Yöntem makalesi

Akış Sitometrisi ile Sıçan Böbrek gelen Makrofagların Fenotipik Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/54599

⸱

18 Ekim 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda fenotipik ve flow sitometri ile sıçan böbreklerden yerleşik makrofajlar kantitatif analizi için ayrıntılı bir protokol açıklar. Elde edilen lekeli hücreler aynı zamanda, böylece deneysel modelinde elde edilen bilgileri, artan hücre sıralama, gen ekspresyon analizi veya fonksiyonel çalışmalar dahil olmak üzere, başka uygulamalar için de kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbrek hastalığının gelişiminde ve ilerlemesinde inflamasyonun ve buna bağlı olarak makrofajların önemli rolünü gösteren kanıtlar artmaktadır. Makrofajlar, böbrek hasarında rol oynayan heterojen hücrelerdir. Makrofajlar iki farklı fenotipe ayrılabilir: proinflamatuar sitokinleri serbest bırakan ve fibrozu teşvik eden klasik olarak aktive edilmiş makrofajlar (M1 makrofajları); ve alternatif olarak immün düzenleyici ve doku yeniden şekillenme işlevleriyle ilişkili aktive edilmiş makrofajlar (M2 makrofajları). Bu makrofaj fenotiplerinin böbrek hasarına katkılarını belirlemek için ayırt edilmesi ve analiz edilmesi gerekir. Bununla birlikte, özellikle sıçanlarda, inflamatuar böbrek hastalığı modellerinde makrofaj alt tipleri hakkında tutarlı fenotipik ve fonksiyonel bilgiler bildiren az sayıda çalışma vardır. Bu gerçek, farelerin aksine, sıçanlarda kullanılan sınırlı makrofaj belirteçleri ile ilgili olabilir. Bu nedenle, bu sızan hücrelerin böbrek içeriğini güvenilir bir şekilde ölçmek ve karakterize etmek için yeni stratejiler gereklidir. Bu el yazması, böbrek sindirimi için bir protokolü ve akış sitometrisi ile sıçan böbreklerinden makrofajların daha fazla fenotipik ve kantitatif analizini detaylandırmaktadır. Kısaca böbrekler kollajenaz ile inkübe edildi ve canlı hücrelerde CD45 (lökositlerin ortak antijeni) ve CD68 (PAN makrofaj belirteci) ikili varlığına göre total makrofajlar tanımlandı. Bunu CD86 (M1 markörü) ve CD163'ün (M2 markörü) yüzey boyaması izledi. Sıçan peritoneal makrofajları, akım sitometrisi ile makrofaj belirteci tespiti için pozitif kontrol olarak kullanıldı. Protokolümüz düşük hücresel mortalite ile sonuçlandı ve farklı hücre içi ve yüzey protein belirteçlerinin karakterizasyonuna izin verdi, böylece diğer protokollerde gözlenen hücresel bütünlük kaybını sınırladı. Ayrıca, bu prosedür, diğerlerinin yanı sıra hücre sıralama ve mRNA veya protein ekspresyonu çalışmaları da dahil olmak üzere daha ileri teknikler için makrofajların kullanılmasına izin verir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böbrek hastalığı, prevalansı artmış, yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili küresel bir sağlık sorunudur1. Böbrek hasarının ilerlemesi ve gelişmesinde rol oynayan en önemli mekanizmalardan biri, esas olarak makrofajlar tarafından tetiklenen iltihaplanmadır. Makrofajlar, böbrek bozuklukları da dahil olmak üzere birçok enflamatuar hastalıkta çok önemli bir rol oynar2. Bu nedenle, akut böbrek hasarı (ABH) veya kronik böbrek hastalığı (KBH) olan hastalardan alınan biyopsilerde yüksek oranda sızan makrofaj varlığı bildirilmiştir3,4. Son çalışmalar, böbrek hastalığının uzun vadeli sonucunun makrofajlar tarafından kontrol edilebileceğini düşündürmektedir5,6. Yerel mikro çevreye yanıt olarak, makrofajlar çeşitli biyolojik işlevler oynayan farklı fenotiplere farklılaşabilir7. İki iyi farklılaşmış makrofaj fenotipi belirlenmiştir: klasik olarak aktive edilmiş makrofajlar (M1 makrofajlar) ve alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlar (M2)8. M1 makrofajları iltihabı teşvik ederken, M2 makrofajları anti-enflamatuar bir role sahiptir ve doku onarımında rol oynar9. Bu nedenle, makrofaj heterojenliğinin daha iyi bilinmesi, bunların düzenlenmesini ve renal patolojiye katkısını anlamak ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gereklidir.

