWG operonn/aözel DNA dizisi ~20  bps
Mikroplaka ABD Bilimsel 1402-9800 96 peki, kloroforma reaktif olmadığı için polipropilen
Mikroplaka Yapışkan FilmUSA Scientific 2920-0000 Kuyudan kuyuya kontaminasyonu, numune dökülmesini ve buharlaşmayı azaltır
Mikroskop Kapağı CamFisher Scientific 12-544-D UV ışınlı kapak camı üzerine PANI kaplı
UV çapraz bağlayıcı ve nbsp;UVP HL-2000 ve nbsp;Enerji: X100 & mu; J/cm2; Süre: 2 dk
Hibridizasyon FırınıVWR01014705 TSıcaklık: 400  ° C; 15 dakika boyunca sallanan
Cam Aparatı Fisher Scientific Reaksiyoniçin üç boyunlu yuvarlak tabanlı şişe; Bırakma hunisi, tıpalar, kondansatör, ayırma hunisi
MikroskopLeica Microsystems Leica IMC S80Büyütme 20X; Sahte renk 536 nm; Pozlama 86 msn; 1.0x kazanç; Gamma 1.6
Mikroplaka OkuyucuMoleküler Cihazlar 89429-536

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
  2. Rahman, M. M., Li, X. B., Lopa, N. S., Ahn, S. J., Lee, J. J. Electrochemical DNA hybridization sensors based on conducting polymers. Sensors (Basel). 15 (2), 3801-3829 (2015).
  3. Sengupta, P. P., et al. Utilizing Intrinsic Properties of Polyaniline to Detect Nucleic Acid Hybridization through UV-Enhanced Electrostatic Interaction. Biomacromolecules. 16 (10), 3217-3225 (2015).
  4. Song, E., Choi, J. -W. Conducting Polyaniline Nanowire and Its Applications in Chemiresistive Sensing. Nanomaterials. 3 (3), 498(2013).
  5. Liu, S., et al. Polyaniline nanofibres for fluorescent nucleic acid detection. Nanoscale. 3 (3), 967-969 (2011).
  6. Oliveira Brett, A. M., Chiorcea, A. -M. Atomic Force Microscopy of DNA Immobilized onto a Highly Oriented Pyrolytic Graphite Electrode Surface. Langmuir. 19 (9), 3830-3839 (2003).
  7. Zhang, Y., et al. Poly(m-Phenylenediamine) Nanospheres and Nanorods: Selective Synthesis and Their Application for Multiplex Nucleic Acid Detection. PLoS ONE. 6 (6), e20569(2011).
  8. Namgoong, H., Woo, D. J., Lee, S. -H. Micro-chemical structure of polyaniline synthesized by self-stabilized dispersion polymerization. Macromol Res. 15 (7), 633-639 (2007).
  9. John, A., Palaniappan, S., Djurado, D., Pron, A. One-step preparation of solution processable conducting polyaniline by inverted emulsion polymerization using didecyl ester of 4-sulfophthalic acid as multifunctional dopant. J Polym Sci A: Polym Chem. 46 (3), 1051-1057 (2008).
  10. El-Dib, F. I., Sayed, W. M., Ahmed, S. M., Elkodary, M. Synthesis of polyaniline nanostructures in micellar solutions. J Appl Polym Sci. 124 (4), 3200-3207 (2012).
  11. Tsotcheva, D., Tsanov, T., Terlemezyan, L., Vassilev, S. Structural Investigations of Polyaniline Prepared in the Presence of Dodecylbenzenesulfonic Acid. J Therm Anal Calorim. 63 (1), 133-141 (2001).
  12. Jia, W., et al. Polyaniline-DBSA/organophilic clay nanocomposites: synthesis and characterization. Synthetic Met. 128 (1), 115-120 (2002).
  13. Kim, B. -J., Oh, S. -G., Han, M. -G., Im, S. -S. Preparation of Polyaniline Nanoparticles in Micellar Solutions as Polymerization Medium. Langmuir. 16 (14), 5841-5845 (2000).
  14. Scales, C. W., et al. Corona-Stabilized Interpolyelectrolyte Complexes of siRNA with Nonimmunogenic, Hydrophilic/Cationic Block Copolymers Prepared by Aqueous RAFT Polymerization†. Macromolecules. 39 (20), 6871-6881 (2006).
  15. Kadashchuk, A., et al. Localized trions in conjugated polymers. Phys Rev B. 76 (23), 235205(2007).
  16. Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array. Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).
  17. Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization. Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Polianilin Sens rN kleik Asit TespitiEtiketsiz Biyosens rDNA Prob Hibritle mesiFloresans l mUV apraz Ba lamaPolimer SenteziN kleik Asit Hibritle mesiFloresans MikroskobuSantrif jleme Y kamas

İlgili makaleler