Hem fare hem de sıçan modelleri, böbrek hasarında rol oynayan moleküler ve hücresel mekanizmayı anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır10. Bununla birlikte, bu kemirgenler arasındaki makrofaj fenotiplerini tanımlamak için kullanılan çeşitli belirteçlerde önemli farklılıklar vardır. Bu nedenle, sıçanlarda F4/80 veya Ly6C gibi çeşitli fare belirteçleri kullanılmaz, bu nedenle bu türler arasındaki bulguların ekstrapolasyonunu sınırlar. Ayrıca, sıçanlarda makrofaj fenotiplerini tanımlayan sınırlı sayıda belirteç vardır ve bu hayvanlarda farelerle karşılaştırıldığında makrofaj heterojenliğini analiz eden kıt çalışmaları açıklar. Bu nedenle, sıçanlarda böbrek hastalığı modellerinde makrofajların rolünü anlamak için makrofaj alt küme karakterizasyonu için yeni stratejiler gereklidir.

Bu el yazması, sıçan böbreklerinden alınan makrofajların akış sitometrisi ile fenotipik ve kantitatif analizi için bir protokolü açıklamaktadır. Bu tekniği, böbrek hastalığında makrofajların rolünün derinlemesine karakterizasyonuna izin vermek için hücre sınıflandırma ve mRNA veya protein ekspresyon çalışmaları dahil olmak üzere çeşitli testler takip edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol Direktifi Avrupa Parlamentosu 2010/63 / AB ve Ulusal Rehber 53/2013 aşağıdaki yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.

Reaktifler ve Çözümleri 1. Hazırlık

  1. Steril koşullar altında tüm reaktifler ve çözümler hazırlamak ve bir laminar akış başlığı altında kullanınız. 4 ° C'de çözüm tutun.
  2. lekeleme tampon maddesi hazırlanması (% 2 fetal sığır serumu 1x Dulbecco PBS (FBS)).
  3. tuzlu su, her ml kolajenaz 0.5 mg ekleyerek kolajenaz çözeltisi hazırlayın.
  4. ketamin / ksilazin anestezi çözeltisi hazırlayın (2: 1 hac / hac).

2. Böbrek Perfüzyon ve Ekstraksiyon

  1. ketamin / ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu (75 mg / 12 mg / kg ağırlık) göre sıçan anestezisi. Dikkatle hayvan yeterince anestezi olup olmadığını kontrol etmek, cildin küçük bir kat tutam. Ardından, anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için veteriner merhemi gözleri kapsamaktadır. Not: 4-moninci Wistar sıçanları bu deneyde kullanılır.
  2. Sıçan tamamen uyuşturulduktan sonra, bir yatar pozisyonda bir cerrahi masanın üzerine yerleştirin.
  3. karın% 70 etanol uygulayın.
  4. Plevra ve karın boşlukları ortaya çıkarmak için, göğüs kafesine pubis, karın derisi ve periton aracılığıyla merkezi bir kesi yapmak.
  5. Tüm kan böbrekler kaldırılana kadar bir perfüzyon sistemi kullanılarak böbrek serpmek için abdominal aorta içine tuzlu su çözeltisi (% 0.9) enjekte edilir. kan serbest yardım karın düzeyde aort kesin.
  6. Renal hilus (renal ven, arter ve üreter) dan keserek sıçan hem böbrek çıkarın. Böbrek açarlar için dikkatle kapsül 11 ayıran, parmaklarını kullanarak böbrek kenarına basın.
  7. Hanks dengeli tuz çözeltisi içine böbrek yerleştirin.

3. Böbrek Sindirim ve Hücre Süspansiyon

  1. Küçük parçalar halinde makas ile böbrek yarısı kesilmiş ve koyun1.5 ml tüp içine adettir.
    Not: Aşağıdaki tüm konsantrasyonlar 1 numune (1/2 sıçan böbrek) için hesaplanmıştır.
  2. kolajenaz çözeltisi 1 ml ilave edilir ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. kollajenaz çözüm tüm doku kere emin olmak için ters çevirerek her 5 dk karıştırın.
  3. çözelti toplamak ve bir piston yardımıyla bir süzgeç (40 um) üzerinden geçmesi ve lekeleme tampon maddesi, 10 ml içinde tekrar süspansiyon.
  4. 15 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  5. 1 ml ACK (Amonyum Klorür-Potasyum) Parçalama Tampon pelet yeniden askıya. 1 dakika, oda sıcaklığında 30 saniye sonra, reaksiyonu durdurmak için lekeleme tampon maddesi 10 ml ekleyin.
  6. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
  7. Yeniden askıya tamponu (1 mi) boyama yeterli hacimde pelet ve bir süzgeç (30 um) kullanılarak hücre süspansiyonu filtre edin.
  8. Bir hemasitometre tripan mavisi dışlama kullanarak hücrelerin sayısını ve sta için 1.5 ml tüp 2 milyon hücre eklemekadencilik.

4. Hücre Boyama ve Sitometrisi Analizi

  1. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüje hücreleri.
  2. Fc reseptörleri bloke etmek için 4 ° C'de 10 dakika süre ile: yeniden askıya sıçan serumu, 100 ul pelet (100 1 seyreltilmiş).
  3. 5 dakika boyunca boyama tamponu ve santrifüj 100 xg 1 ml ekleyerek yıkayın.
  4. canlı hücreler (: 1000 3) tespit etmek için ve çözelti, CD45 APC-Cy7 (1: 100), CD163 A647 (100 4) her bir durum için lekeleme tampon maddesi 100 ul hücre yüzeyi boyama için antikorlar karıştırın.
  5. karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika süre ile, antikor karışımı hücre pelletini yeniden askıya.
  6. 5 dakika boyunca 100 x g'de lekeleme tampon maddesi ve santrifüj 1 ml ekleyerek yıkayın. bu adımı yineleyin.
  7. karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika için tespit / Permeabilization çözeltisi 600 ul ekle.
  8. 5 dakika boyunca 170 x g'de 1 mi Permeabilization / Yıkama tamponu ve santrifüj ile 2 kez yıkanır.
  9. intracel için iyi: CD68 FITC antikoru (1.000 35) eklemeHer bir durum için Permeabilization / Yıkama tamponu, 100 ul lular boyama.
  10. CD68 antikor çözeltisi pelet yeniden askıya ve karanlıkta 4 ° C'de 50 dakika inkübe edilir.
  11. 5 dakika boyunca 170 x g'de 1 mi Permeabilization / Yıkama tamponu ve santrifüj ile yıkanır.
  12. , Permeabilization / Yıkama tamponu 100 ul pelet yeniden askıya CD86PE antikoru (35: 1000) ekleyin ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin.
  13. 5 dakika boyunca 100 x g'de tampon ve santrifüj Permeabilization / Wash 1 ml ekleyerek yıkayın.
  14. Permeabilization / Yıkama tampon 100 ul pelet yeniden askıya ve tüpün sitometri akışı geçmek.
  15. flow sitometri ile örnekleri analiz edin. Yan-dağınık ışık / ileri-dağınık ışık (SSC / FSC) penceresi kapılı canlı hücrelerde CD45 boyanma belirleyin. İkinci bir aşamada, CD68 + hücrelerinde CD86 ve CD163 ifadesini analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz böbrekteki makrofajlar infiltre artan varlığı ile ilişkili renal hasar inflamatuar deneysel modelinde makrofaj heterojenite analiz. Daha önce belirtildiği gibi 12 Bu modelde, böbrek hasarı, Wistar sıçanlarının 3 hafta için içme suyu aldosteronun (1 mg -1 kg-1 gün) artı tuz (NaCl,% 1), ilaç olarak verilmesi ile indüklenmiştir.

Deneylerimizde çizelgesi, Şekil 1 'de gösterilmi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makrofajlar, renal bozukluklar da dahil olmak üzere, farklı enflamatuar hastalıkların, önemli bir rol oynamaktadır, heterojen hücrelerdir. Her makrofaj ICSI'nin glomerülonefrit, diyabetik nefropati ve böbrek kanseri 14-16 belirtildiği gibi, böbrek hasarı gelişmesine farklı bir şekilde katkıda çünkü böbrek hastalığı makrofajlar alt gruplarının karakterizasyonu artan bir ilgi vardır. Akut böbrek hasarı erken evrelerinde, M1 makrofajlar bir üstünlüğü tübüler nekroz ve inflamasyon teşvik görülmektedir. Bununl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, FIS/FEDER (Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 ve PI14/00883), İspanyol Ateroskleroz Derneği, İspanyol Nefroloji Derneği ve Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) tarafından Juan Antonio Moreno'ya verilen hibelerle desteklenmiştir. FIS/FEDER, PI14/00386 ve Instituto Reina Sofia de Investigaciòn Nefrològica'yı Jesús Egido'ya finanse ediyor. Fundaciòn Conchita Rabago'dan Melania Guerrero Hue'ya. Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) to Alfonso Rubio Navarro.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Laminer akış başlığıDaha hızlıveya eşdeğer ekipman
SantrifüjHettichVeya eşdeğer ekipman
Akış sitometresi (FACSAria)BD Biosciences
Fetal sığır serumuBioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
KollajenazSigma-Aldrich12/1/9001
ACK Lysing TamponThermo Fisher ScientificA10492-01
Akış sitometrisi süzgeçleriBD Biosciences340626
Falcon hücre süzgeçleriThermo Fisher Scientific352340
Akış sitometri tüpleriFalcon3520525 ml Polistiren Yuvarlak Tabanlı
Tüp Santrifüj tüpleriCorning centristar430791
Su banyosuMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 & # 176; C
Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözeltisi veya Geçirgenleştirme/Yıkama TamponuBD Biosciences554714
Rompum (Ksilazin)BayerVeya eşdeğeri
Ketalar (Ketamin)PfizerVeya eşdeğeri
Hanks'in dengeli tuz çözeltisiSigma-AldrichH8264-500ML
Tuzlu su çözeltisiBraun
Anti-CD45 (klon: OX-1) APC-Cy7Biolegend202216Seyreltilmiş 1:100
Anti-CD68 (klon: ED1) FITCBio-RADMCA341FSeyreltilmiş 35:1.000
anti-CD86 (klon: 24F) PEBiolegend200307Seyreltilmiş 35:1.000
anti-CD163 (klon: ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342RSeyreltilmiş 4:100
Canlı/ölü leke Moleküler ProblarL34955Seyreltilmiş 3: 1.000
622415

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Ortiz, A., et al. Translational value of animal models of kidney failure. Eur. J. Pharmacol. 759, 205-220 (2015).
  11. Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of double negative alphabeta T cells from the. J. Vis. Exp. , (2014).
  12. Martin-Fernandez, B., et al. Aldosterone Induces Renal Fibrosis and Inflammatory M1-Macrophage Subtype via Mineralocorticoid Receptor in Rats. PLoS. One. 11, e0145946(2016).
  13. Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. J. Vis. Exp. (e52749), (2015).
  14. Komohara, Y., et al. Macrophage infiltration and its prognostic relevance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Sci. 102, 1424-1431 (2011).
  15. Han, Y., Ma, F. Y., Tesch, G. H., Manthey, C. L., Nikolic-Paterson, D. J. Role of macrophages in the fibrotic phase of rat crescentic glomerulonephritis. Am. J. Physiol Renal Physiol. 304, F1043-F1053 (2013).
  16. Ndisang, J. F. Role of the heme oxygenase-adiponectin-atrial natriuretic peptide axis in renal function. Curr. Pharm. Des. 21, 4380-4391 (2015).
  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Makrofaj FenotiplemeB brek SindirimiCD45 CD68 BoyamaCD86 CD163 Mark rleriS an B brek MakrofajlarM1 M2 S n fland rmasH cre Y zeyi BoyamaPeritoneal Makrofaj KontrolRenal nflamasyon Analizi

İlgili makaleler